专利名称：一种鹅用复合益生菌制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于微生物饲料添加剂领域，涉及ー种鹅用复合益生菌制剂及其制备方法。
背景技术：
目前，抗生素在动物产品和环境中造成残留问题日益受到人们的重视。为了从根本上把抗生素从配合饲料中清除出去，世界各国的相关领域科学工作者都在探索抗生素的替代品，カ图找到ー种无停药期，无污染，无残留，无毒副作用，安全的新型饲料添加剤。微 生态制剂正是在这种情况下被应用在饲料添加剂中的。光辉的抗生素时代之后，将是ー个崭新的微生态制剂时代。近年来，微生态制剂的开发和应用对促进我国畜牧业的发展已发挥了积极的作用，且潜カ很大。它不仅具有营养保健作用，而且还避免了抗菌药物等兽药在动物体内的残留，也是ー类緑色环保产品。活菌微生态制剂可分为单ー制剂和复合制剂，依微生物的种类有乳酸菌制剂、酵母菌制剂、芽孢杆菌制剂及光合细菌制剂等。目前，动物用微生态制剂的生产方式有两种液态发酵和固态发酵。液态发酵易实现纯种培养，产品浓度高，但能耗高；固体发酵能耗低，产率较高，但劳动强度大。我国固态发酵历史悠久，但大多应用于醋和酒的发酵生产。固态发酵技术在饲料行业的应用，是在最近几年才发展起来的，且エ艺不是很复杂，较容易应用，但目前推广不好，主要存在几个问题有待解决一方面，目前微生态制剂大多都停留在単一菌种的研究，复合菌制剂很少，应用效果欠佳；另一方面，已有的微生态制剂多用エ业原料制备，很少有利用饲料原料做载体，且优化制备条件，即调制原料和发酵条件过程还不成熟，不能达到提高微生态制剂稳定性和活菌数量的目的。不同的微生态制剂，其作用机理、途径、解决的问题各不相同。生产“绿色”的畜牧产品，依靠单ー菌种制备的微生态制剂很难完全实现，选择几种菌种，优化条件，联合配伍，才能取得较好的效果。目前，微生态制剂已经广泛应用于家禽饲养中，对提高产蛋率、提高生长速度效果明显，但是多为单ー菌剂，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus, acidophilus)、产瓶假丝酵母(Candidautilis)都为单ー菌剂，具有促进消化、增强肠道蠕动等功能，但目前尚未将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus, acidophilus)、产瓶假丝酵母(Candidautilis)作为复合菌剂的报道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种鹅用复合益生菌制剂，解决目前鹅用的益生菌添加剂多为单ー菌剂，作用比较单一，无法使家禽的各项生理机能得到综合改善的问题。本发明的另一目的是提供了上述鹅用复合益生菌制剂的制备方法。本发明通过以下技术方案来实现一、一种鹅用复合益生菌制剂，该制剂由蜡样芽孢杆菌ATCC 11778固体培养物、嗜酸乳杆菌ATCC 4356固体培养物、产朊假丝酵母ATCC 22023固体培养物按照重量比为I : I : I构成，其中，蜡样芽孢杆菌固体培养物中的活菌数为2. 5X10ncfu/g，嗜酸乳杆菌固体培养物中的活菌数为3.7X101(lCfU/g、产朊假丝酵母固体培养物中的活菌数为I. 05X1010cfu/go该制剂按照1% (w/w)的添加量添加到鹅饲料中，使饲料中总益生菌活菌数达到108cfu/g 以上。ニ、一种鹅用复合益生菌制剂的制备方法，将蜡样芽孢杆菌ATCC 11778、嗜酸乳杆菌ATCC 4356、产朊假丝酵母ATCC 22023分别经过活化培养、一级培养、ニ级扩大培养、固体发酵四个步骤分别得到固体培养物，然后将蜡样芽孢杆菌ATCC 11778固体培养物、嗜酸乳杆菌ATCC 4356固体培养物、产朊假丝酵母ATCC 22023固体培养物按比例混合制备而成； 其中，固体发酵步骤中蜡样芽孢杆菌ATCC 11778的固体发酵培养基配方按照重量比为米糠 57. 45%,玉米面 7. 5%,豆柏 7. 5%, DDGS (Distillers Dried Grains withSolubles，玉米干酒糟，简称为DDGS)22. 5%，稻壳5%，硫酸镁O. 05% ;固体发酵条件是发酵温度37°C，厚度31cm，发酵初始pH 7. 5，料水比I. 2 I (w/w)，发酵料接种量6% (w/w)，发酵时间为72h ；固体发酵步骤中嗜酸乳杆菌ATCC 4356的固体发酵培养基配方按照重量比为米糠48. 875%、玉米10%、豆柏20%、DDGS 20%、柠檬酸ニ铵O. 1%、こ酸钠1%，硫酸镁O. 025% ;固体发酵条件是发酵温度31°C，发酵料厚度35cm，发酵料初始pH值6. 5，料水比为I. 4 I(w/w),发酵料接种量8% (w/w),发酵时间为60h ；固体发酵步骤中产朊假丝酵母ATCC 22023的固体发酵培养基配方按照重量比为米糠42. 4%，玉米粉15%，稻壳5%，豆柏粉15%，DDGS 22. 5%，磷酸ニ氢钾O. 1% ;固体发酵条件是发酵温度33°C，发酵料厚度25cm，发酵料初始pH值5. 5，料水比为I : I (w/w)，发酵料接种量4% (w/w)，发酵时间为72h。采用上述技术方案的积极效果本发明将蜡样芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、产朊假丝酵母三种菌的固体培养物按比例联合应用，可以显著提高仔鹅日增重、促进免疫器官(法氏囊、胸腺、脾脏)的发育、提高免疫力、促进机体产生血清白蛋白和球蛋白、降低仔鹅盲肠PH值、促进盲肠有益菌群生长，综合提高鹅的各项生理指标；本发明还利用饲料原料用于固体培养基的原料，天然无污染，改变了现有技术中多用エ业原料制备固体发酵培养基的现状，另外对固体发酵的条件进行了进ー步优化，使得该方法可以大大提高微生态制剂的稳定性以及活菌数。
具体实施例方式本发明中使用的生物材料的来源说明腊样芽抱杆菌(Bacilluscereus) ATCC 11778、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus,acidophilus) ATCC 4356、产朊假丝酵母(Candida utilis) ATCC 22023 均购自黑龙江省科学院微生物研究所。在本发明中，Cfu为细菌菌落数。下面通过实施例、试验例对本发明做进ー步说明，但不应理解为对本发明的限制实施例I蜡样芽孢杆菌ATCC 11778固体培养物的制备I、菌种活化将蜡样芽孢杆菌ATCC 11778转接到牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基(配方)，30°C培养24h,备用。2、一级培养将活化的斜面菌种，每管分别加入IOml的无菌水稀释成悬浊液，转接到装有IOOml营养肉汤培养基(配方)的250ml的三角瓶中，置摇床中，30°C、130rpm振荡培养24h。
3、ニ级扩大培养分别取IOml —级种子液，接入盛有115ml营养肉汤培养基(配方)的250ml的三角瓶中，置摇床中，30°C，130rpm摇床振荡培养24h。4、固体发酵按照重量比为米糠57. 45%，玉米面7. 5%，豆柏7. 5%，DDGS 22. 5%，稻壳5%，硫酸镁O. 05%的配方配制发酵原料，混合均匀后，放于灭菌锅121°C高压灭菌30min，按料水比I. 2 : I (w/w)加入无菌水,发酵物料的厚度31cm,加入6% (w/w)的ニ级种子液混合均勻，放入37°C恒温培养箱开始发酵，发酵初始pH 7. 5，发酵72h，45°C低温烘干即得蜡样芽孢杆菌固体培养物。用平板计数法测定活菌数为2. 5X 10ncfU/g。其中，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的配制营养肉汤10g，牛肉膏2g，蛋白胨2g，NaCl
O.5g，琼脂粉5g，水200ml，pH 7. O 7. 2。在烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl和琼脂粉，加热溶化后，调节PH值至7. O 7. 2。分装，加棉塞，高压蒸汽灭菌即成。营养肉汤培养基的配制营养肉汤IOgJK 200ml，pH 7. O 7. 2。在烧杯中加水，将营养肉汤培养基加热溶化后，调节pH值至7. O 7. 2。分装，加棉塞，高压蒸汽灭菌即成。实施例2嗜酸乳杆菌ATCC 4356固体培养物的制备I、菌种活化将嗜酸乳杆菌ATCC 4356转接到MRS琼脂斜面培养基(配方)，30°C厌氧培养箱培养24h,备用。2、一级培养将活化的斜面菌种，每管分别加入IOml的无菌水稀释成悬浊液，转接到装有IOOml营养肉汤培养基(配方)的250ml的三角瓶中，置厌氧摇床中，30°C、130rpm振荡培养24h。3、ニ级扩大培养分别取IOml —级种子液，接入盛有115ml MRS培养基(配方)的250ml的三角瓶中，置厌氧摇床中，300C，130rpm摇床振荡培养24h。4、固体发酵按照重量比为米糠48. 875%、玉米10%、豆柏20%、DDGS 20%、柠檬酸ニ铵O. 1%、こ酸钠1%，硫酸镁O. 025%的配方配制发酵原料，混合均匀后，放于灭菌锅121°C高压灭菌30min，按料水比I. 4 I (w/w)加入无菌水,发酵物料的厚度35cm,加入8% (w/w)的ニ级种子液混合均匀，放入31°C恒温培养箱开始发酵，发酵初始pH 6. 5，发酵60h，45°C低温烘干即得蜡样芽孢杆菌固体培养物。用平板计数法测定活菌数为3. 7X lO'fu/g。其中，营养肉汤培养基的配制营养肉汤IOgJK 200ml，pH 7. O 7. 2。在烧杯中加水，将营养肉汤培养基加热溶化后，调节pH值至7. O 7. 2。分装，加棉塞，高压蒸汽灭菌即成。MRS培养基的配制胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸铵2g，葡萄糖20g，磷酸ニ氢钾2g，こ酸钠5g，吐温_801g，硫酸镁O. 5g，硫酸锰O. 2g，琼脂20g蒸馏水IOOOmL, pH 6 6. 5。实施例3产朊假丝酵母ATCC 22023固体培养物的制备I、菌种活化将产朊假丝酵母ATCC 22023转接到PDA琼脂斜面培养基(配方)，30°C培养24h，备用。2、一级培养 将活化的斜面菌种，每管分别加入IOml的无菌水稀释成悬浊液，转接到装有IOOml营养肉汤培养基(配方)的250ml的三角瓶中，置摇床中，30°C、130rpm振荡培养24h。3、ニ级扩大培养分别取IOml —级种子液，接入盛有115ml PDA培养基(配方)的250ml的三角瓶中，置摇床中，300C，160rpm摇床振荡培养24h。4、固体发酵按照重量比为米糠42. 4%，玉米粉15%，稻壳5%，豆柏粉15%，DDGS 22. 5%，磷酸ニ氢钾O. 1%的配方配制发酵原料，混合均匀后，放于灭菌锅121°C高压灭菌30min，按料水比I : I (w/w)加入无菌水,发酵物料的厚度25cm,加入4% (w/w)的ニ级种子液混合均勻,放入37°C恒温培养箱开始发酵，发酵初始pH 5. 5，发酵72h，45°C低温烘干即得蜡样芽孢杆菌固体培养物。用平板计数法测定活菌数为l.osxio'fu/g。其中，营养肉汤培养基的配制营养肉汤IOgJK 200ml，pH 7. O 7. 2。在烧杯中加水，将营养肉汤培养基加热溶化后，调节PH值至7. O 7. 2。分装，加棉塞，高压蒸汽灭菌即成。PDA培养基的配制马铃薯200g去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，滤液加鹿糖20g,琼脂粉18g,加水至1000mL。实施例4鹅用复合益生菌制剂的制备将实施例I、实施例2、实施例3制备的蜡样芽孢杆菌ATCC 11778固体培养物、嗜酸乳杆菌ATCC 4356固体培养物、产朊假丝酵母ATCC 22023固体培养物按照重量比为1:1: I混合即可。使用时，该制剂按照l%(w/w)的添加量添加到鹅饲料中，使饲料中总益生菌活菌数达到108cfu/g以上即可。试验例I鹅用复合益生菌制剂对仔鹅生长性能的影响I、试验设计与分组试验鹅品种，为莱X (莱X籽)杂种鹅，由为大庆种鹅基地提供。选取I日龄仔鹅210只，按性别和体重随机分成5组，每组3个重复，每重复14只鹅，公母各半。试验从I日龄开始，28日龄结束。对照组基础日粮；试验组I :基础日粮+蜡样芽孢杆菌；试验组II :基础日粮+嗜酸乳酸杆菌；
试验组III:基础日粮+产朊假丝酵母菌；试验组IV :基础日粮+蜡样芽孢杆菌、嗜酸乳酸杆菌和产朊假丝酵母菌复合菌。2、测定指标分别在试验开始后第2周末和第4周末，称量各组仔鹅空腹4小时体重，并根据以下公式计算各组仔鹅的采食量、日增重及料重比。平均日采食量ADFI (g)=总采食量バ试验天数X鹅羽数)平均日增重ADG (g)=总增重/ (试验天数X鹅羽数)耗料增重比FCR=平均日采食量/平均日增重3、试验结果 鹅用复合益生菌制剂对仔鹅生长性能的影响结果如表I所示。由表I可以看出，在整个试验期，各试验组与对照组相比平均日采食量之间差异不显著。在初始的I 2周，试验组的日增重较对照组都有増加趋势，其中试验组IV与其他四组相比，显著增加仔鹅的日增重(p〈0. 05);在试验的3 4周，菌制剂体现出了较好的促生长效果，各单菌制剂组仔鹅日增重较对照组分别増加了 4. 41%，7. 29%,6. 30%，而复合菌制剂试验组IV表现尤为突出，显著提高仔鹅日增重14. 81% (p〈0.05)。整个试验期来看，对雏鹅日增重影响最大的是试验组IV(p〈0. 05)，较对照组增加了 10. 16%，其它试验组也较对照组增加了 5%左右。在试验开始的I 2周，添加菌制剂的各试验组的料重比均低于对照组，分别降低了 4. 29%，5. 71%，4. 29%，7. 86%，其中复合菌制剂试验组IV较对照组差异显著(p〈0. 05)，各试验组之间差异不显著。在试验的3 4周，各试验组的料重比也都低于对照组，降低3. 83%，6. 56%，7. 65%，12. 57%，其中试验组IV显著低于对照组(p〈0. 05)。整个试验期，添加复合菌制剂各试验组与对照组相比，均能显著降低料重比(P〈0. 05)，分别降低4. 73%，7. 1%，
7.1%，10. 06%，且试验组IV在整个试验期对仔鹅生长性能影响最大。表I菌制剂对雏鹅生长性能的影响
权利要求
1.一种鹅用复合益生菌制剂，其特征在于该制剂由蜡样芽孢杆菌ATCC 11778固体培养物、嗜酸乳杆菌ATCC 4356固体培养物、产朊假丝酵母ATCC 22023固体培养物按照重量比为I : I : I构成，其中，蜡样芽孢杆菌ATCC 11778固体培养物中的活菌数为.2.5X10ncfu/g,嗜酸乳杆菌ATCC 4356固体培养物中的活菌数为3. 7 X 101Qcfu/g、产朊假丝酵母ATCC 22023固体培养物中的活菌数为I. 05X 101Qcfu/g。
2.根据权利要求I所述的鹅用复合益生菌制剂，其特征在于该制剂按照1%(w/w)的添加量添加到鹅饲料中，使饲料中总益生菌活菌数达到108cfu/g以上。
3.一种鹅用复合益生菌制剂的制备方法，其特征在于将蜡样芽孢杆菌ATCC11778、嗜酸乳杆菌ATCC 4356、产朊假丝酵母ATCC 22023分别经过活化培养、一级培养、二级扩大培养、固体发酵四个步骤分别得到固体培养物，然后将蜡样芽孢杆菌ATCC 11778固体培养物、嗜酸乳杆菌ATCC 4356固体培养物、产朊假丝酵母ATCC22023固体培养物按比例混合制备而成； 其中，固体发酵步骤中蜡样芽孢杆菌ATCC 11778的固体发酵培养基配方按照重量比为米糠57. 45%，玉米面7. 5%，豆柏7. 5%，DDGS 22. 5%，稻壳5%，硫酸镁O. 05% ;固体发酵条件是发酵温度37°C，厚度31cm，发酵初始pH 7. 5，料水比I. 2 I (w/w),发酵料接种量6%(w/w),发酵时间为72h ； 固体发酵步骤中嗜酸乳杆菌ATCC 4356的固体发酵培养基配方按照重量比为米糠.48. 875%、玉米10%、豆柏20%、DDGS 20%、柠檬酸二铵O. 1%、乙酸钠1%，硫酸镁O. 025% ;固体发酵条件是发酵温度31 °C，发酵料厚度35cm，发酵料初始pH值6. 5，料水比为I. 4 I (w/w),发酵料接种量8% (w/w),发酵时间为60h ； 固体发酵步骤中产朊假丝酵母ATCC 22023的固体发酵培养基配方按照重量比为米糠.42. 4%，玉米粉15%，稻壳5%，豆柏粉15%，DDGS 22. 5%，磷酸二氢钾O. 1% ;固体发酵条件是发酵温度33°C，发酵料厚度25cm，发酵料初始pH值5. 5，料水比为I : I (w/w)，发酵料接种量4% (w/w)，发酵时间为72h。
全文摘要
本发明提供了一种鹅用复合益生菌制剂，由蜡样芽孢杆菌ATCC 11778固体培养物、嗜酸乳杆菌ATCC 4356固体培养物、产朊假丝酵母ATCC 22023固体培养物按照重量比为1∶1∶1构成，其中，蜡样芽孢杆菌固体培养物中的活菌数为2.5×1011cfu/g，嗜酸乳杆菌固体培养物中的活菌数为3.7×1010cfu/g、产朊假丝酵母固体培养物中的活菌数为1.05×1010cfu/g。本发明还提供了鹅用复合益生菌制剂的制备方法。本发明为复合菌剂，可以显著提高提高鹅的各项生理指标；另外对固体发酵的条件进行了进一步优化，使得该方法可以大大提高微生态制剂的稳定性以及活菌数。
文档编号C12R1/72GK102669432SQ20121017750
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者庞晖, 王秋菊, 许丽, 金慧然 申请人:东北农业大学, 黑龙江八一农垦大学