专利名称：斑马鱼肿瘤坏死因子14的基因及其克隆方法和重组应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及肿瘤坏死因子14 (TNFSF14或LIGHT)cDNA及其克隆、表达及蛋白纯化技术。
背景技术：
肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员具有促进细胞生长、分化或死亡的功能，在淋巴器官的形成，免疫细胞的激活及维持机体的稳态方面发挥重要的生物学作用。近年来，很多具有重要功能的TNFSF被发现，LIGHT是肿瘤坏死因子家族第14个成员(TNFSF14)，LIGHT通过与其3个不同的受体TR2 / HVEM、LTBR、及TR6结合可发挥不同的生物学作用。它可诱导部分肿瘤细胞的凋亡，并能通过CD28非依赖的途径共刺激T淋巴细胞，促进其生长分化和细胞因子的分泌。LIGHT还具有活化和诱导DC成熟的功能。在机体的自身免疫、肿瘤免疫及某些疾病的发生、发展中都起到重要的参与作用，越来越多的研究表明，LIGHT 在自身免疫病、移植物抗宿主病及抗肿瘤免疫中发挥重要的调节作用。自1997年LIGHT基因被发现以来，对于LIGHT基因克隆表达以及功能的研究主要集中在人和鼠，目前还没有关于此基因在低等脊椎动物中的研究。鉴于鱼类所处的进化地位以及水产养殖业的高速发展，鱼类免疫系统日益为人所关注。对鱼类免疫系统的研究不仅为高等生物免疫演化途径提供重要的参考，同时也为日趋严重的养殖鱼类的病害防治提供必要的免疫理论与应用基础。鱼类与哺乳动物在免疫器官组成上不同，鱼类没有骨髓和淋巴结，肾脏和脾脏是其主要的免疫器官，因此，我们推测与免疫相关的细胞因子TNF家族的成员在鱼类免疫中有重要作用。斑马鱼(zebrafish)是国际标准化组织认可的5种鱼类实验动物之一，已经成为发育生物学、遗传学、毒理学等研究常用的模式生物。根据GenBanKEMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前人、鼠LIGHT cDNA已被克隆，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，而至今模式生物斑马鱼LIGHT的cDNA还未被克隆出来，关于斑马鱼LIGHT基因(zebrafish LIGHT，简称zLIGHT)的研究在整个国内外还处于完全空白状态。因此，我们对于斑马鱼基因的研究有重要意义。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种从斑马鱼中获得肿瘤坏死因子14 (LIGHT)cDNA，并提供斑马鱼LIGHT (zLIGHT) cDNA的克隆方法及重组技术。本发明所述斑马鱼肿瘤坏死因子14 (LIGHT) cDNA，序列如SEQ ID NO. I所示。本发明的斑马鱼LIGHT cDNA的克隆方法如下
(1)提取斑马鱼脾脏细胞的总RNA，TransgencDNA逆转录试剂盒转录为第一链cDNA ;
(2)根据人、鼠及斑马鱼LIGHT基因的预测序列设计兼并引物
正义寡核苷酸引物zLIGHT-F :5’-ATGGCTTYADGTAACGTGTCV-3’ (SEQ ID NO. 3) 反义寡核苷酸引物zLIGHT-R :5’-TYAAATBATAAACAACCCWAA-3’ (SEQ ID NO. 4)(3)应用RT-PCR方法，以上述zLIGHT-F及zLIGHT-R为引物，扩增出一段cDNA序列，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定。本发明还公开了斑马鱼肿瘤坏死因子14，它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。斑马鱼肿瘤坏死因子LIGHT的cDNA可通过现有基因工程的方法，将该基因的胞外功能区克隆连到pETSUMO质粒中并转到大肠杆菌BL21 (DE3)中原核表达，本发明通过多次预表达摸索出了合适的表达条件，超声破碎后收集上清Ni+亲和纯化，梯度洗脱之后我们得到斑马鱼SUMO-zsLIGHT融合蛋白。并进行Western_blot鉴定。进一步地,公开了一种重组表达载体pSUMO-zsLIGHT,是通过下述方法构建得到根据所述斑马鱼肿瘤坏死因子14的cDNA序列设计引物Al、A2，进行PCR扩增，得到的PCR产物是序列如SEQ ID NO. 7所示的斑马鱼LIGHT基因胞外功能区，将PCR产物割胶回收，回收产物用汾W和历Z^///酶切，pET SUMO载体只用历W///酶切，T4 DNA Ligase连接酶切后的载体和PCR产物，得到pSUMO-zSLIGHT ;所述引物Al、A2序列分别如SEQ ID NO. 4和 SEQ ID NO. 5 所示。在克隆出斑马鱼肿瘤坏死因子14 (LIGHT) cDNA后，可通过基因工程方法，生产重组斑马鱼肿瘤坏死因子14，作为鱼类免疫增强剂。本发明中得到的斑马鱼LIGHT cDNA序列为708bp，比预测序列多出了 75个碱基，与已知的LIGHT序列比对，本发明得到的斑马鱼LIGHT核苷酸序列与人的LIGHT序列相似率为44. 76%，预测序列与人的LIGHT相似率为37. 87%，将该序列放到斑马鱼的基因组序列比对，与人和鼠相同，都含有四个外显子三个内含子，因此确定我们的序列是正确的。多次实验结果比对之后我们确定了斑马鱼全长LIGHT cDNA(708bp, SEQ ID NO. I)序列，其开放阅读框如图I所示。对该基因的进一步研究表明该基因主要表达在鱼类免疫器官中，包括脾脏、肾脏。其中脾脏表达水平较高，肾脏次之；因此我们推测LIGHT基因是斑马鱼体内重要的免疫因子。本发明将推动LIGHT基因或经修饰过的LIGHT基因表达的蛋白在相关鱼类免疫疾病机理中的研究，以斑马鱼作为人类疾病模型研究该蛋白在免疫疾病中的作用。重组LIGHT蛋白有望开发成预防和治疗鱼类免疫疾病的免疫增强剂和免疫佐剂。
图I zLIGHT的cDNA序列及对应的蛋白序列。图2 pSUMO-zsLIGHT表达载体的构建。图3是SDS-PAGE分析SUMO-zsLIGHT在大肠杆菌中的表达其中I重组蛋白非诱导；2重组蛋白诱导20h ；3纯化后蛋白SUMO-zsLIGHT ；4 western blotting鉴定结果。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。
实施例I
斑马鱼购自南京大学模式动物遗传中心。(I)引物设计根据人、鼠及斑马鱼LIGHT基因的预测序列设计兼并引物； zLIGHT-F :5’ -ATGGCTTYADGTAACGTGTCV-3’ (SEQ ID NO. 3),
zLIGHT-R :5’ -TYAAATBATAAACAACCCWAA-3’ (SEQ ID NO. 4)。(2)提取总RNA :应用RNA抽提试剂(TIANGEN)按照其操作手册提取斑马鱼脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。Transgen cDNA逆转录试剂盒转录为第一链cDNA。
(3)RT-PCR :以上述zLIGHT-F及zLIGHT-R为引物进行PCR扩增，得到708bp的片段。①逆转录
在DEPC处理的I. 5ml Eppendorf管中依次加入总RNA抽提物3u I, Oligo d(T) 18(0. 5 u g/ u I) In 1，2 XTS Reaction Mix IOu I，DEPC 水 5 u 1，TransScript RT/RIEnzyme Mix Iul ；42。C 孵育 30min，85。C 加热 5min 失活 TransScript RT。将得到的cDNA分装后-20° C保存。②PCR
利用逆转录所得模板进行PCR,体系为25 ii l,10iimol/L上、下游引物各Iy 1，
2.Smmol /T, dNTP 2 U I, IOXDreamTaq buffer 2. 5 U I, cDNA 模板 I. 5 U I, DreamT^g 酶0. 1，加 ddH20 16. 7u I0 反应程序为94。C 5min, (94。C 30s,58° C 30s,72° Clmin), 30个循环，最后72 ° C延伸lOmin。反应完成后将产物于1%琼脂糖凝胶中电泳分离，用胶回收试剂盒回收得到约708bp的DNA条带，克隆入pMD19-T载体(TaKaRa，Japan)，经含Amp抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转化子，挑出阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定，其开放阅读框如SEQ ID NO. I所示，编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO. 2 所示。实施例2
斑马鱼LIGHT重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达
根据实施例I中获得的斑马鱼LIGHT基因设计引物A1、A2。其中Al的5’端具有泣《7酶切位点，A2的5’端具有酶切位点，以斑马鱼脾脏组织提取的RNA逆转录到得的第一链cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物为斑马鱼LIGHT基因胞外功能区，序列如SEQ IDNO. 7所示，它是斑马鱼LIGHT基因(SEQ ID NO. 1)3’端的501个碱基；之后将PCR产物割胶回收，回收产物用Stul和历酶切，pET SUMO载体(Novagen，USA)只用历酶切，T4DNA Ligase连接,得到图2所示的重组质粒pETSUMO-zsLIGHT (z代表zebrafish ;s代表该基因胞外可溶功能区soluble)，连接产物转化疋co7iDH5a中，获得含pETSUMO-zsLIGHT重组菌株。挑选阳性重组菌株，扩大培养提取pETSUMO-zSLIGHT重组质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，挑选阳性菌株诱导表达。引物序列如下
Al: TTACCGTCTGTACTCAGTCAAAG (SEQ ID NO. 5)
A2: CCCAAGCTTTTAAATCATAAACAACCCAAAG (SEQ ID NO. 6)
经SDS-PAGE检测(图3)显示，在大约37 kDa处为目的蛋白，经IPTG诱导20 h达到
最大表达量。
重组目的蛋白的Ni+亲和纯化
IPTG浓度0. 2 mmol/ L低温(16°C )诱导含有重组载体pETSUMO-zsLIGHT的大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)20小时后，4°C收菌，冰上超声破碎(160W，工作4s，暂停8s，共99次)表达菌体，40C，13,000 X g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱。简要过程是Binding Buffer (20 mmol/L Imidazole, 0. 5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl,pH8. 0)平衡Ni+-NTA柱后，上样含可溶性重组蛋白的上清,先用Washing buffer (20 mmol/L Imidazole, 0. 5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl, pH 8. 0)洗去杂蛋白，再用不同浓度的咪唑Tis HCl洗脱，目的蛋白在洗脱浓度为250 mmol/L Imidazole,0. 5 mol/L NaCl，20mmol/L Tris HCl，pH 8. 0洗脱下来。分管收集洗脱目的蛋白，PBS透析除盐。SDS-PAGE检测各收集管蛋白纯度和紫外分光光度计测定蛋白浓度。如图3 (条带3)所示，表达得到的目的蛋白经Ni+柱亲和纯化得到纯度达95%的活性目的蛋白。 Western 印记分析
ffestern-blot中所用一抗为鼠抗His6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG。其简要步骤是将样品先进行SGS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上,用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5%脱脂奶粉室温封闭Ih,与一抗孵育lh，与HRP标记的二抗IgG孵育lh，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。结果如图3 (条带4)所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。实施例3
将实施例I获得的斑马鱼LIGHT cDNA通过现有基因工程方法，生产重组斑马鱼LIGHT蛋白，将该蛋白注射到斑马鱼体内，作为人类相关免疫疾病模型的研究，例如，往成鱼体内注射细菌和胚胎浸没感染的方法均可使斑马鱼感染细菌，有效建立相应的细菌发病机理研究模型，海分枝杆菌感染的斑马鱼体内的肺结核肉芽肿和人类一样出现干酪样坏死，该模型可能在肺结核研究中发挥重要作用。按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰斑马鱼LIGHT基因并用于所述研究和生产。
权利要求
1.斑马鱼肿瘤坏死因子14的cDNA，其特征在于它的序列如SEQID NO. I所示。
2.—种权利要求I所述斑马鱼肿瘤坏死因子14的cDNA的克隆方法，其特征在于包括以下步骤 (1)提取斑马鱼脾脏细胞的总RNA，TransgencDNA逆转录试剂盒转录为第一链cDNA ; (2)根据人、鼠及斑马鱼LIGHT基因的预测序列设计兼并引物 正义寡核苷酸引物zLIGHT-F :5’ -ATGGCTTYADGTAACGTGTCV-3’ 反义寡核苷酸引物zLIGHT-R :5’ -TYAAATBATAAACAACCCffAA-3 (3)应用RT-PCR方法，以上述zLIGHT-F及zLIGHT-R为引物，扩增出一段cDNA序列，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定。
3.斑马鱼肿瘤坏死因子14，其特征在于它的序列如SEQID NO. 2所示。
4.一种重组表达载体pSUMO-zsLIGHT，其特征在于是通过下述方法构建得到根据权利要求I所述斑马鱼肿瘤坏死因子14的cDNA序列设计引物A1、A2，进行PCR扩增，得到的PCR产物是序列如SEQ ID NO. 7所示的斑马鱼LIGHT基因胞外功能区，将PCR产物割胶回收，回收产物用Stul和历W///酶切，pET SUMO载体只用历ζ ////酶切，T4 DNA Ligase连接酶切后的载体和PCR产物，得到pSUMO-zsLIGHT ;所述引物Al、A2序列分别如SEQ ID NO. 5和 SEQ ID NO. 6 所示。
5.一种权利要求I所述斑马鱼肿瘤坏死因子14 cDNA的重组应用，是通过基因工程方法，生产重组斑马鱼肿瘤坏死因子14，作为鱼类免疫增强剂。
全文摘要
斑马鱼肿瘤坏死因子14(TNFSF14/LIGHT)cDNA及其克隆方法和重组应用，涉及生物基因工程领域。所述斑马鱼LIGHTcDNA的序列如SEQIDNO.1所示。其克隆方法如下提取斑马鱼脾脏总RNA并进行逆转录；设计兼并引物进行PCR扩增，获得708bp的全长斑马鱼LIGHTcDNA。斑马鱼LIGHT的cDNA可通过现有基因工程的方法，将该基因的胞外功能区克隆连到pETSUMO质粒中并转到大肠杆菌BL21(DE3)中原核表达，得到斑马鱼SUMO-zsLIGHT融合蛋白。重组LIGHT蛋白可开发成预防和治疗鱼类免疫疾病的免疫增强剂和免疫佐剂。
文档编号C12N15/28GK102676535SQ20121017879
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月2日 优先权日2012年6月2日
发明者张双全, 田爱英 申请人:南京师范大学