专利名称：多基因植物表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物表达载体，尤其涉及一种携带单个或多个外源基因的植物表达载体及其构建方法，本发明还涉及该植物表达载体在转基因植物中的应用，属于植物表达载体的构建领域。
背景技术：
目前植物转基因研究主要是转化单个基因，功能单一，作用有限。多基因共同转化已成解决此问题的一条途径。构建多基因植物转化载体是实现多基因同时转化植物的基础与重要步骤，几乎所 限制，载体携带基因数量少，有些构建过程转化还需要去磷酸化、磷酸化、粘性末端补平等操作，步骤繁琐，难度较高。而有些载体引入了“gateway技术”或采用“归位内切酶结合Cre重组技术”，虽然部分解决上述问题，但也存在成本较高、需要特殊的中间载体、特殊菌株等问题。
发明内容
本发明目的之一是提供一种携带单个或多个外源基因的植物表达载体；本发明目的之二是提供一种构建所述植物表达载体的方法；本发明目的之三是将所述的植物表达载体应用于植物转基因。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的一种携带单个或多个外源基因的植物表达载体，包括植物转化载体P209、克隆载体p6435x和待转化的一个或多个目的基因；其中，p209为Ti质粒，源自载体pBI121，在原有pBI121载体的HindIII与Eco RI两个酶切位点之间引入一个带有Xba I酶切位点的片段；p209载体上有Bspl20 I与Xba I两个限制性内切酶位点；p209带有植物筛选基因npt II。所述克隆载体P6435X起源于原核表达载体pET28a ;该载体带有CaMV35S启动子及NOS终止序列，二者之间有2个Eamll05 I酶切位点，经单酶切形成T载体与目的基因PCR产物相连，构成完整的目的基因开放阅读框(0RF)，分别在开放阅读框的两侧依次携带有酶切位点Not I与Bsp1201、Spe I及Nhe I酶切位点。本发明的另外一个目的是提供一种构建所述携带单个或多个外源基因的植物表达载体的方法，包括以下步骤(I)分别构建植物转化载体p209和克隆载体p6435x ；(2)用内切酶Eamll05 I酶切克隆载体p6435x产生2个含T的3’突出端，形成T载体，与带有含A的3’突出端的第I个目的基因PCR产物相连，将第I个目的基因扩增片段完整并正向连入克隆载体中，构建成包括CaMV35S启动子+目的基因+NOS终止序列的开放阅读框；利用Not I与Nhe I双切携带目的基因表达开放阅读框(ORF)的克隆载体，回收第I个目的基因表达开放阅读框(ORF)片段，备用；(3)利用Bspl20 I与Xba I双切p209，回收p209酶切片段；将p209酶切片段与步骤(2)回收的第I个目的基因表达开放阅读框(ORF)片段连接，p209上原有的Bspl20I与Xba I位点及目的基因表达开放阅读框两端的Not I与Nhe I位点消失，而新和成的植物表达载体上带有的Bspl20I与Spe I位点，经过酶切又可以与第2个带有Not I与Nhe I位点的目的基因表达开放阅读框(ORF)片段相连，如此不断重复，构建出携带多个目的基因的植物表达载体。其中，所述的植物转化载体p209的构建方法包括在PBI121载体的Hind III与EcoRI两个酶切位点之间引入一个带有Xba I酶切位点的片段，即得。p209为Ti质粒，源自载体pBI121。自身带有植物筛选基因npt II，用于植物转化。在原有PBI121载体的Hind III与EcoR I两个酶切位点之间引入一个带有Xba I酶切位点的片段。P209载体上有Bspl20I与XbaI两个限制性内切酶位点，经内切酶Bspl20、I与Xba I双酶切后，会产生两个不同的粘性末端，与克隆载体上相应同尾酶末端片段连接后，位点会消失。所述克隆载体p6435x的构建方法包括先从载体pCAMBIA1302上克隆了带有CaMV 35S启动子、gfp绿色荧光蛋白基因及NOS终止序列并引入了新酶切位点的片段；用一个两端都带有Eamll05 I位点的片段取代gfp绿色荧光蛋白基因，形成一个新片段，再通过酶切、连接把新片段连到pET28a上得到克隆载体p6435x。可以采用诸如热激法等方式把本发明所构建的植物表达载体转化农杆菌感受态。利用农杆菌介导法转化植物，经过卡那霉素(Km)抗性筛选，获得转基因植株。本发明植物表达载体利用同尾酶之间酶切后有相同的粘性末端，彼此连接后，原有酶切位点消失的特点构建携带多个目的基因的植物表达载体。一般情况下，本载体可携带小于30kb的外源片段，对植物进行转化。本发明将目的基因PCR片段经过A-T克隆，直接连入克隆载体，完成目的基因的开放阅读框(ORF)的构建，经简单的PCR鉴定，即可用于进一步的植物转化载体构建。本发明多基因植物表达载体的构建过程中，采用Not I/Bspl20 I与Spe I/Xba I/Nhe I两个不同的同尾酶系统同时应用，利用同尾酶连接后原有酶切位点消失的特性，使酶切后的载体或片段的两端始终是不同的粘段，解决了以往载体内切酶位点有限的问题，同时也避免了载体连接过程中的自连，无需再进行粘性末端的磷酸化处理，也无需中间载体及特殊的工程菌株，回避了大多数的限制性内切酶位点，只需进行酶切、连接、转化等常规步骤。简化了操作步骤与降低实验难度，技术成熟可靠。成本低廉，在普通的实验条件下即可完成，便于推广，具有较大的科研与实际应用价值。本发明所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f 配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J. Biol.Chem. 260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ; Rossolini 等人，Mol Cell. Probes8:91-98(1994))。术语“外源DNA”指该DNA序列对该特定的宿主细胞而言属于外来的来源，或若来自相同的原始来源但对该原始序列进行了修饰或改造。术语“转化”:将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。术语“表达”内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。术语“编码序列”:转录成RNA的核酸序列。术语“植物表达载体”一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括=T-DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。
图I克隆载体p6435x图谱。 图2转化载体p209图谱。图3本发明多基因植物转化载体过程的示意图。图4载体p2096871的PCR鉴定；M maker ；A :基因BtCryIIIA的特异扩增片段；B 基因BtCryIA的特异扩增片段。图5转化植株(1-8)经PCR检测；出现与阳性对照(CK+)相同大小的片段，而非转基因植株(CK-)无此片段；初步证明为转基因植株。也证明了本发明植物表达载体可以用于植物转化。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实验材料I.质粒pUC18 (大连 TaKaRa 公司)、pBR322 (大连 TaKaRa 公司)、pUCm_T (上海生工)、pET28a (Novagen 公司)、pBI121 (Invitrogen 公司)、pCAMBIA1302 (CambiaLabs)
2.菌株大肠杆菌JM109菌株(大连TaKaRa公司)、DHlOB菌株(上海生工)3.各种试剂及内切酶购自大连TaKaRa公司、new England biolabs (NEB)、上海生工。实施例I克隆载体p6435x的构建I 载体pl302x的合成用26# 引物F AGATCTCCACTTCTAAAATGGCTACAGGCATCGTGGTGT (SEQ ID No. I)R GGTGACCCCACTTCTAAAATGGATTTTGCCTTCCTGTTTT (SEQ ID No. 2)
以pUC18为模板，进行PCR扩增，得到一个500bp左右的片段，将此片段连入PUCm-T中合成载体p26 ;用BglII与BstEII分别对p26与pCAMBIA1302进行双酶切。回收P26的小片段以及pCAMBIA1302的大片段，将二者连接。合成载体pl302x。2 载体 pl302x30 的合成用30# 引物F aagcttagatctCTTGGATCAGATTGTCGT(SEQ ID No. 3)R ggatccAGAGTCCCCCGTGTTCT(SEQ ID No. 4)以pCAMBIA1302为模板，进行PCR扩增，得到一个597bp的片段，将此片段连入pUCm-T中合成载体p30。用HindIII与BamHI分别对p30与pl302x进行双酶切。回收p30的小片段以及Pl302x的大片段，将二者连接，合成载体pl302x30。3.载体p35x的合成用4#引物 F CTTGGATCAGATTGTCGT(SEQ ID No. 5)R TCCCGATCTAGTAACATA(SEQ ID No. 6)以pCAMBIA1302为模板，进行PCR扩增，得到一个1622bp的片段，将此片段连入pUCm-T中合成载体p4。用HindIII与BstEII分别对p4与pl302x30进行双酶切。回收Pl302x30的小片段以及p4的大片段，将二者连接，合成载体p 35x。4.载体p2858的合成用58# 引物F ggatcCTACGGCTACACTAGAAGG(SEQ ID No. 7)R ggtcaccGAAACGCTGGTGAAAGT(SEQ ID No. 8)以pBR322为模板，进行per扩增，得到一个1122bp的片段，将此片段连入pUCm-T中合成载体P58。用BamHI与BstEII分别对p58与pET28a进行双酶切。回收p58的小片段以及pET28a的大片段，将二者连接，合成载体P2858。5 载体p285859的合成用59# 引物F gatatcgggcccagatctCTTCGGTTTCCGTGTT(SEQ ID No. 9)R CTGCAGTGATGCCTCCGTGTAA(SEQ ID No. 10)以pET28a为模板，进行PCR扩增，得到一个300bp左右的片段，将此片段连入pUCm-T中合成载体p59。用BglII与EcoRV分别对p59与p2858进行双酶切。回收p59的小片段以及P2858的大片段，将二者连接，合成载体P285859。
6.载体p35N的合成用BglII与PstI分别对p285859与p35x进行双酶切。回收p35x的小片段以及P285859的大片段，将二者连接，合成载体p35N。7.克隆载体p6435x的合成用64# 引物F GGTCACCgggccCTTCGGTTTCCGTGTT(SEQ ID No. 11)R gatatcGCTAGCactagTGATGCCTCCGTGTAA(SEQ ID No. 12)以pET28a为模板，进行PCR扩增，得到一个300bp左右的片段，将此片段连入pUCm-T中合成载体p64。用BstEII与EcoRV分别对p64与p35N进行双酶切。回收p64的小片段以及P35N的大片段，将二者连接，合成克隆载体p6435x。实施例2转化载体p209的构建I.载体p88的合成用88# 引物F gaattctctagaCTTCGGTTTCCGTGTT(SEQ ID No. 13)R aagctTGATGCCTCCGTGTAA(SEQ ID No. 14)以pET28a为模板进行PCR扩增，获得一条长300bp左右的片段。将此片段连入PUCm-T中合成载体p88。2.植物转化载体p209的合成用HindIII与EcoRI分别对p88与pBI121进行双酶切。回收p88的小片段及PBI121的大片段，将二者连接，合成植物转化载体p209。 实施例3携带BtCryIA与BtCryIIIA两个杀虫毒蛋白基因的植物转化载体的构建I.植物转化载体P2096871的构建采用一般PCR反应体系，分别以杀虫毒蛋白基因BtCryIA基因与BtCryIIIA基因为模板，作PCR ；PCR反应程序如下94°C预变性10min，94°C变性30s，48-60。。退火40s，72°C延伸I. 5min,20个循环；72°C延伸20min。反应结束，通过1% TAE琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段有无及长度，切胶并利用凝胶回收试剂盒回收合适的片段，引物见表I。表I部分引物
权利要求
1.携带单个或多个外源基因的植物表达载体，其特征在于，包括植物转化载体P209、克隆载体P6435x和待转化的一个或多个目的基因。
2.按照权利要求I所述的植物表达载体，其特征在于所述植物转化载体P209为Ti质粒，源自载体PBI121，在原有pBI121载体的Hind III与EcoR I两个酶切位点之间引入一个带有Xba I酶切位点的片段；p 209载体上有Bspl20 I与Xba I两个限制性内切酶位点；p209带有植物筛选基因npt II ； 所述克隆载体p6435x起源于原核表达载体pET28a ;p6435x载体带有CaMV 35S启动子及NOS终止序列，二者之间有2个Eaml 105 I酶切位点；p6435x载体携带有Not I与Bspl20I、Spe I及Nhe I酶切位点。
3.按照权利要求I或2所述的植物表达载体，其特征在于所述的目的基因是杀虫毒蛋白基因BtCryIA或/和杀虫毒蛋白基因BtCrylllA。
4.一种构建权利要求I或2所述携带单个或多个外源基因的植物表达载体的方法，包括以下步骤 (1)分别构建植物转化载体P209和克隆载体p6435x； (2)用内切酶Eamll05I酶切克隆载体p6435x产生2个含T的3’突出端，形成T载体，与带有含A的3’突出端的第I个目的基因PCR产物相连，将第I个目的基因扩增片段完整并正向连入克隆载体中，构建成包括CaMV35S启动子+目的基因+NOS终止序列的开放阅读框；利用Not I与Nhe I双切携带目的基因表达开放阅读框的克隆载体，回收第I个目的基因表达开放阅读框片段，备用； (3)利用Bspl20I与Xba I双切p209，回收p209酶切片段；将p209酶切片段与步骤(2)回收的第I个目的基因表达开放阅读框片段连接；新合成的植物表达载体上带有的Bspl20 I与Spe I位点经过酶切又与第2个带有Not I与NheI位点的目的基因表达开放阅读框片段相连，如此不断重复，构建出携带多个目的基因的植物表达载体。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的植物转化载体p209的构建方法包括在PBI121载体的Hind III与EcoR I两个酶切位点之间引入一个带有Xba I酶切位点的片段，即得。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述克隆载体p6435x的构建方法包括先从载体PCAMBIA1302上克隆了带有CaMV 35S启动子、gfp绿色荧光蛋白基因及NOS终止序列并引入了新酶切位点的片段；用一个两端都带有Eamll05 I位点的片段取代gfp绿色荧光蛋白基因，形成一个新片段，把新片段连到pET28a上得到克隆载体p6435x。
7.含有权利要求I或2所述的植物表达载体的宿主细胞。
8.按照权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞是植物细胞。
9.权利要求I或2所述的植物表达载体将外源基因转化到植物细胞或组织中的应用。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于所述的外源基因包括杀虫毒蛋白基因BtCryIA或/和杀虫毒蛋白基因BtCrylllA。
全文摘要
本发明公开了多基因植物表达载体及其构建方法和应用。所述多基因植物表达载体包括植物转化载体p209、克隆载体p6435x和待转化的一个或多个目的基因。本发明多基因植物表达载体的构建利用同尾酶连接后原有酶切位点消失的特性，使酶切后的载体或片段的两端始终是不同的粘段，解决了以往载体内切酶位点有限的问题，同时也避免了载体连接过程中的自连，无需再进行粘性末端的磷酸化处理，也无需中间载体及特殊的工程菌株，回避了大多数的限制性内切酶位点，只需进行酶切、连接、转化等常规步骤，简化了操作步骤与降低实验难度，技术成熟可靠，成本低廉，在普通的实验条件下即可完成，便于推广。
文档编号C12N15/82GK102703498SQ201210179998
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月4日 优先权日2012年6月4日
发明者杨敏生, 董研 申请人:河北农业大学