专利名称：一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及了柿子脱涩相关基因的克隆表达，以及柿叶片基因瞬时表达的体系建立。
背景技术：
柿原产中国，其味道鲜美，对人类健康良好，是东亚地区(中国，日本，韩国等)最受欢迎的水果之一，柿子的独特之处在于其果实在发育期间能累积单宁(PAs)，单宁是高分子物质，其中可溶性单宁是柿果实涩味的主要呈现物质。
柿子根据其脱涩类型以及种子是否影响果实的涩味及颜色可以分为四类完全甜柿(PCNA);完全涩柿(PCA);非完全甜柿(PVNA);非完全涩柿(PVA)。甜柿果实发育早期丧失合成单宁的能力，故其在树上能自然脱涩，成熟采收时果实不呈涩味，可直接食用；涩柿果实采后需经脱涩处理后方可食用。柿果的脱涩研究已经取得了很大的成功，例如树上乙醇蒸气包裹果实，高浓度的二氧化碳或氮气处理，温水浸泡或者交替冻融等都能完成脱涩。而且研究表明高浓度的二氧化氮处理能够使柿果在脱涩的同时保脆。关于柿果脱涩的机制很早以前就有人开始研究了。已有研究报道，脱涩处理过程中伴随着大量的乙醛累积。Matsuo和Ito (1977)提出二氧化碳脱涩处理中涉及了两个相对独立的过程。首先，果实在二氧化碳处理条件下通过无氧呼吸累积大量的乙醛。其次，乙醛与可溶性单宁结合成一种不涩的不溶性物质，促使果实脱涩。Matsuo等(1991)也证明了无氧呼吸中产生的乙醛直接参与了柿子的脱涩。因此乙醛介导的可溶性单宁缩合反应是柿果实脱涩的核心。Yamada等(2002)研究认为，ADH和PDC是柿果实内乙醛合成的关键酶，但至今为止，ADH和PDC两基因在柿果实脱涩研究中的调控机制仍未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法，通过以下步骤实现
I.柿果实中ADH和PDC基因家族成员3’端序列的获得
首先进行柿子组织(果肉，茎，叶，和花)RNA的提取，3’⑶NA和5’⑶NA逆转录得到⑶NA模板，通过查找NCBI数据库上其他植物上已知的ADH和PDC基因家族成员序列，然后用ClustalX (V 1.81)软件比对找到保守区间并在其间设计兼并引物(SEQ ID NO 1 ；SEQ IDNO :2)，克隆 2 个 ADH 基因部分编码片段(SEQ ID NO :39 ;SEQ ID NO :40);
根据前面兼并克隆到的ADH编码区片段以及NCBI上已公布的ADH和TOC基因家族EST序列，设计引物(SEQ ID NO :3 16),利用 3’RACE( rapid ampIi cation of cDNA ends)克隆技术体系，PCR扩增，片段回收，连接，转化，涂板，送测，最终分别获得了 3个ADH和4个PDC基因家族成员的3’端序列(SEQ ID NO :41 47)。2.柿果实中ADH和PDC基因家族成员在柿果实脱涩处理中的基因表达分析首先完成柿子二氧化碳和乙烯脱涩处理，果肉RNA提取和cDNA合成，用步骤2中得到的3’端序列的UTR区设计特异引物(SEQ ID NO :17 30)，引物特异性检测，熔点曲线分析、凝胶电泳分析和定量PCR产物再测序确认序列的正确性。实时定量PCR分析ADH和PDC基因家族各成员在处理与对照中的表达模式。3、柿果实中ADH和PDC基因家族成员全长序列的获得以及柿叶片瞬时表达体系构建根据获得的3’端序列设计5’RACE引物(SEQ ID NO :31 34)，以步骤I中得到的5’RACEQ)NA为模板,利用5’RACE ( rapid ampIi cation of cDNA ends)克隆技术体系,最终分别获得了 I个ADH和I个TOC 5’端序列。分别设计跨起始子和终止子的上游引物和下游引物(SEQ ID NO :35 38)，以步骤2中得到的CDNA为模板，克隆并得到ADH和PDC的全长基因(SEQ ID NO 48 ；SEQ ID NO 49),选取公司返回的带有ADH和TOC的全长基因的质粒用于下面的双酶切，构建表达载体，电导转化，农杆菌制备，甘油菌零下80°C保存，将保存的甘油菌接种至LB (kan50)平板，28 0C培养2天，再转移至新的LB (kan50)平
板培养I天(带至北京)，实验的前一天，再转移至新LB平板培养，带至实验现场(北京房山磨盘柿第一村)将LB (kan50)平板上的农杆菌转移到装有注射的50ml的离心管里(注·射液配制10 mM MgCl2和O. 5 mM乙酰丁香酮)，摇匀。选择成熟度一致的“磨盘柿”叶片，叶片背面以叶脉为对称轴，两边分别注射带有SK和目的基因(DkADHl (SEQ ID NO 48)或DkPDC2 (SEQ ID NO :49)基因)的农杆菌培养液。三天后采摘叶片，带回实验室，沿叶片注射的边缘剪下，用液氮速冻分别取样。样品保存在零下80°C下供下一步实验用。每个基因各注射10片柿叶。对样品进行可溶性单宁含量测定，分析叶片瞬时表达的效应。本发明利用拟南芥和番茄等其他植物上已知的乙醇脱氢酶和丙酮酸脱氢酶基因碱基序列，在相对保守区域设计兼并引物克隆ADH和PDC部分编码区，结合NCBI上公布的柿子ADH和PDC基因的EST序列，再利用3’RACE技术克隆出ADH和PDC基因的3’端序列，在3’端序列的UTR区设计特异引物，进行ADH和PDC基因家族各成员的表达分析，然后利用5’RACE技术克隆出ADH和PDC基因的全长序列，表达载体构建，农杆菌转化，进而进行了柿子叶片的瞬时表达验证基因功能。本发明方法是克隆出柿子脱涩相关的基因家族成员，分析这些家族成员在柿子脱涩处理中的表达模式，最后通过柿子叶片的瞬时表达验证目的基因的功能。这从分子机制上阐明了柿子采后脱涩的调控机制，有利用进一步开展柿子采后脱涩机制的功能验证(转基因，基因互作等)研究。
图I是柿子果实中ADH基因家族成员在柿果实二氧化碳脱涩处理中的基因表达模式。图2是柿子果实中PDC基因家族成员在柿果实二氧化碳脱涩处理中的基因表达模式。图3是柿子果实中ADH基因家族成员在柿果实乙烯脱涩处理基因表达模式。图4是柿子果实中PDC基因家族成员在柿果实乙烯脱涩处理基因表达模式。图5是柿子叶片瞬时表达结果柿子叶片可溶性单宁含量分析。
具体实施例方式下面结合具体实施例和附图，对本发明作进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》(第三版)。
实施例I :实时定量荧光PCR分析柿子中ADH和PDC家族成员不同处理中的表达模式；
(一)实验方法
I、柿子果实总RNA提取
在设计好的取样点，对照，乙烯和二氧化碳处理的果实果肉分别用液氮冷冻，保存于-80°C。提取RNA时,称取2g冻样加液氮充分研磨后,分别加入两管加有4ml β -巯基乙醇/CTAB (80ul/4ml)提取缓冲液的离心管中，65°C加热，涡旋混合使细胞彻底破裂，65°C再次加热l_2min ;然后往离心管中加入4ml氯仿异戊醇(24 :1)抽提液，迅速涡旋混合均勻；15°C IOOOOrpm离心IOmin,吸取上清液到新的离心管,用氯仿异戍醇(24 1)重新抽提一次，吸取上清液约3ml，两管合一管，加入1/4体积的lOmol/Ι的LiCl2,4°C冰箱过夜；40C IOOOOrpm离心30min，倒掉上清液，将离心管再次短暂离心一下，吸掉底部多余的溶液，加入400 μ I 65°C SSTE，用手指弹动管壁使沉淀充分溶解，将液体转入到I. 5ml离心管中，再加入400 μ I氯仿异戍醇(24 1)抽提液,润旋混合；2(TC IOOOOrpm离心IOmin,吸取 上清液到新的离心管中，加入2倍体积的_20°C预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，_80°C放置30min-lhour ；4°C IOOOOrpm离心20min，倒掉上清液，短暂离心后吸出残余液体，将沉淀在通风橱晾干(约IOmin);每管加入15-30 μ I DEPC水溶解沉淀，得到粗RNA样品；用1%琼脂糖凝胶电泳检测所得样品质量，好的RNA结果显示样品有两条带，亮度为上条下条 2 :1。用紫外分光光度计检测所得样品纯度，吸取1μ I RNA样品加入69μ I DEPC水混合均匀，检测OD26tl和OD28tl,分析得到OD26tZOD28tl=L 8-2. O,说明RNA纯度符合标准。根据公式OD26tlX 40(RNA浓度系数)Χ70 (样品稀释倍数)即可计算出样品RNA的浓度(ng/μ 1)，以备下一步实验用。2、柿子ADH和PDC家族成员表达模式分析
首先米用 TURBO DNase (Ambion, Applied Biosystems)去除基因组 DNA 污染，米用iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad)试剂盒逆转录合成cDNA ;然后将逆转录得到的cDNA吸取5 μ I稀释10倍，内参基因的上下游扩增引物DkACtin-FP和DkACtin-RP分别稀释至成 2. 5 μ M ;将 SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (10 μ I/ 每反应)、DkACtin_FP (I μ I/每反应)和DkACtin-RP (I μ I/每反应)，水(6 μ I/每反应)配制成混合工作液，充分混匀，分装到每个反应管；再于各反应管内加入对应的稀释10倍的cDNA模板(2 μ I);短暂离心将反应液收集于管底，进行Q-PCR ;反应程序为95°C预变性3min ;95°C变性10sec，60°C退火30sec，95°C延伸10sec，45个热循环；熔解曲线分析65°C到95°C。根据每个模板对应的Ct值(Cycle threshold),再次对模板原液进行调整，使所有模板Ct值均为23_24之间。将柿子ADH和PDC各家族成员实时定量PCR引物分别稀释至2. 5 μ M，按照前面DkACtin基因的方法配制工作液，⑶NA模板为调整好的CT值的工作液，每个模板都要设置ACtin对照基因和阴性对照。Q-PCR程序与之前一致；反应结束后，根据每个模板得到的Ct值，运用公式2-(et2-etl)即可得到该基因的相对表达量。(二)实验结果
2、实时定量荧光PCR结果显示，在二氧化碳处理和乙烯处理中DkADHl (SEQ ID NO:41)和DkPDCl (SEQ ID NO 44),DkPDC2 (SEQ ID NO :45)与果实的涩味脱除成正相关，即随着柿果实脱涩处理的进行，可溶性单宁逐渐变低，DKADHl (SEQ ID NO :41)和DkPDCl (SEQID NO 44),DkPDC2 (SEQ ID NO :45)的相对表达量逐渐上升，处理移除后，再有不同程度的下调(图1，图2，图3，图4)。实施例2 :柿叶片瞬时表达体系构建。(一)实验方法柿果实中ADH和PDC基因家族成员全长序列的获得
首先根据获得的3’端序列设计5’ RACE引物，以5’ RACE CDNA为模板，利用5’ RACE(rapid ampIi cation of cDNA ends)克隆技术体系，最终获得了 ADH和F1DC基因家族成员5’端序列。然后以5’端序列为模板，分别设计跨起始子和终止子的上游引物和下游引物，以组织CDNA为模板，PCR反应体系模板CDNA: lul, DNTP mix (2. 5mM) : I. 6ul，上游引物(IOmM) :O. 8ul,下游引物(IOmM) :O. 8ul, Pyrobest DNA Polymerase: O. lul,IOXpyrobest Buffer: 2. Oul，DEPC 水13. 7ul。通过 PCR 扩增94°C 预变性 5min，35个循环(95°C 30 s，55°C 30 s，72V 180s)，最后72°C延伸10m，回收PCR目的产物，回收产物加 A,步骤如下10XA-Tail Buffer 2. 5ul, DNTP mixture (2. 5mM) 2ul, A-TailingEnzyme :0. 25ul。然后把上述回收到的DNA片段2. 5ul，DEPC水17. 25ul混合均匀，72°C·20min,冰上 2min。产物连接到 pGEM-Teasy 载体(Promega, A1360)上，连接体系2XRapidLigation Buffer 5uI,PGEM-T EASY Vetor :lul,上述产物3ul, T4 DNA ligase lul。4°C连接过夜，产物转化到DH5 α感受态细胞中，进行抗性筛选，菌液检测，将连有目的片段的单菌落摇送公司测序(Invitrogen),序列分析并确认ADH和F1DC的全长基因。柿叶片瞬时表达体系构建柿叶片瞬时表达载体构建选取公司返回的正确的质粒用于下面的双酶切，双酶切体系Notl lul ；Spel lul ；10XH Buffer 2ul ；0. 1%BSA 2ul ;质粒3ul ;DEPC水llul。酶切产物电泳检测，回收。连接体系酶切后的pGreenll0029 62-SK :lul，酶切后的质粒4ul，Solution :5ul。4°C连接过夜，产物电导转化农杆菌，涂板，抗性筛选，单菌落菌液检测，选择转化成功的农杆菌加1:1的甘油，零下80°C保存，待下一步实验用。将上述保存的甘油菌接种至LB (kan50)平板，28 0C培养2天，再转移至新的LB(kan50)平板培养I天(带至北京)，实验的前一天，再转移至新平板培养，带至实验现场(北京房山磨盘柿第一村)，将LB(kan50)平板上的农杆菌转移到装有注射液(10 mM MgCl2 ；0. 5mM acetosyringone 50ml)的离心管里充分摇勻。选择成熟度一致的磨盘柿叶片，叶片背面以叶脉为对称轴，两边分别注射带有SK和目的基因(DkADHl (SEQ ID NO 48) *DkPDC2SEQ ID NO :49)的农杆菌培养液，每个基因各注射10片柿叶，三天后采摘叶片，带回实验室，沿叶片注射的边缘剪下，用液氮速冻分别取样。样品保存在零下80°C下，对样品进行可溶性单宁含量测定，分析叶片瞬时表达的效应(参见图5)。对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法，通过以下步骤实现 (1)柿果实中ADH和PDC基因家族成员3’端序列的获得首先进行柿子组织RNA的提取，3’⑶NA和5’⑶NA逆转录得到⑶NA模板，通过查找NCBI数据库上其他植物上已知的ADH和PDC基因家族成员序列，然后用ClustalX v I. 81软件比对找到保守区间并在其间设计兼并引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，克隆2个ADH基因部分编码片段SEQ ID NO:39和SEQ ID NO 40 ;根据前面兼并克隆到的ADH编码区片段以及NCBI上已公布的ADH和PDC基因家族EST序列，设计引物SEQ ID NO :3 16，利用3，RACE克隆技术体系，PCR扩增，片段回收，连接，转化，涂板，送测，最终分别获得了 3个ADH和4个PDC基因家族成员的3’端序列 SEQ ID NO :41 47 ； (2)柿果实中ADH和PDC基因家族成员在柿果实脱涩处理中的基因表达分析首先完成柿子二氧化碳和乙烯脱涩处理，果肉RNA提取和cDNA合成，用步骤(2)中得到的3’端序列的UTR区设计特异引物SEQ ID NO : 17 30，引物特异性检测，熔点曲线分析、凝胶电泳分析和定量PCR产物再测序确认序列的正确性，实时定量PCR分析ADH和PDC基因家族各成 员在处理与对照中的表达模式； (3)柿果实中ADH和PDC基因家族成员全长序列的获得以及柿叶片瞬时表达体系构建根据获得的3’端序列设计5’ RACE引物SEQ ID NO :31 34，以步骤(I)中得到的5’ RACECDNA为模板，利用5’RACE克隆技术体系，最终分别获得I个ADH和I个TOC 5’端序列，分别设计跨起始子和终止子的上游引物和下游引物，SEQ ID NO :35 38，以步骤(2)中得到的CDNA为模板，克隆并得到ADH和PDC的目的基因SEQ ID N0:48和SEQ ID NO 49,选取公司返回的带有ADH和roc的全长基因的质粒用于下面的双酶切，构建表达载体，电导转化，农杆菌制备，甘油菌零下80°C保存，将保存的甘油菌接种至kan50的LB平板，28 0C培养2天，转移至kan50的LB平板培养I天，实验的前一天，再转移至新的LB平板培养，再将kan50的LB平板上的农杆菌转移到装有注射夜的离心管里，摇匀，选择成熟度一致的“磨盘柿”叶片，叶片背面以叶脉为对称轴，两边分别注射带有SK和目的基因SEQ ID N0:48或SEQ ID NO:49的农杆菌培养液，三天后采摘叶片，带回实验室，沿叶片注射的边缘剪下，用液氮速冻分别取样，样品保存在零下80°C下供下一步实验用，每个基因各注射10片柿叶，对样品进行可溶性单宁含量测定，分析叶片瞬时表达的效应。
2.根据权利要求I所述的一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法，其特征在于，步骤(I)所述的柿子组织包括果肉，茎，叶，和花。
3.根据权利要求I所述的一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法，其特征在于，步骤(3)所述注射液由10 mM MgCl2和0.5 mM乙酰丁香酮配制而成。
全文摘要
本发明提供一种柿子脱涩相关基因的克隆与瞬时表达方法，通过先获得基因3’端序列，再通过3'RACE技术获得柿果实中ADH和PDC基因家族成员3’端序列；采用Q-PCR技术分析ADH和PDC基因家族成员在柿果实脱涩处理中的基因表达；分离得到柿果实中ADH和PDC基因家族成员全长序列，然后建立柿叶片瞬时表达体系。本发明方法是克隆出柿子脱涩相关的基因家族成员，分析这些家族成员在柿子脱涩处理中的表达模式，最后通过柿子叶片的瞬时表达验证目的基因的功能，从分子机制上阐明了柿子采后脱涩的调控机制，有利用进一步开展柿子采后脱涩机制的转基因，基因互作等功能验证研究。
文档编号C12N15/10GK102732536SQ20121019542
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者孙崇德, 殷学仁, 闵婷, 陈昆松 申请人:浙江大学