专利名称：一种利用人体废弃胚胎建立人胚胎干细胞系的方法
技术领域：
本发明涉及医学领域，特别是一种利用人废弃胚胎建立人胚胎干细胞系的方法。
背景技术：
人胚胎干细胞(hESCs)是唯一可分化为含生殖细胞在内所有体细胞的干细胞。1998年人胚胎干细胞首次建系，目前已成功将hESCs诱导分化出几乎所有3个胚层的细胞类型，但定向分化机制、细胞移植等研究亟待进一步深入。我国明确将“干细胞研究”作为国家中长期发展规划重要资助项目，将该领域作为赶超国外先进研究水平的突破点。2003年国家科技部、卫生部为促进我国干细胞研究的迅速开展，联合下发了 “人胚胎干细胞研究的伦理指导原则”，为干细胞研究提供了伦理保障。但截止2010年底，在美国国立卫生研究院网站上登记的hESCs系仅64株，且多个细胞系存在问题，hESCs株远不能满足应用的需要，目前国内尚无一株人胚胎干细胞系在NIH注册成功，因此，亟需一种高效的建立胚胎干细胞系的方法。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种利用人废弃胚胎建立人胚胎干细胞系的方法，可有效解决现有人胚胎干细胞的建立方法操作复杂，需要大量的胚胎，成本高，成功率低，人胚胎干细胞系远不能满足应用的需要的问题。本发明的技术方案是，收集并培养废弃胚胎，分别制备小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞，按照O. 55、. 65 X IO5个/cm2的密度，混合上述细胞制备成混合饲养层，采用机械法分离废弃胚胎的内细胞团，将分离的内细胞团置于混合饲养层上培养，建立人胚胎干细胞系。本发明操作简单，可以有效利用临床上大量废弃的新鲜及冷冻胚胎，并利用最佳铺皿密度，节约了饲养层细胞，大大降低了建立胚胎干细胞系的成本，为将来进一步开发利用胚胎干细胞奠定了基础。
具体实施例方式以下对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。本发明包括以下步骤
(O收集并培养废弃胚胎收集新鲜的废弃胚胎或对冷冻的胚胎进行解冻收集新鲜的废弃胚胎，其方法为将2-3天的不适合移植和冷冻的废弃胚胎，移入胚胎培养液微滴中(卵裂期胚胎移入卵裂期胚胎培养液，囊胚期胚胎移入囊胚培养液中)，置于35 38°C、体积浓度为4飞％的CO2培养箱中培养至第5 7天，每日观察更换培养液；
对冷冻的胚胎进行解冻从液氮中取出装有胚胎的麦管，室温气浴30s，31°C水浴30s，用无菌剪刀剪断麦管，断端接一段带空气的注射器，剪断另一端，将胚胎吹入空的器皿中，加入O. 8ml的解冻液①，IOmin后依次移入O. 8ml解冻液①+②，解冻液②，解冻液②+③，各5min，胚胎移入解冻液③制成的微滴，逐滴漂洗，移入最后一个微滴中，37°C孵育IOmin后移入胚胎培养液中；
胚胎解冻液配制所述的解冻液①为摩尔浓度为O. 5M的蔗糖解冻液(市售产品，SIGMA公司，型号8005);解冻液②为摩尔浓度为O. 2M的蔗糖解冻液(市售产品，SIGMA公司，型号8007);解冻液③为HEPES-缓冲HTF含12mg/mlHSA (市售产品，SIGMA公司，型号8013);解冻液①+②为解冻液①和解冻液②等体积混合的混合液；解冻液②+③为解冻液②和解冻液③等体积混合的混合液；
所述的胚胎培养液包括卵裂期胚胎培养液和囊胚培养液，卵裂期胚胎移入卵裂期胚胎培养液，囊胚期胚胎移入囊胚培养液中；所述的卵裂期胚胎培养液微滴为Iml体积浓度10%的血清替代品(serum protein substitute, SPS,市售产品，SAGE公司)加入9mlQuinn’s-1026 (市售产品，SAGE公司)配成卵裂期胚胎培养液，在35mm的培养皿中做25 μ L微滴，覆盖2ml矿物油，置于35 38°C、体积浓度为4飞％的CO2培养箱中平衡过夜；
所述的囊胚培养液微滴为Iml体积浓度10%的血清替代品(市售产品，SAGE公司)加入 9ml Quinn’ s-1029 (市售产品，SAGE公司)配成囊胚培养液，在35mm的培养皿中做25 μ L微滴，覆盖2ml矿物油，置于35 38°C、体积浓度为4飞％的CO2培养箱中平衡过夜；
(2)饲养层细胞的制备分别制备小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞制备小鼠胚胎成纤维细胞选取性成熟的昆明雌雄鼠，按性别比I: I合笼，次日观察雌鼠阴道口，见到阴栓即定为孕O. 5天；断颈处死孕12. 5 14. 5天的雌鼠，浸泡在盛有体积浓度为75%酒精的烧杯内lmin，在无菌条件下暴露子宫，分离子宫系膜，剪断子宫角，取出整个子宫，用含青霉素-链霉素(100IU/ml)的磷酸缓冲液漂洗3 5次；沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，用磷酸缓冲液充分漂洗，用镊子撕破胎膜，取出胎鼠，磷酸缓冲液漂洗3遍，去除胎鼠头尾、四肢和内脏，磷酸缓冲液漂洗其躯干3遍，充分去除红细胞；用无菌眼科剪将鼠胚躯干剪成Imm3以下的碎块，吸于离心管中，室温下静置5 10 min，弃上层液，留下胚胎组织碎块；加入ImL质量浓度为O. 25%胰酶，轻轻吹打30 60 s后，加入等体积的饲养层培养基终止消化，室温下静置5 10 min，收集上层细胞悬液，重复该步骤5 6次，每次消化后均收集上层单细胞悬液，最后一次消化后废弃剩余组织块；对收集到的单细胞悬液1000 rpm/min离心5min,弃上清,加入饲养层培养基轻轻吹打，制备成均勻的单细胞悬液，接种至培养瓶内，混匀，标记培养日期，细胞名称，编号等，置于35 38°C、体积浓度为4飞％的CO2培养箱中培养，每天观察，可见呈三角形或梭形的成纤维细胞；待细胞长满即可根据实验需要消化传代或冻存复苏；
制备小儿包皮成纤维细胞取下的小儿包皮组织，立即放入提前4°C预冷的无菌生理盐水的灭菌容器中；将包皮组织在含青霉素-链霉素(100IU/ml)的生理盐水中反复充分漂洗，去除血迹；去除皮下的疏松结缔组织，将皮片剪成0. 5cmX0. 5cm大小，磷酸缓冲液漂洗两次；加入ImL质量浓度为0. 25%胰酶，4°C消化12 h后，加入等体积的饲养层培养基终止消化，分离真皮和表皮，37°C条件下I型胶原酶(200 U/ml)消化真皮60min，加入饲养层培养基中和，收集细胞悬液离心，用饲养层培养基洗3次；将细胞悬液接种在培养瓶中，37°C、5%C02培养箱内培养，每天观察，隔天换培养液，待细胞长满则可根据实验需要消化传代或者冻存复苏；
所述的消化传代为弃去培养皿中的饲养层培养基和未贴壁细胞，磷酸缓冲液漂洗2遍，加入3-5ml质量浓度O. 25%胰酶消化，倒置显微镜下观察，待细胞缩回伪足，变圆而未脱落时，吸出胰酶，加饲养层培养基中和；用吸管吸取培养基吹打瓶底至细胞完全脱落，将细胞悬液移至离心管中，1000 rpm/min离心5min,弃上清液,加入4_5ml饲养层培养基吹打均匀，按传代比例1:3 1:5进行传代，选用3 5代小鼠胚胎成纤维细胞或小儿包皮成纤维细胞作为饲养层细胞；
所述的冻存为每天观察培养瓶中小鼠胚胎成纤维细胞或小儿包皮成纤维细胞，待长至饲养层培养基的80 90%时，可准备冻存，漂洗、消化操作同上述消化传代步骤；1000rpm/min离心5min,弃上清,得到细胞沉淀,加入1-1. 5ml冷冻保护液,轻轻吹打混勻,冷冻液中细胞密度为5 10 X IO6个/ml ;将细胞悬液装入冷冻管中，每管装I. 0ml，冷冻管标明细胞名称，代数和冻存日期。依次置于4°C 30min，-20°C 2h, -80°C 6 8h，投入液氮；
所述的复苏为从液氮中取出冻存管，轻轻旋松瓶盖，气浴30s后立即旋紧瓶盖，投入、37°C水浴中并不断摇动使其融化；将冻存管内融化的细胞悬液移入离心管中，沿管壁缓慢加入3ml37°C预热过的饲养层培养基,混勻，1000 rpm/min离心5min,弃上清；向细胞沉淀中加入5ml饲养层培养基，混悬后接种至培养瓶中，倒置显微镜下观察见细胞为大小较均一的圆形，置于37°C、5%C02培养箱内培养；次日换液，观察；
(3)混合饲养层的制备
向培养皿中加入质量浓度为O. 1%的明胶溶液，至覆盖住培养皿皿底，室温下静置
I.5^2. 5小时，吸出明胶溶液，得明胶包被的培养皿，待用；收集步骤(2)中制备的小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞，经磷酸缓冲液漂洗后，分别避光条件下加入丝裂霉素C溶液，置于35 38°C、体积浓度为4 6%的CO2培养箱中培养3 4小时后，除去培养瓶中的丝裂霉素C溶液，磷酸缓冲液漂洗5遍后分别加入2ml质量浓度为O. 25%的胰酶，在倒置显微镜下观察，待细胞伪足缩回，变圆而未脱落时，弃去胰酶，加入等体积的饲养层培养基终止消化，反复吹打瓶底使细胞脱落后，移至离心管内，1000 rpm/min离心5min，弃上清，得细胞沉淀，向离心管中分别加入2 4 ml的饲养层培养基吹打混匀，分别得小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞的细胞悬液；按照细胞个数1:1的比例混合小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞，得混合细胞悬液，按照O. 55、. 65 X IO5个/cm2的密度，将上述混合细胞悬液均匀铺在制备的明胶包被的培养皿中；培养皿放入35 38°C、体积浓度为4飞％的CO2培养箱中，12h细胞贴壁后即可用做饲养层，在24 48h内使用，使用前提前4h更换干细胞培养基；
(4)人胚胎干细胞系的建立
采用机械法分离步骤(I)所得的废弃胚胎的内细胞团取Iml注射器，在解剖显微镜下用注射器针头将内细胞团周围的滋养外胚层细胞切除，尽量避免损伤内细胞团；
传代培养根据细胞生长速度的差异，原代克隆生长3 7天传代，之后每隔4 7天传代I次，用Iml注射器的针头在克隆上进行机械切割，切割时选取较致密厚实的克隆，弃去分化的克隆，用巴斯德吸管将切后的克隆接种到新制备的饲养层上，传代比例1:3 1:5。所述的饲养层培养基为440ml高糖DMEM，5ml非必需氨基酸，5ml青/链霉素，50ml胎牛血清经过O. 22um滤器过滤，4°C保存。本发明还对小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞的混合细胞悬液，在制备的明胶包被的培养皿中的铺皿密度进行了研究，相关试验数据见表I:表I不同密度饲养层上克隆的生长情况 面11密度/cm2 |hESCs克隆形态观察
τ>α 5ig清晰，克隆饱满且明显隆起，易形成囊状拟胚体。
0.8X IO5 同上，无明显差异。_
0Γ6Χ105 ig清晰，细胞显著堆积生长，克隆隆起明显，饱满，细胞紧密
04X105 I边缘模糊，较易分化，克隆不饱满，无明显隆起，接种后分化快
经过试验，观察不同密度饲养层上克隆的生长情况，当铺皿密度为O. 6 X IO5个/cm2时，边缘清晰，细胞显著堆积生长，克隆隆起明显，饱满，细胞紧密，并且以此密度铺皿能够大大节约铺皿细胞数量，节省了制作饲养层的成本。 本发明经过多次反复试验，均得到相同或相似的结构，表明该发明所述方法稳定可靠，对建立的人胚胎干细胞系进行了相关鉴定，试验资料如下
实验I碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase, AKP) 4%多聚甲醒固定克隆30min,PBS (Hyclone)漂洗 3 次，依次经 TSMl (O. IM NaCl, O. IM TRIS, IOmM MgCl2,0. IM HCl 调 PH至 8.0)、TSM2 (O. IM NaCl,O. IM TRIS,50mM MgCl2,0. IM HCl 调 PH 至 9. 5)各作用 IOmin,PBS漂洗3次，加入AKP显色液(NBT/BCIP，Vector)室温避光显色2h。显微镜下观察显色程度，蒸馏水冲洗，甘油封片后观察。实验2免疫荧光检测
4%多聚甲醛固定克隆30min，PBS漂洗3次，O. 1% Triton-X-IOO室温下5 mins，然后将克隆放于含 3%BSA 的 PBS 中封闭 30mins，加入 I 40 (v v)稀释的 SSEA-4, SSEA-1,NANOG,S0X2，TRA-l-60—抗(Santa Cruz)，湿盒中4°C过夜。次日PBS漂洗，避光条件下加入1:100(v/v)稀释的相应的FITC标记的二抗(北京中杉)，湿盒中37°C培养箱30min，PBS漂洗，甘油封片，突光显微镜下观察。实验3 RT-PCR检测转录因子0CT-4的表达
Trizol提取胚胎干细胞RNA，逆转录合成cDNA，RT-PCR扩增。实验4体外分化成拟胚体
胰酶消化细胞，吹打成单细胞悬液，调整密度为4X104/ml，悬滴在培养皿盖上，每滴30 μ I，放入37°C、5% CO2培养箱，每天观察。3天后简单拟胚体形成，转移到培养皿中，用不含bFGF的hESCs培养液培养，吹打使细胞悬浮。每天取出1-2次，轻轻晃动，必要时换液。培养5-10天后，可见囊状拟胚体。实验5体内分化成畸胎瘤
机械切割hESCs克隆成50-100个小细胞团块，接种至SCID小鼠(北京维通利华实验动物有限公司)后腿或腹股沟处，每天观察。8-12周，肿瘤直径达Icm时，取出肿瘤，PBS漂洗，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，镜下观察。实验6核型分析
1.5ml干细胞培养液中加入30μ I秋水仙素(终浓度O. 2μ g/ml)，置于37°C、5% CO2培养箱培养3h。PBS漂洗2次，O. 05%胰酶消化细胞，吹打成单细胞，终止消化，3000rpm离心去上清，加入0.07511101/1的1((^低渗液1.51111，室温下作用15min。加入数滴固定液(甲醇冰醋酸=3 :1)预固定,离心去上清,依次经Iml固定液作用40min、20min,离心去上清,加入固定液2 3滴，混匀后滴片。湿度50%，221条件下晾干玻片，901烤片30min，0. 05%胰酶作用3-10s，0. 9%NaCL快速漂洗2次，Giemsa染液染色lOmin，双蒸水漂洗，自然晾干，油镜下观察分析。
经过上述试验鉴定，发现经本发明所述方法建立起来的胚胎干细胞系具有干细胞的特点，能够达到实际临床医学标准，并且采用上述方法，废弃胚胎序贯培养到囊胚后，优质囊胚的建系率可以达到31. 7%，达到国际先进水平。表2混合饲养层上建系情况说明
权利要求
1.一种利用人废弃胚胎建立人胚胎干细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)收集并培养废弃胚胎收集新鲜的废弃胚胎或对冷冻的胚胎进行解冻，按照常规方法进行培养； (2)饲养层细胞的制备按照常规方法分别制备小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞； (3)混合饲养层的制备分别收集步骤(2)中制备的小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞，分别经磷酸缓冲液漂洗，丝裂霉素C处理后，得到小鼠胚胎成纤维细胞或小儿包皮成纤维细胞的细胞悬液；按照细胞个数I :1的比例混合小鼠胚胎成纤维细胞或小儿包皮成纤维细胞，得混合细胞悬液，按照O. 55、. 65 X IO5个/cm2的密度，将上述混合细胞悬液均匀铺在明胶包被的培养皿中；培养皿放入35 38°C、体积浓度为4飞％的CO2培养箱中，培养12 14h即得混合饲养层； (4)人胚胎干细胞系的建立采用常规的机械法分离步骤(I)所得的废弃胚胎的内细胞团，将分离的内细胞团置于步骤(3)所得的混合饲养层上培养，建立人胚胎干细胞系。
2.根据权利要求I所述的利用人废弃胚胎建立人胚胎干细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤 (O收集并培养废弃胚胎收集新鲜的废弃胚胎或对冷冻的胚胎进行解冻 收集新鲜的废弃胚胎，其方法为将2-3天的不适合移植和冷冻的废弃胚胎，移入胚胎培养液微滴中，置于35 38 °C、体积浓度为4" %的CO2培养箱中培养至第5 7天,每日观察更换培养液； 对冷冻的胚胎进行解冻从液氮中取出装有胚胎的麦管，室温气浴30s，31°C水浴30s，用无菌剪刀剪断麦管，断端接一段带空气的注射器，剪断另一端，将胚胎吹入空的器皿中，加入O. 8ml的解冻液①，IOmin后依次移入O. 8ml解冻液①+②，解冻液②，解冻液②+③，各5min，然后将胚胎移入解冻液③制成的微滴，逐滴漂洗，移入最后一个微滴中，37°C孵育IOmin后，移入胚胎培养液中； 所述的解冻液①为摩尔浓度为O. 5M的蔗糖解冻液；解冻液②为摩尔浓度为O. 2M的蔗糖解冻液；解冻液③为HEPES-缓冲HTF含12mg/mlHSA ;解冻液①+②为解冻液①和解冻液②等体积混合的混合液；解冻液②+③为解冻液②和解冻液③等体积混合的混合液； 所述的胚胎培养液包括卵裂期胚胎培养液和囊胚培养液，卵裂期胚胎移入卵裂期胚胎培养液，囊胚期胚胎移入囊胚培养液中；所述的卵裂期胚胎培养液微滴为Iml体积浓度10%的血清替代品(市售产品，SAGE公司)加入9ml Quinn’ s-1026 (市售产品，SAGE公司)配成卵裂期胚胎培养液，在35mm的培养皿中做25 μ L微滴，覆盖2ml矿物油，置于35 38°C、体积浓度为4飞％的CO2培养箱中平衡过夜；所述的囊胚培养液微滴为Iml体积浓度10%的血清替代品(市售产品，SAGE公司)加入9ml Quinn’ s-1029 (市售产品，SAGE公司)配成囊胚培养液，在35mm的培养皿中做25 μ L微滴，覆盖2ml矿物油，置于35 38°C、体积浓度为的CO2培养箱中平衡过夜； (2)饲养层细胞的制备分别制备小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞 制备小鼠胚胎成纤维细胞选取性成熟的昆明雌雄鼠，按性别比I: I合笼，次日观察雌鼠阴道口，见到阴栓即定为孕O. 5天；断颈处死孕12. 5 14. 5天的雌鼠，浸泡在盛有体积浓度为75%酒精的烧杯内lmin，在无菌条件下暴露子宫，分离子宫系膜，剪断子宫角，取出整个子宫，用含青霉素-链霉素(100IU/ml)的磷酸缓冲液漂洗3 5次；沿子宫系膜侧剪开子宫，取出带有胎膜的胚胎，用磷酸缓冲液充分漂洗，用镊子撕破胎膜，取出胎鼠，磷酸缓冲液漂洗3遍，去除胎鼠头尾、四肢和内脏，磷酸缓冲液漂洗其躯干3遍，充分去除红细胞；用无菌眼科剪将鼠胚躯干剪成Imm3以下的碎块，吸于离心管中，室温下静置5 10 min，弃上层液，留下胚胎组织碎块；加入Iml质量浓度为O. 25%的胰酶，轻轻吹打30 60 s后，力口入等体积的饲养层培养基终止消化，室温下静置5 10 min，收集上层细胞悬液，重复该步骤5 6次，每次消化后均收集上层单细胞悬液，最后一次消化后废弃剩余组织块；对收集到的单细胞悬液1000 rpm/min离心5min,弃上清,加入饲养层培养基,轻轻吹打,制备成均匀的单细胞悬液，接种至培养瓶内，混匀，标记培养日期，细胞名称，编号等，置于35 38°C、体积浓度为4飞％的CO2培养箱中培养，每天观察，可见呈三角形或梭形的成纤维细胞；待细胞长满即可根据实验需要消化传代或冻存复苏； 制备小儿包皮成纤维细胞取下的小儿包皮组织，立即放入提前4°C预冷的无菌生理盐水的灭菌容器中；将包皮组织在含青霉素-链霉素(100IU/ml)的生理盐水中反复充分漂洗，去除血迹；去除皮下的疏松结缔组织，将皮片剪成O. 5cmX0. 5cm大小，磷酸缓冲液漂洗两次；加入Iml质量浓度为O. 25%的胰酶，4°C消化12 h后，加入等体积的饲养层培养基终止消化，分离真皮和表皮，37°C条件下I型胶原酶(200 U/ml)消化真皮60min，加入饲养层培养基中和，收集细胞悬液离心，用饲养层培养基洗3次；将细胞悬液接种在培养瓶中，37°C、5%C02培养箱内培养，每天观察，隔天换培养液，待细胞长满则可根据实验需要消化传代或者冻存复苏； 所述的消化传代为弃去培养皿中的饲养层培养基和未贴壁细胞，磷酸缓冲液漂洗2遍，加入3-5ml质量浓度O. 25%胰酶消化，倒置显微镜下观察，待细胞缩回伪足，变圆而未脱落时，吸出胰酶，加饲养层培养基中和；用吸管吸取培养基吹打瓶底至细胞完全脱落，将细胞悬液移至离心管中，1000 rpm/min离心5min,弃上清液,加入4_5ml饲养层培养基吹打均匀，按传代比例I :3 I :5进行传代，选用3 5代小鼠胚胎成纤维细胞或小儿包皮成纤维细胞作为饲养层细胞； 所述的冻存为每天观察培养瓶中小鼠胚胎成纤维细胞或小儿包皮成纤维细胞，待长至饲养层培养基的80 90%时，可准备冻存，漂洗、消化操作同上述消化传代步骤；1000rpm/min离心5min,弃上清,得到细胞沉淀,加入1-1. 5ml冷冻保护液,轻轻吹打混勻,冷冻液中细胞密度为5 10 X IO6个/ml ;将细胞悬液装入冷冻管中，每管装I. 0ml，冷冻管标明细胞名称，代数和冻存日期，依次置于4°C 30min, -20°C 2h，-80°C 6 8h，投入液氮；所述的复苏为从液氮中取出冻存管，轻轻旋松瓶盖，气浴30s后立即旋紧瓶盖，投入37°C水浴中并不断摇动使其融化；将冻存管内融化的细胞悬液移入离心管中，沿管壁缓慢加入3ml37°C预热过的饲养层培养基,混勻，1000 rpm/min离心5min,弃上清；向细胞沉淀中加入5ml饲养层培养基，混悬后接种至培养瓶中，倒置显微镜下观察见细胞为大小较均一的圆形，置于37°C、5%C02培养箱内培养；次日换液，观察； (3)混合饲养层的制备 向培养 皿中加入质量浓度为O. 1%的明胶溶液，至覆盖住培养皿皿底，室温下静置I.5^2. 5小时，吸出明胶溶液，得明胶包被的培养皿，待用；收集步骤(2)中制备的小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞，经磷酸缓冲液漂洗后，分别避光条件下加入丝裂霉素C溶液，置于35 38°C、体积浓度为4飞％的CO2培养箱中培养3 4小时后，除去培养瓶中的丝裂霉素C溶液，磷酸缓冲液漂洗5遍后分别加入2ml质量浓度为O. 25%的胰酶，在倒置显微镜下观察，待细胞伪足缩回，变圆而未脱落时，弃去胰酶，加入等体积的饲养层培养基终止消化，反复吹打瓶底使细胞脱落后，移至离心管内，1000 rpm/min离心5min，弃上清，得细胞沉淀，向离心管中分别加入2 4 ml的饲养层培养基吹打混匀，分别得小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞的细胞悬液；按照细胞个数I :1的比例混合小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞，得混合细胞悬液，按照O. 60 X IO5个/cm2的密度，将上述混合细胞悬液均匀铺在制备的明胶包被的培养皿中；培养皿放入35 38°C、体积浓度为4飞％的CO2培养箱中，12h细胞贴壁后即可用做饲养层； (4)人胚胎干细胞系的建立 采用常规的机械法分离步骤(I)所得的废弃胚胎的内细胞团取Iml注射器，在解剖显微镜下用注射器针头将内细胞团周围的滋养外胚层细胞切除，尽量避免损伤内细胞团； 传代培养根据细胞生长速度的差异，原代克隆生长3 7天传代，之后每隔4 7天传代I次，用Iml注射器的针头在克隆上进行机械切割，切割时选取较致密厚实的克隆，弃去分化的克隆，用巴斯德吸管将切后的克隆接种到新制备的饲养层上，传代比例I :3 I :.5 ； 所述的饲养层培养基为440ml高糖DMEM，5ml非必需氨基酸，5ml青/链霉素，50ml胎牛血清经过O. 22um滤器过滤，4°C保存。
全文摘要
本发明涉及一种利用人废弃胚胎建立人胚胎干细胞系的方法，可有效解决现有人胚胎干细胞的建立方法操作复杂，需要大量的胚胎，成本高，成功率低，人胚胎干细胞系远不能满足应用的需要的问题。解决的技术方案是，收集并培养废弃胚胎，分别制备小鼠胚胎成纤维细胞和小儿包皮成纤维细胞，按照0.55~0.65×105个/cm2的密度，混合上述细胞制备成混合饲养层，采用机械法分离废弃胚胎的内细胞团，将分离的内细胞团置于混合饲养层上培养，建立人胚胎干细胞系。本发明操作简单，可以有效利用临床上大量废弃的新鲜及冷冻胚胎，并利用最佳铺皿密度，节约了饲养层细胞，大大降低了建立胚胎干细胞系的成本，为将来开发利用胚胎干细胞奠定了基础。
文档编号C12N5/0735GK102703381SQ20121022156
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月30日 优先权日2012年6月30日
发明者姚桂东, 孔慧娟, 孙莹璞, 宋文妍, 戴善军, 李婧, 王芳, 辛志敏, 金海霞 申请人:郑州大学第一附属医院