专利名称：具有牛tlr4免疫应答功能的细胞模型及其构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体地，本发明涉及一种具有TLR4免疫应答功能的细胞模型及其构建方法。
背景技术：
真核生物的天然免疫是抵抗外界病原体入侵的第一道防线，主要通过模式识别受体来识别外来的病原体，随即引发一系列信号传导、细胞因子活化、激活免疫系统，在机体抗感染免疫中发挥着重要作用。Toll样受体(Toll Like Receptors, TLRs)是近年来研究和发现的识别入侵机体病原体的模式受体之一。TLRs能够最先接触入侵的病原体，通过识别位于病原体表面的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，TLRs可激活、引发一系列趋化因子和促炎性细胞因子的转录和分泌，如提高白介素-8(IL_8)、肿瘤坏死因子a (TNFa)和白介素10 (IL_1 P )等细胞因子的表达水平，调动炎症反应所需的多种炎性细胞和炎性分子，对入侵的病原体进行清除，发挥机体天然免疫的重要防御作用。有关人、鼠、牛等不同物种的TLRs研究已证实，TLRs基因的遗传变异和修饰会影响机体对感染性疾病的易感性，并影响疾病的发生和发展。所以，TLRs —经发现，就以其重要而独特的生物学功能和潜在的应用前景迅速成为免疫学、遗传学等研究的热点。不同的TLRs家族成员能特异地识别不同类型的病原体，Toll样受体4(TLR4)可以特异性地识别革兰氏阴性菌独特的结构成分-脂多糖(LPS)。革兰氏阴性菌，特别是大肠杆菌是引起奶牛乳房炎发病的主要病原菌之一。只有当入侵的病原微生物被及时有效地清除，才能使病原微生物所引起的炎症反应对乳腺组织结构和功能的损害降到最低。其中任何一个环节的功能障碍都会干扰乳房正常的炎症反应，造成不同程度的乳房炎症。在这一过程中，奶牛乳腺组织中的乳腺上皮细胞和巨噬细胞的TLR4负责识别革兰氏阴性菌并激活机体相应的免疫应答反应。事实上，TLR4对革兰氏阴性菌识别的敏感程度及诱发机体免疫反应的快慢决定了奶牛乳房炎的发病程度。研究也表明，TLR4基因的突变会影响奶牛乳房炎的发病率。因此TLR4被认为是抵御奶牛乳房感染的重要候选功能基因之一而备受关注。在体外细胞水平对TLR4基因功能及其在奶牛乳房抗感染免疫的作用展开研究，不仅可以排除奶牛个体作为模型时的复杂性、减少许多环境的干扰因素，而且保证了基因功能的研究尽可能地在相同的遗传背景下进行，从而获得比较准确客观的体外研究结果。这样既有助于理解TLR4基因的作用机理，又能为在个体水平进行基因功能的深入研究提供可借鉴的实验依据和参考。与人、小鼠相比，用于研究牛TLR4基因功能相应的商品化细胞模型缺乏，一定程度上制约了这一领域的研究。到现在为止，尚没有商品化的牛乳腺上皮细胞系，加之原代乳腺上皮细胞培养条件苛刻，经传代后，细胞极易老化而丧失其乳腺细胞的特性。获得可用来研究TLR4基因功能的细胞模型，能够克服由于缺乏合适的抗体、基因敲除模型和现成的细胞模型造成的牛TLR4功能研究手段十分有限的技术难题。HEK293细胞是人胚胎肾细胞，常常用来研究基因功能的商品化细胞系，而HEK293细胞本身不表达TLR4、⑶12和MD2，不能被LPS激活产生相应的细胞因子。因此，HEK293不能直接用来进行TLR4功能研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有TLR4免疫应答功能的细胞模型及其构建方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案本发明一方面涉及具有TLR4免疫应答功能的细胞模型，其特征在于将牛源MD2、⑶14、TLR4不同的三个基因用2A序列连接、组装到载体上，将载体导入商品化细胞系中，构建的细胞模型具有LPS介导的免疫应答功能。在本发明的一个优选实施方式中，所述的商品化细胞系是HEK293。在本发明的一个优选实施方式中，所述的载体是pLEX-MCS载体。
本发明另一方面还涉及上述细胞模型的构建方法，其特征在于包括扩增MD2、CD14、TLR4序列，然后将所扩增的序列组装到载体上，并将载体导入到商品化细胞系中，选择同时表达MD2、⑶14、TLR4三个蛋白的阳性细胞系。在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于克隆MD2、⑶14、TLR4基因编码序列的3’末端引物，均增加了 HA基因序列，HA标签的编码序列为AgCgTAgTCTgggACgTCgTATgggTA ;在扩增CD14和MD2的下游引物中增加能自行裂解其序列前后的两个表达蛋白、使之等摩尔独立表达的2A序列，其中2A序列为gag ggc aga gga agtctg cta aca tgc ggt gac gtc gaggag aat cct ggc cca ;同时，在2A前后力口入Linker序列tccactgcc利于表达蛋白正确折叠。为方便重组载体的组装，在MD2基因的上游引物中增加了 SpeI内切酶序列，在MD2基因的下游引物中增加了 Xho I内切酶序列；在0014基因的上游引物中增加了 Xho I内切酶序列，在CD14基因的下游引物中增加了 Mlu I内切酶序列；在11^4基因的上游引物中增加了 Mlu I内切酶序列，在TLR4基因的下游引物中增加了Age I内切酶序列。在本发明的一个优选实施方式中，设计扩增MD2基因CDS序列的引物，上游引物为 'ccgact 8gttga ate atg ttt cca ttt gtg ctt ttt tcc,下游引物为gtt<^<7 尽2犮tRR Rcc aRR att ctc ctc Rac Rtc acc Rca tRttaR caR act tcc tct rcc ctc tcc actgcc age gta gtc tgg gac gtc gtatgg gta gta att g ;设计扩增⑶ 14基因 CDS序列的引物，上游引物为cca ctc gag ctg act atR gtg tgc gtg ccc tac ctg ctg,下游引物为gtt acg cgt tRR Rcc aRR att ctc ctc Rac Rtc acc Rca tRt tag caR acttcc tct rccctc tcc act gcc age gta gtct ggg acg tcg tat ggg tac gcgaag ;设计扩增 TLR4 基因CDS序列的引物，上游引物为'ctt acg cgt gccagg atg atg gcg cgt gcc cgc ctg getgcg get ctg ate cc，下游引物为ctt aat acc ggt tea age gta gtc tgg gac gtc gtatgg gta ggt ggaggt tgt cgc ttc ttg egg gttgo本发明构建的细胞模型为研究牛TLR4基因的功能，阐明牛TLR4基因的作用机制提供技术支持，是一个有价值的牛TLR4基因功能的研究工具。
图I牛源MD2、CD14、TLR4在HEK293中同时、独立表达的Western-Blot检测(图例说明1-2分别为两株转染pLEX-MD2-⑶14-TLR4的HEK293细胞，3为蛋白质标准分子量，4为转染pLEX-MCS空载体的HEK293细胞。所用一抗为鼠抗HA标签蛋白抗体，二抗则为抗鼠的荧光标记抗体。)图2LPS刺激过表达BPI和未过表达BPI的mHEK293细胞前后TNF a基因的相对表达水平的变化图3LPS刺激过表达BPI和未过表达BPI的mHEK293细胞前后IL-8基因的相对表达水平的变化图4LPS刺激过表达TLR4不同基因型的HEK293细胞前后TNFa基因的相对表达水平的变化图5LPS刺激过表达TLR4不同基因型的HEK293细胞前后IL-8基因的相对表达水平的变化
具体实施例方式以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点，但这些实施例仅仅是举例性说明，并非用以限定本发明的保护范围。(I)引物设计根据GenBank中牛MD2基因的mRNA序列(DQ319076)，设计扩增MD2基因CDS序列的引物，上游引物为ccg act agt tga ate atg ttt cca tttgtg ctt ttt tcc,下游引物为,gtt CtC gag tRR Rcc aRR att ctc ctc RacRtc acc Rca tRt tag caR act tcc tctRcc ctc tcc act gcc age gta gtctgg gac gtc gta tgg gta gta att g。根据 GenBank中牛⑶14基因的mRNA序列(AF141313. I)，设计扩增⑶14基因⑶S序列的引物，上游引物为ccactc gag ctg act atR gtg tgc gtg ccc tac ctg ctg,下游引物为gtt acgcgt tggRcc aRR att ctc ctc Rac Rtc acc Rca tRt taR caR act tcc tctRcc ctc tcc act gccage gta gtct ggg acg tcg tat ggg tac gcg aag。根据 GenBank 中牛 TLR4 基因的 mRNA序列(DQ839567. 1)，设计扩增TLR4基因CDS序列的引物，上游引物为'Ctt acg Cgt gccagg atg atg gcg cgtgcc cgc ctg get gcg get ctg ate cc,下游引物为ctt aat accggt tcaagc gta gtc tgg gac gtc gta tgg gta ggt gga ggt tgt cgc ttc ttg egggttg。为了重组蛋白的wes tern blotting检测，在每个重组蛋白基因编码序列的3’末端，增加了 HA基因序列，HA标签的编码序列为AgCgTAgTCTgggACgTCgTATgggTA。同时，为了保证三个基因能单独表达，在CD14和MD2的下游引物中增加了两种蛋白表达后能自行裂解成两个相互独立的蛋白，自行行使其功能的2A序列，在2A前后加入Linker序列tccactgcc,以确保表达的重组蛋白构象正确折叠。其中2A序列为gag ggcaga gga agt ctgcta aca tgc ggt gac gtc gag gag aat cct ggc cca。此外，为了保证三个基因能首尾相连的组装到pLEX-MCS载体中，在MD2基因的上游引物中增加了 Spe I内切酶序列，在MD2基因的下游引物中增加了 Xho I内切酶序列；在0014基因的上游引物中增加了 Xho I内切酶序列，在CD14基因的下游引物中增加了 Mlu I内切酶序列；在11^4基因的上游引物中增加了 Mlu I内切酶序列，在TLR4基因的下游引物中增加了 Age I内切酶序列，斜体的序列为内切酶识别序列。(2)实验样品采集与总RNA提取
采集奶牛的新鲜血液组织2ml，经过红细胞裂解液处理后，按照杭州博日RNA提取试剂盒说明书进行提取。(3) RT-PCR对牛血液组织RNA进行反转录，反转录方法参照说明书；以反转录的cDNA为模板，利用基因的特异性上下游引物进行PCR反应，其反应体系为2uL cDNA模板，2uL 10XPCRbuffer, 2uL dNTP (各 2. 5mM)，上下游引物(IOmM)各 luL，IuL DMSO，IUTaq 酶(宝生物，Pfu)，用ddH20调整至20uL。TLR4基因PCR反应条件95°C预变性5min ;95°C变性30s，65°C (-2°C /2循环)退火40s以及72°C延伸180s共16个循环；然后95°C变性30s，51°C退火40s以及72°C延伸180s共19个循环；最后72°C延伸5min。CD14基因PCR反应条件中延伸时间为60s，MD2基因中延伸时间为90s，其它的条件同TLR4基因PCR反应条件。反应结束，取反应液5uL进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认其产物。⑷克隆和测序 将牛MD2的扩增产物及pLEX-MCS载体分别根据各自引物上的内切酶设计同时进行双酶切，分别回收纯化酶切后的PCR产物和pLEX-MCS载体，利用T4 DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和pLEX-MCS载体，转化E. coli DH5 a ;利用AMP+进行平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆质粒正确的质粒命名为PLEX-MD2。将牛CD14的扩增产物及pLEX-MD2载体分别根据CD14引物上的内切酶设计同时进行双酶切，分别回收纯化酶切后的PCR产物和pLEX-MD2载体，利用T4DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和pLEX_MD2载体，转化E. coli DH5 a ;利用AMP+进行平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆质粒正确的质粒命名为PLEX-MD2-⑶14。最后将牛TLR4的扩增产物及pLEX_MD2_⑶14载体分别根据TLR4引物上的内切酶设计同时进行双酶切，分别回收纯化酶切后的PCR产物和PLEX-MD2-⑶14载体，利用T4 DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和pLEX_MD2_⑶14载体，转化E. coli DH5 a ;利用AMP+进行平板筛选，并以PCR法和限制性酶切法鉴定，阳性克隆质粒正确的质粒命名为PLEX-MD2-⑶14-TLR4。(5)在293T细胞中包装重组慢病毒步骤第I日293T细胞培养和铺板293T细胞培养条件，37°C，5%的CO2，培养基采用DMEM+10%的胎牛血清，每IOcm面积中铺2-2. 5X IO6个293T细胞，保证第2天细胞在完全培养液中汇合度达到70-80% ；第2 日Lipectamine 2000 脂质体转染在聚丙烯管里准备脂质体和DNA复合物；加入I. 5ml预热的Opti-MEM培养基后，按下列比例加入目的载体及病毒包装载
体。轻轻混匀。室温放置；转染载体(pLEX-MD2-CD14-TLR4)12ug包装质粒(pSPAX2)9ug包膜质粒(pMD2G)3. 5ug在使用Lipectamine 2000之前先轻轻混匀脂质体。而后，在另一个管中加入I. 5ml室温的Opti-MEM培养基，再加入50ul Lipectamine 2000，轻轻混匀后室温放置，室温放置5min后；将上述稀释好的DNA与脂质体混合，混合物置于室温孵育20分钟；在此期间，用Opti-MEM培养基清洗待转染细胞一次，将脂质体和DNA复合物加入细胞；将细胞培养板放回37°C培养箱中孵育，2-4小时后，移去脂质体和DNA复合物，在每个培养皿中加入IOml新鲜的培养液，重新将细胞培养板放回37°C培养箱中培养。第4日收集病毒收集含病 毒的细胞培养上清液。将细胞上清用0. 45um过滤器过滤，收集过滤液；将包含病毒颗粒的过滤液分装至I. 5ml的印pendorf中，置于液氮或者_70°C保存备用；(6)利用慢病毒感染HEK293细胞，制作细胞模型。先对HEK293细胞培养和铺板，293细胞培养条件，37 °C，5 %的CO2，培养基采用DMEM+10%的胎牛血清，每个6孔板中铺3 X IO5的HEK293细胞。当细胞汇合度达到70 %时，将0. 5mL重组慢病毒和0. 5mLDMEM培养基混合液，加入聚凝胺(Polybrene) 10 u g后加入6孔板，在感染pLEX-MD2-CD14_TLR4重组病毒时，为保证试验结果的可重复性，都设置平行样品。同时设置感染pLEX-MCS病毒的样品作为感染对照，设置不感染病毒的样品作为阴性对照。16h后换新鲜培养液,继续培养48h,加入I ii g/mL的puromycin筛选细胞,每2d更换新鲜培养基。未感染重组慢病毒的对照组细胞在6d后全部死亡。继续用添加puromycin的培养基培养至转染PLEX-MD2-CD14-TLR4基因的HEK293细胞，通过Western blotting鉴定后获得稳定表达PLEX-MD2-CD14-TLR4的HEK293细胞系(见图I)，命名为mHEK293。(7)验证制作细胞模型mHEK293细胞的免疫功能。在6孔板中培养相同数目的mHEK293细胞，分别在培养基中添加终浓度为IOOng/ml的LPS，不同时间点收细胞后，提取细胞的RNA。设计TNFa、IL_8细胞因子的引物，通过Real-Time PCR检测LPS刺激前后不同时间点的相对表达量，结果显示细胞因子在LPS刺激后表达水平迅速增加(参见图2和图3中未表达BPI的BPI-实验组))，说明构建的细胞模型具有LPS介导的免疫应答功能。BPI基因能够抑制LPS介导的免疫反应，本研究通过实施例步骤2、步骤3和步骤4的方法，扩增牛BPI基因，把BPI基因克隆到pLEX-MCS载体中，构建pLEX-BPI的重组载体，通过实施例步骤5制作pLEX-BPI的慢病毒重组颗粒，然后把重组慢病毒颗粒pLEX-BPI感染mHKE293细胞模型。在6孔板中培养相同数目感染pLEX-BPI慢病毒的mHEK293细胞，分别在培养基中添加终浓度为100ng/ml的LPS，不同时间点收细胞后，提取细胞的RNA。利用设计的IL_8、TNFa细胞因子引物，通过Real-Time PCR检测LPS刺激前后不同时间点的相对表达量，结果显示在LPS刺激后感染pLEX-BPI慢病毒的mHEK 293细胞的细胞因子表达水平和对照相比没有显著变化(参见图2和图3中过表达BPI的BPI/BPI714+实验组)。也就是说，构建的mHEK293细胞模型感染pLEX-BPI慢病毒后，BPI抑制了 LPS介导的免疫反应。本实验通过上述实验证明了构建的mHEK293细胞模型能够用于研究牛TLR4基因功能。(8)在细胞模型上对不同基因型TLR4功能差异的评估TLR4基因序列E+2021位点发生突变，根据遗传学分析发现该位点不同基因型个体间奶牛乳房炎的发病率存在显著差异，本实施例对TLR4E+2021不同基因型的功能在改造的HEK293细胞模型进行评估。根据实施步骤I设计的引物，分别扩增MD2、⑶14和TLR4不同基因型的序列，然后进行步骤2-6的细胞模型构建，分别对包含不同基因型的细胞进行不同浓度的LPS侵染，然后收细胞，提取细胞的总RNA，对RNA进行反转录。利用实施步骤7中细胞因子的设计引物，采用Real-Time PCR检测两种TLR4两种基因型细胞在受到LPS刺激后，以上细胞因子表达量的差异。发现不同浓度LPS刺激不同基因型的细胞模型后，IL-8的相对表达量差异不显著，而TNF a的相对表达量差异显著(参见图4和图5)，说明TLR4E+2021位点突变确实对TLR4基因的功能造成影响。当理解的是，上述具体实施方式
仅仅是举例性说明，对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.具有TLR4免疫应答功能的细胞模型，其特征在于将牛源MD2、⑶14、TLR4不同的三个基因用2A序列连接、组装到载体上，将重组载体导入商品化细胞系中。
2.根据权利要求I所述的细胞模型，所述的商品化细胞系是HEK293。
3.根据权利要求I所述的细胞模型，所述的载体是PLEX-MCS载体。
4.权利要求I所述的细胞模型的构建方法，其特征在于包括扩增牛源MD2、CD14、TLR4序列，然后将所扩增的序列组装到载体上，并将载体导入到商品化细胞系中，选择同时表达MD2、CD14、TLR4的阳性细胞系。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于将牛源MD2、CD14、TLR4三个不同的基因用2A序列连接，使三个基因在细胞中同时独立表达。而且，MD2、⑶14、TLR4基因编码序列的3’末端，均增加了 HA基因序列标签，HA标签的编码序列为AgCgTAgTCTgggACgTCgTATgggTA ;在扩增CD14和MD2的下游引物中增加能自行裂解的2A序列，在 2A 前后加入 Linker 序列 tccactgcc,其中 2A 序列为 gag ggc aga gga agt ctg ctaaca tgc ggtgac gtc gag gag aat cct ggc cca,优选的，在所述引物中还包括限制性内切酶序列。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤设计扩增MD2基因CDS序列的引物,上游引物为-.CCgact agttga ate atgttt cca ttt gtg ctt ttt tcc,下游引物为gagtEg_ gcc agg attctc ctc gac gtc acc gca tgt tag cag act tcctct gcc ctc tcc act gccagc gta gtc tgg gac gtc gta tgg gta gta att g;设计扩增CD14 基因⑶S 序列的引物，上游引物为cca ctc gag ctR act atR gtg tgc gtg ccctacctg ctg，下游弓 I物为gtt acg CRt tRR Rcc aRR att ctc ctc Rac Rtcacc Rca tRt tagcaR act tcc tct rcc ctc tcc act gcc age gta gtct gggacg tcg tat ggg tac gcg aag ；设计扩增TLR4基因CDS序列的引物，上游引物为'Ctt acg Cgtgcc agg atg atg gcg Cgtgcc cgc ctg get gcggct ctg ate cc,下游引物为ctt aat acc ggt tea age gta gtctgg gacgtc gta tgg gta ggt gga ggt tgt cgc ttc ttg egg gttg。
全文摘要
本发明公开了具有TLR4免疫应答功能的细胞模型及其构建方法，其特征在于将牛源MD2、CD14、TLR4不同的三个基因用2A序列连接、组装到载体上，将载体导入商品化细胞系中，构建的细胞模型具有LPS介导的免疫应答功能。本发明构建的细胞模型及其构建方法为研究牛TLR4基因的功能、阐明牛TLR4基因的作用机制提供技术支持，是一个有价值的牛TLR4基因功能的研究工具。
文档编号C12N5/10GK102796706SQ20121027582
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者李文蓉, 白杰, 刘明军, 贺三刚, 张雪梅, 姚楠, 张宁, 玛依拉 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心