专利名称：一种检测干细胞注射液中细菌的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及细菌的快速检测方法。
背景技术：
近年来，干细胞可塑性研究为各种免疫类型疾病的治疗提供了一个新的方向。干细胞免疫疗法是通过调控细胞因子，修复受损的组织细胞，然后通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制受损细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。这种治疗方法在观念上完全不同于传统的药物治疗方法，其主要是通过修复人体免疫细胞来治疗疾病。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是干细胞的一个研究分支，因其具有多向分化 潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而应用于治疗治疗临床上一些难治性疾病，如血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病等，根据初步的临床报告，间充质干细胞对这些疾病的治疗都取得明显的疗效。并且认为在应用间充质干细胞治疗疾病的同时不需要严格的配型。人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液(Umbilical Cord Derived MesenchymalStem Cells Injection Against Liver Fibrosis)做为临床治疗肝硬化起到了良好的效果。它作为药物制剂，其主要成分及含量复方电解质注射液(每IOOOml含氯化钠5. 26g,葡萄糖酸钠5. 02g,醋酸钠3. 68g，氯化钾O. 37g，氯化镁O. 30g),68IU/ml低分子肝素钙，2%人血清白蛋白，脐带间充质干细胞5. O X IO5个/ml。人脐带间充质干细胞是一种贴壁细胞，在体外的实效性不得超过24小时，否则会严重影响干细胞的活力。但是按照2010年版《中国药典》的附录XI H无菌检查法中，干细胞抗肝纤维化注射液作为供试品的无菌检查，按规定的培养基和温度下培养14天，并在培养期间应逐日观察并记录是否有细菌生长。该药典方法检测时间与人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液出厂前无菌检查时间发生了矛盾，所以需要一种3小时内快速有效的检测无菌检查方法。细菌的16S rDNA中有多个保守区段，为所有细菌所共有，又有分子化石之称。根据这些保守区可以找出细菌通用引物，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此16SrDNA基因已成为较理想的的临床细菌检测靶基因序列，成为细菌鉴别和检测的金标准。实时荧光定量PCR荧光探针技术的特点有1.具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重复性好，特异性比一般的PCR技术更高。2.适用于样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。3.存在与靶基因同源的序列时，普通PCR容易出现非特异性扩增，实时荧光定量PCR适用于对特异性要求较高的定量检测。4.广泛用于人类传染病的诊断和病原定量，并且数据的采集、分析全部由仪器自动完成，因此整个检测所需的时间比普通PCR要节省得多。本发明采用实时荧光定量PCR荧光探针技术实现了 3小时内对常见的细菌快速检测的目的，有效的解决了以往细菌检测滞后的问题。对常见的细菌进行通用的检测，提高了细菌检测的通用性和敏感性。为细胞注射液早期的检测无菌提供了重要依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测干细胞注射液中细菌的方法。本发明的干细胞注射液细菌快速检测方法采用实时荧光定量PCR荧光探针技术检测干细胞注射液中的细菌，能够在3小时内完成对常见革兰氏阴性细菌和阳性细菌的检测。在特定的实施方案中，所述干细胞注射液为人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液。本发明的干细胞注射液细菌快速检测方法中，上下游PCR引物及荧光探针序列是从细菌16S rDNA序列的保守区域中筛选得到的通用引物和通用探针(见
图1)，能够与常见革兰氏阴性细菌和阳性细菌的16S rDNA序列保守区域互补。在优选的实施方案中，上下游 PCR引物及荧光探针序列如下上游引物序列5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’(SEQ ID NO 1)；下游引物序列5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’(SEQ ID NO 2)；荧光探针序列(FAM)-5’-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’-(TAMRA) (SEQ ID NO:3)。上述引物和探针序列能够检测的常见细菌种类如表I所示，总计能够检测98种革兰氏阴性细菌和112种革兰氏阳性细菌。表I引物(SEQ ID NO :1和2)和探针(SEQ ID NO :3)可检测到常见细菌的种类
权利要求
1.一种检测干细胞注射液中细菌的方法，其特征是采用实时荧光定量PCR荧光探针技术检测干细胞注射液中的细菌，上下游PCR引物及荧光探针序列与细菌16S rDNA序列的保守区域互补。
2.根据权利要求I的方法，其能够在3小时内完成对常见的革兰氏阴性细菌和阳性细菌 的检测。
3.根据权利要求I的方法，所述干细胞注射液为人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液。
4.根据权利要求I的方法，其中上下游PCR引物及荧光探针序列分别为SEQID NO U2和3。
5.根据权利要求1-4任一项的方法，其包括以下步骤 (1)供试品处理干细胞注射液混匀取Iml转移到I.5ml离心管中，4000-6000r/m离心.8-12min,取上清到新的离心管中，12000-14800r/m离心5-lOmin,弃上清,加100-1000 U I无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5_10min，再次弃上清，各加100-1000 U I无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5_10min，弃上清加10 U I无菌的去离子水重悬，取其中I做供试品模板； (2)阳性对照的处理大肠杆菌经过发酵过夜，用无菌的去离子水稀释大肠杆菌菌液浓度为2 cfu /iil，取其中5iU做阳性对照模板； (3)阴性对照的处理取5iU无菌的去离子水做阴性对照模板； (4)阳性干扰品的处理干细胞注射液混匀取Iml上清到I.5ml离心管中，同时加入IOii I浓度为2 cfu/ V- I大肠杆菌菌液，4000-6000r/m离心8-12min,取上清到新的离心管中，12000-14800r/m离心5-lOmin，弃上清，加100-1000 U I无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5_10min，再次弃上清，加100-1000 U I无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5_10min，弃上清加IOyl无菌的去离子水重悬，取其中5 做阳性干扰品1旲板； (5)扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，总反应体积为20u 1，其中模板5 iil，10 ii M的上下游引物各Iu l,2iiM的探针Iii 1,PCR预混液I,剩下的用无菌的去离子水补齐；反应条件为①50°C 2min;②95°C IOmin预变性；③95°C 15 sec ,60°C Imin为一个循环，共40次循环；d) 40°C I sec ； (6)结果判断通过比较供试品、阳性对照、阴性对照以及阳性干扰品的Ct值确定供试品中是否含有细菌。
6.根据权利要求5的方法，其中如果阳性干扰品的Ct值和阳性对照的Ct值接近，则说明供试品的处理过程不会导致假阴性的产生。
7.根据权利要求5或6的方法，其中结果判断的标准为①Ct值>40. 0的标本为阴性 ’②Ct值< 35. 0的标本，检测结果为阳性Ct值在35. 0-40. 0之间为灰色区域，供试品的Ct值<阳性对照的Ct值，检测结果为阳性；供试品的Ct值>阴性对照的Ct值，检测结果为阴性。
8.用于权利要求1-7任一项的方法的试剂盒，其包括定量PCR反应液、阴性对照和阳性对照，其中PCR反应液由PCR预混液、细菌检测上游PCR引物、下游PCR引物及荧光探针组成。
9.根据权利要求8的试剂盒，其中上下游PCR引物及荧光探针序列分别为SEQID NO:1、2 和 3。
10.权利要求1-7任一项的方法在干细胞注射液早期无菌检测中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种检测干细胞注射液中细菌的方法。该方法运用实时荧光定量PCR荧光探针技术实现了3小时内对常见的细菌进行快速检测，有效解决了以往细菌检测滞后的问题。该方法对常见细菌进行通用的检测，提高了细菌检测的通用性和快捷性，为细胞注射液早期的无菌检测提供了重要依据。
文档编号C12Q1/04GK102808032SQ201210306849
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月27日 优先权日2012年8月27日
发明者刘拥军, 朱德琳, 陈博, 徐萌 申请人:天津和泽干细胞科技有限公司