一种整形美容用脂肪干细胞新技术的制作方法
【专利摘要】利用健康自愿者瘦身吸脂时的脂肪组织，纯化干细胞用于丰胸和除皱，包括如下操作步骤：(1)脂肪组织的采集；(2)脂肪组织的消化；(3)脂肪细胞纯化；(4)脂肪干细胞纯化；(5)脂肪干的扩增培养；(6)干细胞冻存。在GMP车间无菌条件下，提取纯化得到的大量脂肪干细胞(ADSCs)，用于丰乳或面部除皱具有诸多优点：ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低、移植对机体损伤小、材料来源广泛、隆乳效果好、少量细胞即可达到理想的祛皱效果、无排异、安全可靠。ADSCs给丰胸、恢复青春期皮肤弹性提供了良好的方法。
【专利说明】一种整形美容用脂肪干细胞新技术
【技术领域】
[0001]本发明是利用脂肪组织制备出脂肪干细胞用于隆乳和除皱等整形美容的新技术，涉及医药生物技术和整形美容科学领域。
【背景技术】
[0002]当人类进入二十一世纪，人们尤其是女性同志的最求从物质正逐渐转向对健康美丽的渴望。良好的形体无疑是女人的天生资本，胸部的丰满和饱满而富有弹性的脸庞无论是对于女人还是男人都具有强烈的吸引力。然而，有些女人天生或随着年龄的增长乳房萎缩变小或松弛下垂、没有弹性，作为女人昔日的风采没有了，因此隆胸和除皱等整形美容就成为女性同志心中理想的选择。
[0003]目前，隆乳的方法有假体隆胸、注射隆胸和自体脂肪移植隆胸三类。假体隆胸是将硅胶囊包裹的硅胶冻或水凝胶制成的乳房假体，通过切口置入胸大肌下间隙。该法损伤部位大，术后恢复期较长，若干年需另行更换，患者的心理经济负担较重，术后需长期按摩乳房、永久性保护乳房不受外伤等等。注射隆胸是将一种人工化学物质通过注射填充到乳房间隙而起到丰满乳房的作用但由于操作简单，管理不严，甚至在美容院也大量使用。所以也出现很多并发症:如感染、出血、分布不均、硬结等。更有一些医生对这些并发症不正确处理，给患者带来了更大的损害。自体脂肪移植隆胸是通过吸脂法得到的自体脂肪组织移植隆胸，该法每次可注射60毫升左右脂肪，通常间隔3月后需再次注射。但该法每次注射量不能过多，容易出现脂肪液化、坏死等并发症，造成不良后果。
[0004]脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。采用自体干细胞丰胸，只需一次性移植即可达到隆乳之功效。该法创伤小，负担轻，无明显切口，安全有效；同时自体干`细胞移植法可以一举两得，即在抽取自体脂肪作为隆乳材料的同时，还可以减肥美体，其实际效用已远远超过了隆乳术本身的范畴。另外，自体脂肪干细胞还可用于面部除皱，使面部饱满润色，填平皱纹，恢复皮肤弹性，增加女性魅力。
【发明内容】
[0005]本发明利用健康自愿者瘦身吸脂时的脂肪组织，在GMP车间无菌条件下提取纯化到大量脂肪干细胞(ADSCs)，移植或扩增后丰乳或注射面部除皱。ADSCs能够在体外稳定增殖且衰亡率低，移植对机体损伤小，其材料来源广泛，隆乳效果好，少量细胞即可达到理想的祛皱效果，而且无排异、安全可靠。ADSCs给丰胸、恢复青春期弹性皮肤提供了良好的方法。
【具体实施方式】[0006]通过本实施例来具体说明本发明一种整形美容用脂肪干细胞新技术。本发明操作步序如下:
[0007](I)脂肪组织的采集。选取健康瘦身自愿者，在无菌条件下用抽脂机(腹部、臀部、大腿等脂肪丰富部位)抽取脂肪组织，同时抽取静脉血60毫升。用PBS清洗脂肪组织2-3次，放入含有双抗(青霉素/链霉素，各为I %含量)的缓冲液中，无菌环境于4°条件下运至G M P车间。
[0008](2)脂肪组织的消化。在100级GMP厂房的条件下将脂肪颗粒剪碎，0.075% I型胶原酶(Sigma-Aldrich, St.Louis, M0)37°C恒温振荡(低速震荡，50rpm)摇床消化40分钟，等量体积的完全培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清+1%双抗)中止消化。
[0009](3)脂肪细胞纯化。将消化液置于冰浴中，用吸管吹打10-15次后加入10mg/LDnase I孵育10-15分钟，行100微米滤网过滤，去除块状脂肪组织和结缔组织，4°环境1000rpm IOmin(成熟脂肪细胞在表层油滴下方、培养基上方，而处于离心管底部的是脂肪干、还有其他细胞)后去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，加入PBS清洗，4°环境1000rpm IOmin,重复此过程数次。
[0010](4)脂肪干细胞纯化。将离心的沉淀细胞用1%的盐水洗涤2-3次以除去污染的红细胞，用完全培养基重悬，接种于多聚鸟氨酸包被的培养板，培养4小时，移去上清，用
0.25%胰酶消化，难以消化的成纤维细胞、内皮细胞等将被留下。分离纯化的干细胞进行表面标记⑶29、⑶44、⑶105和⑶34、⑶45检测，以及CFU-F检测，经相关质检合格后用于面部除皱之用。
[0011](5)脂肪干的扩增培养。接着第三步，将脂肪细胞与离心管底部的脂肪干细胞一起置于300毫升的细胞培养袋， 细胞接种密度为100，OOOcells/ml，用DMEM培养基加5%人血清及相关细胞因子:10ng/ml ITS (胰岛素、转铁蛋白、硒),100u/ml青霉素，100u/ml链霉素，20ng/mlof rEGF, 10ng/ml of LIF，20ng/ml of bFGF，放置于 37°C、5% C02 培养箱中饱和湿度培养7-10天后，进行质检，合格者用于丰胸。
[0012](6)干细胞冻存。如果扩增的干细胞不用于移植，也可存入液氮罐冻存:将干细胞置于细胞冻存管，加入冻存液(含8%二甲基亚砜、10% BSA、20%胎牛血清、62% DMEM)，先后直4° > -20°预冷，再入液氣中储存。
【权利要求】
1.一种整形美容用脂肪干细胞新技术，其特征在于: (1)脂肪组织的采集，无菌条件下抽取脂肪组织，于4°条件下运至GMP车间。 (2)脂肪组织的消化，用胶原酶消化脂肪组织并用含血清的培养基中止。 (3)脂肪细胞纯化，将消化液行100微米滤网过滤，并离心得到脂肪细胞和脂肪干细胞。 (4)脂肪干细胞纯化，重悬细胞沉淀，接种培养板分离纯化干细胞。 (5)脂肪干的扩增培养，将第三步得到的脂肪细胞和脂肪干细胞扩增培养，质检合格丰胸。 (6)干细胞冻存，干细胞加入二甲基亚砜后存入液氮罐。
2.根据权利要求1所述的一种整形美容用脂肪干细胞新技术，其特征是:(I)脂肪组织的采集，在无菌条件下，吸取健康自愿者皮下脂肪，同时抽取静脉血60毫升(用于干细胞扩增培养之用)。用PBS洗去脂肪组织中的血细胞，加入I %双抗，低温运至GMP车间。
3.根据权利要求1所述的一种整形美容用脂肪干细胞新技术，其特征是:(2)脂肪组织的消化，在100级GMP厂房条件下，用0.075% I型胶原酶低速37°C恒温振荡(50rpm)消化40分钟，等量体积的完全培养基(高糖DMEM+10%胎牛血清+1 %双抗)中止消化。
4.根据权利要求1所 述的一种整形美容用脂肪干细胞新技术，其特征是:(3)脂肪细胞纯化，将消化液吹打10-15次后，加入10mg/L Dnase I孵育10-15分钟，行100微米滤网过滤，去除块状脂肪组织和结缔组织，4°环境1000rpm IOmin后去除上层油滴，将漂浮的脂肪细胞转移至新的离心管中，PBS洗涤2-3次。
5.根据权利要求1所述的一种整形美容用脂肪干细胞新技术，其特征是:(4)脂肪干细胞纯化，用I %的盐水再次洗涤细胞沉淀2-3次，接种于多聚鸟氨酸包被的培养板，培养4小时后用0.25%胰酶消化，难以消化的其它细胞将被留下。分离纯化的干细胞进行表面标记⑶29、⑶44、⑶105和⑶34、⑶45检测，以及CFU-F检测，经相关质检(细胞活力、数量、微生物)合格后用于面部除皱之用。
6.根据权利要求1所述的一种整形美容用脂肪干细胞新技术，其特征是:(5)脂肪干的扩增培养，将第三步得到的脂肪细胞与脂肪干细胞置于300毫升细胞培养袋(细胞密度:100，000cells/ml)，用DMEM培养基加5%人血清及相关细胞因子(10ng/ml ITS (胰岛素、转铁蛋白、硒)，100u/ml 青霉素，100u/ml 链霉素,20ng/ml of rEGF, 10ng/ml of LIF, 20ng/mlof bFGF)培养增殖干细胞7-10天后，进行质检(细胞活力、数量、内毒素、微生物)，合格者用于丰胸。
7.根据权利要求1所述的一种整形美容用脂肪干细胞新技术，其特征是:(6)干细胞冻存，将干细胞置于细胞冻存管，加入冻存液:8%二甲基亚砜、10% BSA、20%胎牛血清、62%DMEM，先后置4°、-20°预冷，再入液氮中储存。
【文档编号】C12N5/0775GK103667185SQ201210318746
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2012年8月31日
【发明者】孙勇 申请人:孙勇