专利名称：一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法。
背景技术：
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae, SP)属链球菌科链球菌属细菌,革兰染色阳性。它不产生内、外毒素，其致病性主要是荚膜的侵袭作用无荚膜的变异株无毒力，有荚膜的肺炎球菌可抵抗吞噬细胞的吞噬，有利于细菌在宿主体内定居并繁殖。根据细菌荚膜的多糖抗原性可将肺炎链球菌分为多于90种血清型，不同血清型具有不同的致病性。75%的成年人肺炎链球菌肺炎及50%以上严重的肺炎链球菌菌血症是由I 84型肺炎链球菌引起。成人肺炎链球菌肺炎中75%由1、2、3、4、5、7、8、12、14和19型引起，其中3型产生大量荚膜物质，毒性强而且病死率高。肺炎链球菌6、14、19及23型，常引起儿童肺炎链球菌性疾病，其中第14型肺炎链球菌感染最常见，可继发胸膜炎、脓胸、中耳炎、脑膜炎和败血症等。肺炎链球菌主要引起呼吸道感染，是目前常见的飞沫和呼吸道分泌物传播疾病。肺炎链球菌感染率与年龄、性别、地区和季节有关，在免疫能力弱或有不良生活习惯的人群中更容易被感染，也常在家庭、学校、托儿所或军队等密集人群中小规模流行。肺炎链球菌也可侵入机体其它部位，引起继发性胸膜炎、中耳炎、乳突炎以及心内膜炎等。因此对肺炎链球菌感染要尽快针对不同病情给以恰当的治疗。随着科技的进步，各种各样新的检测方法也都已应用到致病菌的检测中。现有技术中对肺炎链球菌的快速检测方法如下1、传统的培养方法(国标法)，即从血液或胸腔积液培养分离获得SP仍然作为诊断的金标准；
2、乳胶凝集法，该法是一种针对肺炎球菌荚膜抗原的免疫学凝集方法；3、自动化方法，目前微生物检测的自动化仪器已普遍使用，对于肺炎链球菌检测常见方法有API 20 Strep鉴定试条、VlTEK AMS 系统、PHOENIX SMIC / ID 鉴定板和 MICRO-SAN Walk Away 等；4、免疫层析法(Immunochromatography, ICT),目前广泛用于SP诊断的快速方法,其检测为SP各血清型所共有的抗原C多糖。该方法可用于检测尿液、胸腔积液、脑脊液和支气管灌洗液；5、核酸扩增技术,PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)属于一种核酸体外扩增技术，靠寡核苷酸指导的DNA合成的重复循环来实现对靶核酸序列的扩增，并采用凝胶电泳或探针杂交检测扩增的DNA ;6、实时荧光定量PCR技术。但上述的方法中仍然存在不足之处采用传统的培养方法(国标法)、乳胶凝集法、免疫层析法和核酸扩增技术检测，会出现假阳性或假阴性结果，影响实验结果的准确性；自动化方法由于自动化鉴定系统是根据数据库中所提供的背景资料鉴定细菌，数据库资料的不完整将直接影响鉴定的准确性，而且目前尚无一个能包括所有细节鉴定资料的鉴定系统；核酸扩增技术虽然结果好于上述4种方法，但是PCR扩增产物需要进行后处理，而PCR产物后处理时存污染，仍会导致假阳性结果，并且会对环境造成污染，对实验人员有潜在的危害；实时荧光定量PCR技术虽然解决了核酸扩增技术污染的问题，而且比核酸扩增技术的检测结果特异性更高，但仍不能达到100%的特异性。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明实施例提供了一种对病原体的核酸具有高特异性及高灵敏度的引物和荧光探针，由其制备的能够快速、准确地对病原体直接进行精确定量检测的试剂盒及其检测方法，所述技术方案如下首先，一种肺炎链球菌核酸定量检测的弓I物和荧光探针，所述引物包括正向弓I物和反向引物，其中正向引物如序列表中SEQ ID NO. I ； 反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 ；荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 3 ；或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为上述序列SEQ IDno. Tseq id no. 3的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的序列，如序列表中seq idNO. 5"SEQ ID NO. 7 ；或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为与上述序列SEQ IDNO. I SEQ ID NO. 3的同源性大于85%的序列，如序列表中SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 10 ；或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为与上述序列SEQ IDNO. I SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 5 SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8SEQ ID NO. 10 的碱基互补的序列；所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰，其中修饰荧光探针的5’端的荧光染料选自FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3或Cy5，修饰3’端的荧光染料选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。其次，一种肺炎链球菌核酸定量检测试剂盒，包括上述的引物和荧光探针。进一步地，所述试剂盒还包括PCR反应液、DNA提取液、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品，其中所述PCR反应液包括无菌水、具有5’ 一3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10XPCR Buffer、含Mg2+离子的溶液、肺炎链球菌IytA基因正向引物、肺炎链球菌IytA基因反向引物和肺炎链球菌IytA基因荧光探针；所述DNA提取液由无菌水、Triton-X 100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、NP_40 (壬基酚聚氧乙烯(40)醚)和Tris-HCL组成；所述阴性质控品为不含肺炎链球菌IytA基因的pUC57-T载体质粒DNA ；所述阳性质控品为I. OX 106IU/mL含肺炎链球菌基因组的DNA片段；所述临界阳性质控品为I. OX 104IU/mL含肺炎链球菌基因组的DNA片段；所述工作标准品为含有肺炎链球菌的IytA基因的150个碱基对的核苷酸片段的PUC57-T重组质粒DNA。具体地,所述工作标准品包括工作标准品1，含有I. OX 107IU/mL的肺炎链球菌IytA基因的非传染性DNA片段；工作标准品2，含有I. OX 106IU/mL的肺炎链球菌IytA基因的非传染性DNA片段；工作标准品3，含有I. OX 105IU/mL的肺炎链球菌IytA基因的非传染性DNA片段；
工作标准品4，含有I. O X 104IU/mL的肺炎链球菌IytA基因的非传染性DNA片段。具体地，所述具有5’ 一 3’外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。具体地，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为Taq酶O. OlU/μ L O. 05U/y L、dNTPs O. 2 O. 6mM、10 XPCR Buffer I X、MgCl2l. 5 5. OmM、肺炎链球菌IytA基因正向引物O. 05 O. 9 μ Μ、肺炎链球菌IytA基因反向引物O. 05 O. 9 μ M及肺炎链球菌IytA基因荧光探针O. 05 O. 9 μ Μ，溶剂为无菌水。具体地，所述DNA提取液中Triton-X 100的终浓度为O. 03 O. 3%、ΝΡ_40的终浓度为O. 04 O. 4%和pH值为8. 3的Tris-HCL的终浓度为O. 01 O. 1M，溶剂为无菌水。最后，一种利用上述的引物和荧光探针及上述的试剂盒的肺炎链球菌核酸定量检 测的检测方法，包括下列步骤(I)采集样品①痰液的预处理I)取痰样品加入样品体积1-3倍的4%NaOH溶液，液化15min，NaOH溶液的加入量视痰液样品粘稠度而定，粘稠度低的加1-2倍，高的加2-3倍体积，以液化完全为标准；2)吸出液化后样品置于离心管中，15000r/min离心5min,去上清。加液化后样品体积O. 8倍的灭菌TE缓冲液，充分震荡混匀，再次15000r/min离心2min，去上清液，沉淀重复洗涤2次，样本管4°C保存备用；②咽拭子标本处理取出采集的样品，放入装有ImL PBS缓冲液(pH值为7. 4)的玻璃管中，充分震荡摇勻后，用镊子在玻璃管边缘处挤干棉拭子，将玻璃管中液体转移至尚心管中，12，OOOrpm离心5min，弃上清，加入500 μ I PBS缓冲液(pH值为7. 4)，12，OOOrpm离心5min,弃上清，再加入500 μ I PBS缓冲液(pH值为7. 4)，12，OOOrpm离心5min,弃上清，
样本管4°C保存备用；(2)样品处理取待测样品和等量体积DNA提取液充分混匀后，即为处理后的样品;(3)加样向装有所述的PCR反应液的PCR反应管中分别加入所述的处理后的样品、所述的阴性质控品、所述的阳性质控品、所述的临界阳性质控品和所述的工作标准品，所述PCR反应液与所述的处理后的样品、所述的阴性质控品、所述的阳性质控品、所述的临界阳性质控品或所述的工作标准品的体积比为I :4 100 :1，再离心，经5，OOOrpm离心IOs ；(4) PCR扩增将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增94°C 5min，94°C 30s,58°C 45s，32个循环，收集荧光信号，读取荧光值；(5)分析判断Ct值小于28的为阳性，Ct值大于32的为阴性，Ct值大于或等于28且小于或等于32的为临界阳性。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是本发明实施例提供的实时TaqMan荧光定量PCR检测肺炎链球菌核酸的引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法，其引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，均能达到100%的特异性和100%的阳性检出率，其试剂盒能够精确定量测定核酸的量，有效防止假阴性和假阳性结果，其检测方法能够快速、准确地对病原体直接进行检测。本发明实施例与普通PCR反应相比，使用本发明的DNA提取液处理样品的步骤简单、快速，也不需要花费时间对PCR扩增产物进行后处理，简化了操作步骤，而且以闭管模式在扩增的同时检测目标基因，从而降低交叉污染的可能性，提高特异性；本发明与实时TaqMan荧光定量PCR相比，由于本发明实施例提供的引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，因而具有更高的特异性。
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发 明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图I是本发明实施例2提供的荧光扩增曲线图；图2是本发明实施例3提供的荧光扩增曲线图；图3是本发明实施例4提供的荧光扩增曲线图；图4是本发明实施例5提供的荧光扩增曲线图；图5是本发明实施例6提供的标准曲线的荧光扩增曲线图；图6是本发明实施例6提供的荧光扩增曲线图；图7是本发明实施例6提供的由图4得到的标准曲线图。图中Cycles 为循环数、RFU 为突光值、Log Starting Quantity copy number 为肺炎链球菌起始浓度的对数值、Ct (Threshold Cycle)值为循环数。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。以下实施例中所用试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。实施例I. 一种用于肺炎链球菌核酸定量检测的引物和荧光探针(I)引物及荧光探针设计与合成选择肺炎链球菌特异性保守基因IytA基因作为目标检测基因，通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI) (http://www. ncbi. nlm. nih. go v),获得肺炎链球菌目前已有的92个基因型的肺炎链球菌IytA基因序列，并在线(http://w ww. ebi. ac. uk/)分别对92个基因型的IytA基因序列进行序列比对，在基因区选择一段保守序列，该序列如序列表中SEQ ID N0.4所示GCCTCAAGTCGGCGTGCAACCATATAGGCA AGTACACGCACACTCAACTGGGAATCCGCATTCAACCGTACAGAATGAAGCGGATTATC ACTGGCGGAAAGACCCAGAATTAGGTTTTTTCTCGCACATTGTTGGGAACGGTTGCATC AT,利用实时TaqMan荧光定量PCR的专业设计软件BeaconDesigner 7. O设计引物和荧光探针序列，引物和荧光探针序列不仅要满足软件中各项指标，而且要确保肺炎链球菌引物和荧光探针序列能检测全部92个基因型序列。在本发明实施例中，修饰肺炎链球菌荧光探针的5’端的荧光染料可选自FAM，HEX, TET，JOE, VIC, ROX, Cy3 或 Cy5 ;修饰 3’ 端的荧光染料可选自TAMRA, Eclipse, BHQl,BHQ2，BHQ3或DABCYL。本发明实施例提供的荧光探针荧光报告基团为FAM、HEX、TET, FAM的激发波长为485nm，接收波长为527nm ;淬灭基团为EclipSe、TAMRA、BHQl。纯化方式可选自HAP、PAGE和HPLC纯化方式。设计结果如下表所示
表1A组引物和荧光探针
权利要求
1.一种肺炎链球菌核酸定量检测引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物，其特征在于，其中 正向引物如序列表中SEQ ID NO. I ； 反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 ； 荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 3 ； 或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为上述序列SEQ ID NO. rSEQ IDNO. 3的5’端和/或3’端有延长的核苷酸片段的序列，如序列表中SEQ ID NO. 5 SEQ IDNO. 7 ； 或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为与上述序列SEQ IDNO. I^SEQID NO. 3的同源性大于85%的序列，如序列表中SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 10 ； 或者所述正向引物、反向引物和荧光探针的序列分别为与上述序列SEQ IDNO. I^SEQID NO. 3、SEQ ID NO. 5 SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8 SEQ ID NO. 10 的碱基互补的序列； 所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光基团修饰，其中修饰荧光探针的5’端的荧光染料选自FAM、HEX、TET, JOE、VIC、ROX, Cy3或Cy5，修饰3’端的荧光染料选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
2.一种肺炎链球菌核酸定量检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求I所述的引物和荧光探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液、DNA提取液、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品，其中 所述PCR反应液包括无菌水、具有5’ 一 3’外切活性的DNA聚合酶、dNTPs、10 X PCRBuffer、含Mg2+离子的溶液、肺炎链球菌IytA基因正向引物、肺炎链球菌IytA基因反向引物和肺炎链球菌IytA基因荧光探针； 所述DNA提取液由无菌水、Triton-X 100、NP-40和Tris-HCL组成； 所述阴性质控品为不含肺炎链球菌IytA基因的pUC57-T载体质粒DNA ； 所述阳性质控品为I. OX 106IU/mL含肺炎链球菌基因组的DNA片段； 所述临界阳性质控品为I. OX 104IU/mL含肺炎链球菌基因组的DNA片段； 所述工作标准品为含有肺炎链球菌的IytA基因的150个碱基对的核苷酸片段的PUC57-T重组质粒DNA。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述工作标准品包括 工作标准品1，含有I. OX 107IU/mL的肺炎链球菌IytA基因的非传染性DNA片段； 工作标准品2，含有I. OX 106IU/mL的肺炎链球菌IytA基因的非传染性DNA片段； 工作标准品3，含有I. OX 105IU/mL的肺炎链球菌IytA基因的非传染性DNA片段； 工作标准品4，含有I. OX 104IU/mL的肺炎链球菌IytA基因的非传染性DNA片段。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述具有5’一3’外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液各组分在PCR扩增反应体系中的终浓度为Taq 酶 O. OlU/μ L O. 05U/y L、dNTPs O. 2 O. 6mM、10XPCRBufferl X、MgCl2 I. 5 5. OmM、肺炎链球菌IytA基因正向引物O. 05 O. 9 μ Μ、肺炎链球菌IytA基因反向引物O. 05 O. 9 μ M及肺炎链球菌IytA基因荧光探针O. 05 O. 9 μ Μ，溶剂为无菌水。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液中Triton-X100的终浓度为O. 03 O. 3%、NP-40的终浓度为O. 04 O. 4%以及pH值为8. 3的Tris-HCL的终浓度为O. 01 O. 1M，溶剂为无菌水。
8.一种利用权利要求I所述的引物和荧光探针及权利要求2-7任一项所述的试剂盒的肺炎链球菌核酸定量检测的检测方法，其特征在于，包括下列步骤 (1)米集样品 ①痰液的预处理1)取痰样品加入样品体积1-3倍的4%NaOH溶液，液化15min，NaOH溶液的加入量视痰液样品粘稠度而定，粘稠度低的加1-2倍，高的加2-3倍体积，以液化完全为标准；2)吸出液化后样品置于离心管中，15000r/min离心5min,去上清。加液化后样品体积O. 8倍的灭菌TE缓冲液，充分震荡混匀，再次15000r/min离心2min，去上清液，沉淀用灭菌TE缓冲液重复洗涤2次，样本管4°C保存备用； ②咽拭子标本处理取出采集的样品，放入装有ImLPBS缓冲液(pH值为7. 4)的玻璃管中，充分震荡摇勻后，用镊子在玻璃管边缘处挤干棉拭子，将玻璃管中液体转移至尚心管中，12，OOOrpm离心5min，弃上清，加入500 μ I PBS缓冲液(pH值为7. 4)，12，OOOrpm离心.5min，弃上清，再加入500 μ I PBS缓冲液(pH值为7.4), 12，OOOrpm离心5min,弃上清，样本管4°C保存备用； (2)样品处理取待测样品和等量体积DNA提取液充分混匀后，即为处理后的样品； (3)加样向装有所述的PCR反应液的PCR反应管中分别加入处理后的样品、所述的阴性质控品、所述的阳性质控品、所述的临界阳性质控品和所述的工作标准品，所述PCR反应液与所述的处理后的样品、所述的阴性质控品、所述的阳性质控品、所述的临界阳性质控品或所述的工作标准品的体积比为I :4 99 :1，经5，OOOrpm离心IOs ； (4)PCR扩增将各反应管放入荧光定量PCR仪器的反应槽内，设置标记荧光基团种类、样品名称及类型，按下列条件进行PCR扩增94°C 5min，94°C 30s,58°C 45s，32个循环，收集荧光信号，读取荧光值； (5)分析判断Ct值小于28的为阳性，Ct值大于32的为阴性，Ct值大于或等于28且小于或等于32的为临界阳性。
全文摘要
本发明公开了一种肺炎链球菌核酸定量检测引物、荧光探针、试剂盒及其检测方法，所述的引物包括正向引物和反向引物。所述的试剂盒可用于定量检测肺炎链球菌核酸，其中含有上述引物和荧光探针，还包括PCR反应液、DNA提取液、阴性质控品、阳性质控品、临界阳性质控品和工作标准品。利用本发明的引物和荧光探针及所述的试剂盒定量检测肺炎链球菌核酸的方法包括下列步骤(1)采集样品；(2)样品处理；(3)加样；(4)PCR扩增；(5)分析判断。本发明实施例提供的实时TaqMan荧光定量PCR，其引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，其试剂盒能够精确定量，其检测方法能够快速检测肺炎链球菌。
文档编号C12N15/11GK102876774SQ20121032053
公开日2013年1月16日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者唐景峰, 罗虹, 王业富 申请人:武汉百泰基因工程有限公司