专利名称：一种温度控制细胞培养方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学技术领域，特别是提供了一种温度控制细胞培养方法，适用于空间搭载细胞培养。
背景技术：
随着中国航天事业的发展，空间生物学效益的研究越来越深入，目前利用返回式卫星和神舟飞船搭载植物种子和微生物已进行了大量研究，但对于人和动物细胞，由于培养条件所限，研究的较少，特别是经过卫星和飞船搭载得到活细胞的研究更是鲜有报道。由于飞行器在发射和入轨前条件较为复杂，会使细胞受到影响，研究人员往往希望在此阶段细胞处于休眠状态，在飞行器入轨后再对细胞进行激活。目前国内也有一些细胞搭载培养装置，但都需要航天员人工操作，需要航天员定时加入激活剂以保证在轨阶段 细胞的生长。
发明内容
本发明的的目的在于提供一种温度控制细胞培养方法，通过温度控制进行细胞培养，工艺步骤如下I.微载体准备称取100-500毫克微载体(由纤维素、粘多糖、胶原、聚苯乙烯、硅、丙烯酰胺中的一种或几种制成)于离心管中，加入10-40毫升磷酸盐缓冲液(DPBS，由1-8克/升的氯化钠、0. 1-0. 2克/升的氯化钾、1-2克/升的磷酸氢二钠、0. 1-0. 2克/升的磷酸二氢钾制成)，室温浸泡1-4小时后，更换新的磷酸盐缓冲液进行清洗2次后，去除磷酸盐缓冲液，放入高压灭菌锅115-121°C灭菌15-30分钟。取出后去除多余水分，加入含体积百分数5-10%胎牛血清的完全培养基平衡10_24h，得到可以用于细胞生长的微载体；2.细胞接种取处于对数生长期的肿瘤细胞如小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)、肾上皮细胞(293细胞)、人肺癌细胞(H1299)等，或原代培养细胞如人皮肤成纤维细胞(ESF细胞)、小鼠胚胎成纤维细胞(3T3-L1细胞)，细胞数量为1-10 X IO6个，用0. 05-0. 25% (体积百分数)的胰蛋白酶消化后，用细胞计数板计数细胞数量，使用含1-15% (体积百分数)胎牛血清的完全培养基调整细胞数量为0. 5-2 X IO5个细胞/毫升，加入步骤I得到的可用于细胞生长的微载体，使其浓度为1-10毫克/毫升，得到细胞与微载体的混合物。将该混合物置于培养皿内，放入37°C、5% CO2的培养箱中，1-5小时内每15-30分钟摇晃一次培养皿，使细胞与微载体完全接触。培养4-16小时后,细胞已全部贴附于微载体上生长；3.细胞培养的温度控制将步骤2得到的已生长于微载体上的细胞，转入新的培养皿中，加入含1%或10%(体积百分数)胎牛血清的完全培养基，盖上盖子，封口膜封口，分别放置于20-25°C及37°C温度控制器内。
4.细胞增殖情况检测生长于微载体上的细胞，在20-25°C及37°C温度控制器内放置24-240小时后，取出摇匀，取100-1000微升细胞悬液，加入1-15% (体积百分数)的CCK-8，25-37°C孵育1-4小时，取上清液于酶标板中，使用酶标仪在450-550纳米波长下检测上清液的OD值，OD值反应细胞的増殖。此时细胞不増殖，细胞处于休眠状态，但仍有活性。将含I %胎牛血清的培养基换成含10%胎牛血清的完全培养基，将温度控制器升温至37°C继续培养24-240小时，取100-1000微升细胞悬液用上述CCK-8方法检测细胞增殖情况，此时细胞已开始増殖，且与一直放置于37°C培养的对照组细胞没有显著差异。本发明所述的微载体为球形，直径在60-87微米。 本发明所述的所述的CCK-8是一种用于测定细胞増殖或毒性实验中活细胞数目的高灵敏度的比色检测法，其颜色变化与细胞数量成正比。本发明的优点在于，在一些特殊条件下，如空间细胞搭载时，在飞行器入轨前，通过温度控制，使细胞处于休眠状态，细胞不受外界环境影响，飞行器入轨后再通过温度控制激活细胞，这样不仅能获得较多的活细胞，保证了有足够的实验材料进行后续实验，同时细胞只受空间环境的影响，减少了在飞船入轨前细胞受到的影响，更能准确反应空间环境对细胞的影响，同时不需要航天员额外的操作，较少了航天员的工作量及工作难度。
图I为B16细胞使用温度控制方法培养细胞的増殖。图2为ESF细胞使用温度控制方法培养细胞的増殖。在20_23°C培养5天后，B16细胞和ESF细胞基本不增殖，处于休眠状态，但细胞仍有活性。使用I %胎牛血清的培养基培养的B16细胞，也无明显増殖，但在升温至37°C前需换用含10%胎牛血清的完全培养基。在37°C放置的细胞有明显増殖。当温度控制器升温到37°C后，原来放于20-23°C的细胞被激活，开始增殖。
具体实施例方式实施例I.微载体准备称取500毫克微载体于离心管中，加入40毫升磷酸盐缓冲液，室温浸泡2小时后，更换新的磷酸盐缓冲液进行清洗2次后，去除磷酸盐缓冲液，放入高压灭菌锅120°C灭菌20分钟。取出后去除多余水分，加入含10%胎牛血清的完全培养基平衡16h，得到可以用于细胞生长的微载体；2.细胞接种取处于对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞(B16细胞)以及原代培养人皮肤成纤维细胞(ESF细胞)，用0. 25%的胰蛋白酶消化后，用细胞计数板计数细胞数量，使用含10%胎牛血清的完全培养基调整细胞数量为I X IO5个细胞/毫升，加入可用于细胞生长的微载体，使其浓度为5毫克/毫升，得到细胞与微载体的混合物。将该混合物置于培养皿内，放入37°C>5% CO2的培养箱中，3小时内每20分钟摇晃一次培养皿，使细胞与微载体充分接触。培养16小时后,细胞已全部贴附于微载体上生长；
3.细胞培养的温度控制将已生长于微载体上的细胞，转入新的培养皿中，加入含I %或10%胎牛血清的完全培养基，盖上盖子，封口膜封口，分别放置于20-23°C及37°C温度控制器内。4.细胞增殖情况检测生长于微载体上的细胞，在20_23°C及37°C温度控制器内放置120小时后，取出摇匀，取180微升细胞悬液，加入10%的CCK-8，37°C孵育I小时，取上清液于酶标板中，使用酶标仪在450纳米波长下检测上清液的OD值，OD值反应细胞的増殖。此时细胞不増殖，细胞处于休眠状态，但仍有活性。将含I %胎牛血清的完全培养基换成含10%胎牛血清的完全培养基，将温度控制 器升温至37°C继续培养96小时，取180微升细胞悬液用上述CCK-8方法检测细胞增殖情况，此时细胞已开始増殖，且与一直放置于37°C培养的对照组细胞没有显著差异。
权利要求
1.一种温度控制细胞培养方法，其特征在于，工艺步骤如下 (1)微载体准备 称取100-500毫克微载体于离心管中，加入10-40毫升磷酸盐缓冲液DPBS，室温浸泡1-4小时后，更换新的磷酸盐缓冲液进行清洗2次后，去除磷酸盐缓冲液，放入高压灭菌锅115-121°C灭菌15-30分钟；取出后去除多余水分，加入含体积百分数5-10%胎牛血清的完全培养基平衡10_24h，得到用于细胞生长的微载体； (2)细胞接种 取处于对数生长期的肿瘤细胞或原代培养细胞，细胞数量为I-IOXlO6个，用.0.05-0. 25体积％的胰蛋白酶消化后，用细胞计数板计数细胞数量，使用含1-15体积％胎牛血清的完全培养基调整细胞数量为0.5-2X IO5个细胞/毫升，加入步骤(I)得到的用于细胞生长的微载体，使其浓度为1-10毫克/毫升，得到细胞与微载体的混合物；将该混合物置于培养皿内，放入37°C、5% CO2的培养箱中，1-5小时内每15-30分钟摇晃一次培养皿，使细胞与微载体完全接触；培养4-16小时后,细胞已全部贴附于微载体上生长； (3)细胞培养的温度控制 将步骤(2)得到的已生长于微载体上的细胞，转入新的培养皿中，加入含I体积％或10体积％胎牛血清的完全培养基，盖上盖子，封口膜封口，分别放置于20-25°C及37°C温度控制器内； (4)细胞增殖情况检测 生长于微载体上的细胞，在20-25°C及37°C温度控制器内放置24-240小时后，取出摇匀，取100-1000微升细胞悬液，加入1-15体积％的00(-8，25-371孵育1-4小时，取上清液于酶标板中，使用酶标仪在450-550纳米波长下检测上清液的OD值，OD值反应细胞的増殖。此时细胞不増殖，细胞处于休眠状态，但仍有活性； 将含I %胎牛血清的培养基换成含10%胎牛血清的完全培养基，将温度控制器升温至.37°C继续培养24-240小时，取100-1000微升细胞悬液用上述CCK-8方法检测细胞增殖情况，此时细胞已开始増殖，且与一直放置于37°C培养的对照组细胞没有显著差异。
2.根据权利要求I所述的温度控制细胞培养方法，其特征在于，所述的微载体为球形，直径在60-87微米。
3.根据权利要求I所述的温度控制细胞培养方法，其特征在于，所述的所述的CCK-8是一种用于测定细胞増殖或毒性实验中活细胞数目的高灵敏度的比色检测法，其颜色变化与细胞数量成正比。
4.根据权利要求I所述的温度控制细胞培养方法，其特征在于，所述的微载体由纤维素、粘多糖、胶原、聚苯乙烯、硅、丙烯酰胺中的一种或几种制成。
5.根据权利要求I所述的温度控制细胞培养方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液DPBS由1-8克/升的氯化钠、0. 1-0. 2克/升的氯化钾、1-2克/升的磷酸氢二钠、0. 1-0. 2克/升的磷酸二氢钾制成。
6.根据权利要求I所述的温度控制细胞培养方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞为小鼠黑色素瘤细胞B16细胞、肾上皮细胞293细胞、人肺癌细胞H1299。
7.根据权利要求I所述的温度控制细胞培养方法，其特征在于，所述的原代培养细胞为人皮肤成纤维细胞ESF细胞、小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1细胞。
全文摘要
一种温度控制细胞培养方法，属于细胞生物学技术领域。工艺步骤为微载体准备、细胞接种、细胞培养的温度控制、细胞增殖情况检测。优点在于，在一些特殊条件下，如空间细胞搭载时，在飞行器入轨前，通过温度控制，使细胞处于休眠状态，细胞不受外界环境影响，飞行器入轨后再通过温度控制激活细胞，这样不仅能获得较多的活细胞，保证了有足够的实验材料进行后续实验，同时细胞只受空间环境的影响，减少了在飞船入轨前细胞受到的影响，更能准确反应空间环境对细胞的影响，同时不需要航天员额外的操作，较少了航天员的工作量及工作难度。
文档编号C12N5/09GK102796704SQ201210320799
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者党磊, 张美姿, 赵仁滨 申请人:北京天辰空间生物医药研发有限公司