专利名称：一种应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体涉及一种应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法。
背景技术：
犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的一种高度接触性传染病，俗称狗瘟，该病的传染性极强，死亡率高达80%以上。接种犬瘟热疫苗是预防犬瘟热最为有效的途径之一。近年来，在广泛应用犬瘟热疫苗防治犬瘟热的同时，世界各地仍有犬或野生动物感染犬瘟热病毒，并造成犬瘟热流行的报道，且犬瘟热病毒的变异使得痊愈犬仍可传染犬瘟热病毒。单克隆抗体具有特异性高、灵敏性好和重复性优等特点，常用于诊断和治疗犬瘟 热病毒引起的相关疾病。其中，抗犬瘟热病毒的单克隆抗体为犬瘟热的诊断和治疗提供良好的基础。此外，抗犬瘟热单克隆抗体对犬瘟热的临床诊断、流行病学调查、病原学研究等方面都有积极和重要的意义。迄今为止，抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备方法主要采用动物体内培养法，所使用的生产动物多为BALB/c小鼠，具体步骤为1)将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长并产生腹水；2)从所产生的腹水中提取分离杂交瘤细胞所生成的单克隆抗体。该方法制得的单克隆抗体浓度高，且具有操作简便、经济等优点，但产量有限，无法实现工业规模化生产，同时腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白(包括IgG)，需要提纯后才能使用，并有污染动物病毒的危险。因此，急需研究新的抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，本发明的方法克服了传统动物体内生产工艺产品杂蛋白含量高、产品质量不稳定、批间差大等缺陷，具有培养基成分明确、过程和质量可控、抗体纯度高、操作简便、生产效率高、广品纯度闻、稳定性好等优点。本发明的技术方案为一种应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，包括如下步骤I)将分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行无血清悬浮适应培养；2)在生物反应器内分两阶段培养所述杂交瘤细胞；3)收获培养上清液；4)将收获的上清液进行超滤、冻干，制得抗犬瘟热病毒单克隆抗体成品。本发明的优选技术方案中，所述杂交瘤细胞株选自能够稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株，优选所述的鼠杂交瘤细胞株为HB-216杂交瘤细胞株。本发明的优选技术方案中，步骤2)中在生物反应器内分两阶段培养杂交瘤细胞包括杂交瘤细胞的细胞生长阶段和抗体分泌阶段，其中，细胞生长阶段以获取细胞量为主，抗体分泌阶段以持续获得大量分泌性抗体为主。本发明的优选技术方案中，所述细胞生长阶段的培养条件为温度为36°C -37搅拌转速为 120 RPM -180RPM、溶氧(DO)为 30%_80% 和 pH 为 7. 0-7. 2。本发明的优选技术方案中，所述抗体分泌阶段的培养条件为温度为34°C -35搅拌转速为 120RPM-180RPM、溶氧(DO)为 30%_80% 和 pH 为 7. 2-7. 4。本发明的优选技术方案中，所述生物反应器选自搅拌式生物反应器、激流式生物反应器中的任一种或其组合。本发明的优选技术方案中，步骤2 )生物反应器内分两阶段培养所用的培养基选自Hybridoma-SFM无血清培养基、PFHM-II无血清培养基中的任一种或其组合。本发明的优选技术方案中，步骤2)中生物反应器内的培养方法选自分批培养法、 补料分批培养法、灌注培养法中的任一种或其组合。本发明的优选技术方案中，所述分批培养法为在生物反应器内放入一定量的培养基后，接入适量细胞，使其生长繁殖，一次性收获产品。本发明的优选技术方案中，所述补料分批培养法为在分批培养过程中补加新鲜的培养基或营养物质，一次性收获产品，其中，补料所用培养基为原倍培养基或浓缩了 2-5倍的培养基，优选为浓缩了 3-4倍的培养基，并间歇补加营养物质或流加营养物质，其中，所述的营养物质选自葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物、乳清蛋白水解物的任一种或其组合。本发明的优选技术方案中，所述灌注培养法为细胞接种生物反应器后所进行的培养，新鲜的培养基不断加入生物反应器，同时又连续不断的排出废液或连续收获产品，其中，优选的灌注体积为O. 5-3个工作体积/天，通过更改蠕动泵转速来调节灌注速率。本发明的优选技术方案中，步骤2)中生物反应器内的培养方法选自单级培养法、逐级放大培养法的任一种或其组合，单级培养法优选为14L单级培养法、逐级放大培养法优选为14L-75L-650L逐级放大培养法。本发明的优选技术方案中，所述14L单级培养法以摇瓶培养细胞为种子细胞，将其接种到14L搅拌式生物反应器中进行培养，并产生抗体。本发明的优选技术方案中，所述14L-75L-650L逐级放大培养法以14L生物反应器培养细胞为种子细胞，再将种子细胞放大到75L生物反应器中培养，再以75L生物反应器中培养的细胞作为种子细胞，将其放大到650L生物反应器进行培养，并产生抗体。本发明的优选技术方案中，步骤3 )所述的收获培养上清液为收获抗体上清，其中，所述培养上清液的收获法选自批式收获法、间歇收获法、连续收获法中的任一种或其组合，优选为连续收获法。本发明的优选技术方案中，步骤4)所述的超滤是指将收获的抗体上清进行抗体超滤浓缩，其中，超滤所用膜包的孔径选自5kD超滤膜、8kD超滤膜的任一种或其组合。为了清楚地表述本发明的保护范围，本发明对下述术语进行如下界定本发明所述的“生物反应器”是指通过体外模拟微生物体内生长及代谢环境的一种具有生物功能的设备，其包括但不限于本发明所述的“搅拌式生物反应器”或“激流式生物反应器”。本发明所述的“生物反应器放大”是指在利用生物反应器培养细胞的过程中，将各项指标(包括细胞生长动力学、热力学、细胞代谢及细胞生理状态等)从小规模生物反应器放大到大规模生物反应器上进行再现或者加以优化的一项综合性技术。一般通过优化生物反应器的物理结构、建立数学模型及代谢调控策略来实现生物反应器的放大过程，其包括但不限于本发明所述的“生物反应器逐级放大”。本发明所述的“杂交瘤细胞”是将具有无限分裂、增殖能力的SP2/0骨髓瘤细胞和具有抗犬瘟热病毒抗体 分泌功能的小鼠脾淋巴细胞经聚乙二醇(PEG)介导细胞融合而成，所形成的杂交瘤细胞同时具有无限增殖和抗体分泌两种细胞特性，包括但不限于本发明实施例所例举的HB-216杂交瘤细胞。除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果I、本发明提供了一种应用生物反应器无血清悬浮培养杂交瘤细胞以制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，该方法不在培养基中添加牛血清，从而避免了牛血清对抗体分泌的影响，也克服了血清中异种蛋白的残留(如导致过敏反应)对抗犬瘟热病毒单克隆抗体质量的影响，并避免了污染动物病毒的风险，且所制备的抗犬瘟热病毒单克隆抗体具有组分明确，产品质量优等优点。2、本发明的制备方法将杂交瘤细胞在生物反应器中分两阶段培养，包括细胞生长阶段和抗体分泌阶段，其中，细胞生长阶段获得了大量的细胞质，抗体分泌阶段持续大量地获取了分泌性单克隆抗体，显著优化了细胞的生长及抗体的分泌表达，有效地改善和提高了抗体的表达水平。3、本发明采用单级培养法或逐级放大培养法，实现了制备过程的自动化控制，大大降低了生产成本，提高了产品的质量。4、与现有技术相比，本发明的方法克服了传统动物体内生产工艺产品杂蛋白含量高、产品质量不稳定、批间差大等缺陷，具有培养基成分明确、过程和质量可控、抗体纯度高、操作简便、生产效率高、产品纯度高、稳定性好等优点。
图I为本发明应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法流程图，该方法采用无血清培养基在生物反应器内分两阶段悬浮培养杂交瘤细胞，以制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体。图2为本发明收获抗体原液超滤浓缩制备单克隆抗体的操作示意图。图3为本发明收获单克隆抗体的间接免疫荧光试验结果，其中，I为本发明所获抗体样品，2为阴性血清样品，3为阳性血清样品。
具体实施例方式为了便于理解本发明，特例举以下实施例，其作用应被理解为是对本发明的进一步的解释和说明，而不是用于限制本发明的范围。实施例I杂交瘤细胞无血清悬浮适应培养
本实施例所用的杂交瘤细胞为鼠杂交瘤细胞HB-216购自美国标准生物品收藏中W(ATCC), Hybridoma-SFM无血清培养基购自Invitrogen公司，细胞培养摇床购自上海智诚分析仪器公司，DMEM/F12培养基购自北京清大天一公司，新生小牛血清购自武汉三利生物技术有限公司。I)杂交瘤细胞复苏从液氮中取出HB-216杂交瘤细胞，37°C水浴，使其迅速融化后，将HB-216杂交瘤细胞转入IOml新鲜含10%血清的DMEM/F12培养基的离心管中，轻轻吹打，使之混匀， 800r/min离心10分钟，弃去上清。加入新鲜培养基重悬，将重悬后HB-216杂交瘤细胞移入细胞培养瓶内，37°C, 二氧化碳培养箱内静置培养6小时后,更换培养基一次,制得复苏好的静置培养的HB-216杂交瘤细胞。2)杂交瘤细胞的无血清悬浮适应培养将复苏好的静置培养的HB-216杂交瘤细胞用Hybridoma-SFM无血清培养基静置培养传代2次，细胞长成致密单层后，用吸管轻轻吹打后，接种摇瓶培养，培养条件为温度为37V，摇床转速为100 RPM,过程中取样观察细胞分散状况，若细胞结团严重，可静置3分钟，取上清细胞悬液继续传代，依此法传代2次，至HB-216细胞分散状态良好，计数细胞活性在90%以上，即判定HB-216细胞已适应无血清悬浮培养。实施例2 14L搅拌式生物反应器两阶段培养杂交瘤细胞本实施例所用的生物反应器为搅拌式生物反应器(购自荷兰Applikon公司)，配备微泡通气装置及旋转Spin-Filter细胞截留装置，Hybridoma-SFM无血清培养基购自美国Invitrogen公司，VERO细胞由武汉生物制品研究所提供，⑶V病毒鼠源阳性血清及⑶V病毒鼠源阴性血清由武汉中博生物股份有限公司按常规方法制备，DMEM/F12培养基购自北京清大天一公司，羊抗鼠IgG+IgM荧光二抗购自Sigma公司，荧光显微镜购自德国LEICA公司。I)种子细胞的制备将实施例I中已适应Hybridoma-SFM无血清悬浮培养的HB-216杂交瘤细胞接种到250mL摇瓶中进行培养，待细胞密度达到2X 106cells/mL后，传代扩大至IOOOmL摇瓶中，进行种子细胞的扩大培养，摇瓶置于恒温摇床中，温度为37°C，摇床转速为100 RPM，制得种子细胞。2)生物反应器的准备将14L搅拌式生物反应器罐体进行彻底清洗，将pH及DO电极进行标定后安装到罐体上，包扎管道接口并进行检漏试验，完成后进行高压蒸汽灭菌(121 °C>30min),自然冷却至室温。将无菌过滤好的Hybridoma-SFM无血清培养基无菌连接到反应器上，通过蠕动泵导入罐体，培养基的最少加入量以浸没电极探头为标准，设定参数，并打开反应器温度、搅拌及通气控制，进行培养基的平衡和预培养，过夜待用。3)杂交瘤细胞接种生物反应器将步骤I)摇瓶培养好的种子细胞进行细胞计数，待其密度达到3 X IO6 cells/mL时，接种到14L生物反应器中，要求初始细胞密度应不低于5X 105cells/mL，初始培养体积为4L，后依细胞密度逐渐补充至工作体积。4)生物反应器两阶段培养其中，设定细胞生长阶段生物反应器的培养条件为温度为37°C，搅拌转速为140RPM，DO为40%，pH为7. O。培养过程中每天取样检测细胞生长情况，当细胞密度达到2X IO6ceIlsAiL时，开启灌注培养，通过蠕动泵泵入新鲜Hybridoma-SFM无血清细胞生长培养基，同时经反应器内置旋转Spin-Filter细胞截留装置泵出无细胞培养上清液，通过更改蠕动泵转速来调整灌注速率，一般为O. 5-2个工作体积/天，细胞培养2-3天。当细胞密度达到3X IO6ceIlsAiL时，上清中可明显检测到抗体分泌，则细胞培养进入抗体分泌阶段。设定抗体分泌阶段的培养条件为温度为35°C，搅拌转速为 120RPM, DO 为 60%, pH 为 7. 2。5)收获按照O. 5-1. O个培养体积/天的速率开始连续收获上清液，每天取样观察细胞状态及检测抗体效价，并通过更改蠕动泵转速来调整收获速率。过程可间歇流加浓缩的Hybridoma-SFM无血清培养基和营养物质,其中,所述的营养物质选自葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物或乳清蛋白水解物等。当抗体分泌量明显降低及细胞活性明显下降后，结束培养，抗体生产周期一般为5-8天。6)抗体的检测将VERO细胞分瓶时接种⑶V，然后滴加于细胞培养板，24h后，将含10%小牛血清的DMEM/F12培养基换成含2%小牛血清的DMEM/F12培养基后，每天注意观察细胞是否产生细胞病变。当细胞病变达30%左右时，倾去细胞维持液，pH7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)洗漆后,用冷甲醇_20°C固定IOmin后,弃去固定液,将细胞板自然晾干,将已固定的细胞板用PH7. 2的PBS洗涤3次，5min/次拍干，然后加入体积比为I :50稀释的鼠源阳性血清(作为阴性对照)、鼠源阴性血清(作为阳性对照)各100μ L、50倍稀释的实施例2所获得抗体原液(样品)100 μ L，加样后做好标记，置37°C作用lh，pH7. 2的PBS洗涤3次，每次5min，拍干；加入体积比为I :200稀释的羊抗鼠IgG+IgM荧光二抗，37°C作用45min，pH7. 2的PBS洗涤3次，每次5min，拍干，荧光显微镜观察结果，见图3。图3中1、2、3分别为本实施例2所获得的杂交瘤细胞培养上清液、犬瘟热病毒检测阴性血清和犬瘟热病毒检测阳性血清对感染了 CDV的VERO细胞进行的间接免疫荧光试
验结果。由图3可见，本实施例所获得的杂交瘤细胞培养上清液样品和阳性血清的细胞培养物均出现闪亮蓝绿荧光；阴性血清的细胞培养物未出现闪亮蓝绿荧光。可以看出，本方法所获得的单克隆抗体对鉴定CDV感染具有很高的特异性诊断价值。7)将所收获的上清液经超滤、无菌分装、加塞冻干后，制成成品，低温保存。成品按照《中华人民共和国兽药典》(2005版)附录第15页、第19页的要求进行检验，结果为无细菌、霉菌、支原体生长。实施例3 搅拌式生物反应器14L-75L-650L放大培养本实施例所用的生物反应器为搅拌式生物反应器(购自荷兰Applikon公司)，配备微泡通气装置及旋转Spin-Filter细胞截留装置，Hybridoma-SFM无血清培养基购自美国Invitrogen公司，VERO细胞由武汉生物制品研究所提供，⑶V病毒鼠源阳性血清及⑶V病毒鼠源阴性血清由武汉中博生物股份有限公司按常规方法制备，DMEM/F12培养基购自北京清大天一公司，羊抗鼠IgG+IgM荧光二抗购自Sigma公司，荧光显微镜购自德国LEICA公司。I)种子细胞的制备将实施例I中已适应无血清悬浮培养的HB-216杂交瘤细胞接种到IOOmL Hybridoma-SFM无血清培养基中，进行摇瓶培养，待细胞密度达到2X IO6Cells/mL后，依次传代扩大至250mL、IOOOmL摇瓶中，进行种子细胞的扩大培养，摇瓶置于恒温摇床中，温度为37°C，摇床转速为100RPM，制得种子细胞。2)生物反应器的准备将14L搅拌式生物反应器罐体进行彻底清洗，将pH及DO电极进行标定后安装到罐体上，包扎管道接口并进行检漏试验，完成后进行高压蒸汽灭菌(121°C、30min),自然冷却至室温。将无菌过滤好的Hybridoma-SFM无血清培养基无菌连接到反应器上，通过蠕动泵导入罐体，培养基的最少加入量以浸没电极探头为标准，设定参数，并打开反应器温度、搅拌及通气控制，进行培养基的平衡和预培养，过夜待用。3)杂交瘤细胞接种生物反应器将步骤I)摇瓶培养好的种子细胞进行细胞计数，待其密度达到3X106 cells/mL时，接种到14L生物反应器中，要求初始细胞密度应不低于5X 105cells/mL，初始培养体积为4L，后依细胞密度逐渐补充至工作体积。4)接种75L生物反应器将步骤3)获取的14L生物反应器培养的杂交瘤细胞作为种子细胞，接种到75L生物反应器中进行培养，接种初始细胞密度不低于5X105cellS/mL。设定培养参数为温度为37°C，搅拌转速为120RPM，DO为40%，pH为7. 0，培养过程中采用Hybridoma-SFM无血清培养基,每天进行细胞计数并分析细胞活性。5) 650L生物反应器两阶段培养当75L生物反应器培养细胞密度达到·3 X IO6ceIlsAiL时，将75L生物反应器培养细胞作为种子细胞，接种到650L生物反应器，设定细胞生长阶段的培养条件为温度为37°C，搅拌转速为120RPM，DO为40%，pH为7. O。在细胞生长阶段的培养过程中，每天取样检测细胞生长情况，当细胞密度达到2X IO6Cells/mL时，启动灌流，灌流速度为O. 5-2个工作体积/天。通过蠕动泵泵入新鲜无血清细胞生长培养基，同时经反应器内置旋转Spin-Filter细胞截留装置泵出无细胞培养上清液，通过更改蠕动泵转速来调整灌注速率，一般为O. 5-2个工作体积/天，细胞培养2-3天。当细胞密度达到3X106cellS/mL时，上清中可明显检测到抗体分泌，则细胞培养进入抗体分泌阶段。设定抗体分泌阶段的培养条件为温度为35°C，搅拌转速为100RPM，D0为60%，pH为
7.2。5)收获按照O. 5-1. O个培养体积/天的速率开始连续收获上清液，每天取样观察细胞状态及检测抗体效价，并通过更改蠕动泵转速来调整收获速率。过程可间歇流加浓缩的培养基和营养物质，所述的营养物质选自葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物、乳清蛋白水解物等，当抗体分泌量明显降低及细胞活性明显下降后，结束培养，抗体生产周期一般为5-8天。6)抗体检测同样按实施例2步骤6)所述的抗体检测方法进行抗体检测，其间接免疫荧光试验结果表明，本实施例方法制备的抗体同样对检测CDV病毒具有良好的特异性。7)将所收获的无细胞上清液经超滤、无菌分装、加塞冻干后，制成成品，低温保存。成品按照《中华人民共和国兽药典》(2005版)附录第15页、第19页的要求进行检验，结果为无细菌、霉菌、支原体生长。实施例4抗犬瘟热病毒单克隆抗体制品的制备本实施例所使用的超滤系统为Millipore公司生产，配备5Kd和SKd孔径超滤膜包；冻干机为美国SM公司FD5505系列产品。I)超滤浓缩的准备将超滤系统在O. 5mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡过夜，用无菌PH7. 2的PBS冲洗膜包(膜包孔径为5Kd)，直到洗涤液pH为PBS的pH为止。2)超滤浓缩将盛装实施例2或3所收获的抗体原液容器、无菌pH7. 2的PBS液容器通过三通接头与超滤器进液口相连接，抗体原液容器通过另一接口同时也与超滤器回液口相连接，废液收集容器与超滤器透过液口相连接，抗体原液容器、无菌PH7. 2的PBS液容器和废液收集容器上均安装有呼吸器(孔径O. 22 μ m)，其作用是为了保证操作过程容器内外气体无菌交换及压力平衡。超滤浓缩操作管道连接及流程如图2所示，打开进液口蠕动泵，调节泵速至适当大小，使初始进液口初始压力低于O. 05Mpa，调节回液口压力及透过液流量，低于膜包孔径的小分子(包括水分子、无机离子、生物小分子等)经超滤器部分从透过液口进入废液收集容器，高于膜包孔径的大分子(包括目标产物抗体蛋白分子等生物大分子等)经超滤器从回液口重新回到抗体原液容器并不断循环而达到浓缩抗体蛋白的目的。随着超滤的持续进行，抗体容器中蛋白浓度的升高，进液口压力会逐渐上升，此时应适当改变泵速来调整进液口压力，原则上使得进、回液口压差(即跨膜压)不高于O. 2Mpa。当抗体原液浓缩倍数达到所需产品质 量要求时，停止泵入抗体原液，切换为无菌PH7. 2的PBS进液洗滤超滤膜1-2次，以充分回收抗体浓缩液。一般抗体浓缩倍数为10-50倍，回收率在80%以上。3)真空冻干将步骤2所回收得到的抗体浓缩液中加入冻干保护剂混匀后无菌分装至冻干瓶中，放好丁基胶塞后放入< _20°C低温冰箱冷冻12h以上。打开冻干机启动压缩机制冷程序，当制冷温度低于_40°C时，将待冻干样品从低温冰箱迅速转移至冻干仓内，检测密封盖密封完好后手动启动系统抽真空，此时真空度在几分钟内迅速由9999mTorr降至IOmTorr以下并开始计时，抽真空时间一般为15_18h。抽真空结束后按程序自动进入干燥过程，设定干燥温度20°C -25°C，时间为3-6h。干燥结束后调节手轮，进行手动压塞，之后打开排气阀冻干结束，将样品转移并轧盖包装。取样观察其物理形态为蓬松状，加入注射用水后15分钟完全溶解，无异物。经真空度、残余水分按兽药典规程检测合格后，低温保存。成品按照《中华人民共和国兽药典》(2005版)附录第15页、第19页的要求进行检验，结果为无细菌、霉菌、支原体生长。
权利要求
1.一种应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于包括如下步骤 1)将分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行无血清悬浮适应培养； 2)在生物反应器内分两阶段培养所述杂交瘤细胞； 3)收获培养上清液； 4)将收获的上清液进行超滤、冻干，制得抗犬瘟热病毒单克隆抗体成品。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述杂交瘤细胞株选自能够稳定分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞株，优选所述的鼠杂交瘤细胞株为HB-216杂交瘤细胞株。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤2)中在生物反应器内分两阶段培养杂交瘤细胞包括杂交瘤细胞的细胞生长阶段和抗体分泌阶段，其中，细胞生长阶段以获取细胞量为主，抗体分泌阶段以持续获得大量分泌性抗体为主，所述的细胞生长阶段的培养条件为温度为36°C -37°C、搅拌转速为120 RPM -180RPM、溶氧(DO)为30%_80%和pH为7. 0-7. 2 ;所述抗体分泌阶段的培养条件为温度为34°C -35 °C，搅拌转速为120RPM-180RPM、溶氧(DO)为 30%-80% 和 pH 为 7. 2-7. 4。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤2)中所述生物反应器选自搅拌式生物反应器、激流式生物反应器中的任一种或其组合。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤2)生物反应器内分两阶段培养所用的培养基选自Hybridoma-SFM无血清培养基、PFHM-II无血清培养基中的任一种或其组合。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤2)中生物反应器内的培养方法选自分批培养法、补料分批培养法、灌注培养法中的任一种或其组合，其中，所述分批培养法为在生物反应器内放入一定量的培养基后，接入适量细胞，使其生长繁殖，一次性收获产品；所述补料分批培养法为在分批培养过程中补加新鲜的培养基或营养物质，一次性收获产品，其中，补料所用培养基为原倍培养基或浓缩2-5倍的培养基，并间歇补加营养物质或流加营养物质，其中，所述的营养物质选自葡萄糖、谷氨酰胺、酵母提取物、乳清蛋白水解物的任一种或其组合；所述灌注培养法为细胞接种生物反应器后进行培养，新鲜的培养基不断加入生物反应器，又连续不断的排出废液或收获产品，其中，灌注体积为O. 5-3个工作体积/天，通过更改蠕动泵转速来调节灌注速率。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤2)中生物反应器内的培养方法选自单级培养法、逐级放大培养法中的任一种或其组合，单级培养法为14L单级培养法，逐级放大培养法为14L-75L-650L逐级放大培养法，其中，所述14L单级培养法以摇瓶培养细胞为种子细胞，将其接种到14L搅拌式生物反应器中进行培养，并产生抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述14L-75L-650L逐级放大培养法以14L生物反应器培养细胞为种子细胞，再将种子细胞放大到75L生物反应器中培养，再以75L生物反应器中培养的细胞作为种子细胞，将其放大到650L生物反应器进行培养，并产生抗体。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤3)所述的收获培养上清液为收获抗体上清，其中，所述培养上清液的收获法选自批式收获法、间歇收获法、连续收获法中的任一种或其组合。
10.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤4)所述的超滤是指将收获的抗体上清进行抗体超滤浓缩，其中，超滤所用膜包的孔径选自5kD超滤膜、8kD超滤膜的任一种或其组合。
全文摘要
本发明涉及一种应用生物反应器制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤1)将分泌抗犬瘟热病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行无血清悬浮适应培养；2)在生物反应器内分两阶段培养所述杂交瘤细胞；3)收获培养上清液；4)超滤、冻干，制得成品。本发明应用生物反应器悬浮培养生产单克隆抗体的方法，克服了动物体内制备抗犬瘟热病毒单克隆抗体方法中所存在的产品杂蛋白含量高、质量不稳定、批间差大等缺陷，并具有培养基成分明确、方法和过程可控、抗体纯度高、操作简便、生产效率高等优点。
文档编号C12P21/08GK102936612SQ20121032235
公开日2013年2月20日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者李伟, 刘洁, 秦红刚, 漆世华, 温文生, 朱薇, 谢红玲, 韩兴, 王桢桢, 廖园园, 李建, 王威 申请人:武汉中博生物股份有限公司