专利名称：一种重组人朊蛋白hPrP及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种重组人朊蛋白hPrP及其编码基因和制备方法，以及含有该编码基因的重组表达载体和重组人朊蛋白hPrP在检测朊病毒病中的应用。
背景技术：
朊病毒(Prion)病，又称为传染性海绵状脑病(TSEs)，是一种致死性神经退行性疾病，以脑空泡化、神经元死亡和神经小胶质细胞增生为主要特征。朊蛋白与传染性海绵状脑病的的发生密切相关，因此，重组朊蛋白对这类病的诊断试剂的研发及发病机制的研究是必不可少的。目前获得重组朊蛋白的方法都是通过基因工程技术构建朊蛋白表达载体，通过大肠杆菌表达目的蛋白，然后通过复性获得可溶状态 的重组朊蛋白。然而这些表达技术在构建载体的环节都存在一个不足目的片段通过双酶切技术连接在表达载体上之后，上游的酶切位点(构建载体的酶切位点和额外的酶切位点)没有去除，会与目的基因一起被翻译，目的蛋白的N端相应会多出几个氨基酸O 2)，这样的蛋白在一般的研究中，如制备相应抗体等研究中可能会有一定的影响，且在对朊蛋白抗性机制研究的过程中，无法满足精确氨基酸位点的研究工作。迫切需要一种定点消除了酶切位点的全真朊蛋白，为传染性海绵状脑病的抗体研制、疾病检测提供有效的反应原。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种消除多余酶切位点的人朊蛋白。本发明的另一目的在于提供一种表达上述蛋白的重组表达载体。本发明提供一种重组人朊蛋白hPrP，其氨基酸序列为(a) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；或(b)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的蛋白hPrP的氨基酸序列(SEQ IDNo. 2)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第101位的赖氨酸(Lysine)替换为丙氨酸(Alanine)，将第110位的赖氨酸(Lysine)替换为丙氨酸(Alanine),将第120位的甘氨酸(Glycine)缺失，不影响其免疫原性。因此，本发明的重组人朊蛋白hPrP还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，具有与重组人朊蛋白hPrP同等活性的由hPrP衍生得到的蛋白质。进一步地，本发明提供了编码重组人朊蛋白hPrP的基因，是如下a)或b)(a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. I所示；或(b)由SEQ ID No. I所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码hPrP的核苷酸序列。
进一步地，本发明提供一种重组表达载体，其为含有以重组人朊蛋白hPrP的编码基因为目的基因的表达盒。优选地，本发明的重组表达载体为pPROEX-htb-hPrP。本发明提供了含有上述重组表达载体的转基因细胞系及重组菌。本发明提供一种构建重组表达载体pPROEX-htb-hPrP的方法，包括以下步骤(I) PCR方法扩增hPrPc基因；(2)将PCR产物和载体pPROEX-htb分别用内切酶BamHI和Hind III双酶切；酶切产物连接后转化感受态细胞，挑取阳性菌落，得到前期表达质粒；(3)以前期表达质粒为模板，以除去hPrPc基因前酶切位点为目的设计引物·，进行PCR反应，将PCR产物转化感受态细胞，选取阳性菌落提取质粒，得到重组表达载体pPROEX-htb-hPrPο其中，步骤(I)所述的PCR方法中所用的引物序列分别为h游引物cgcGGATCCCAAGAAGCGCC CGAAGC，划线部分为保护碱基及BamH I酶切位点，下游引物cccAAGCTTACGATCCTCTCTGGTAATAGG CC，划线部分为保护碱基及 HindIII酶切位点；50 μ L反应体系为10XBuffer 5 μ L，dNTP4 μ L，人全血基因I μ L，上、下游引物各2 μ L，ddH20 35 μ L,高保真DNA聚合酶IyL;PCR反应条件为98 V预变性5min :94 V变性30s，55 °C退火30s，72 V延伸2. 5min, 30 个循环；72°C延伸 IOmin0其中，步骤(2)所述的感受态细胞优选为Tl感受态细胞，所述的连接使用T4 DNA连接酶，反应体系10 μ L，Τ4连接酶IyLAXbuffer 2 μ L，载体和目的片段用量根据实际浓度调整，物质量比为1:30，将总体积控制在10yL，16°C过夜连接。其中，步骤(3)所述引物为PlGAAAACCTGTATTTTCAGGGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGG,P2 CAGGCTTCGGGCGCTTCTTGCCCTGAAAATACAGGTTTTC ；50yL 反应体系为10XBuffer5y L，dNTP4 μ L，前期表达质粒 I μ L，Ρ1、Ρ2 各2 μ L，ddH20 35 μ L,高保真 DNA 聚合酶 I μ L ;PCR反应条件为98 V预变性5min :94 V变性40s，65 °C退火30s，72 V延伸2. 5min, 18 个循环；72°C延伸 IOmin0其中步骤(3)所述的感受态细胞优选为Tl感受态细胞。本发明还提供了一种制备重组人朊蛋白hPrP的方法，其特征在于，包括以下步骤(I)将含有重组人朊蛋白hPrP编码基因的重组表达载体转化入感受态细胞，制得人朊蛋白hPrP表达工程菌；(2)将人朊蛋白hPrP表达工程菌经IPTG诱导表达；将鉴定正确的表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的人朊蛋白hPrP ；(3)将纯化的人朊蛋白hPrP复性后加入rTEV内切酶，切除组氨酸标签，然后再次通过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱除去组氨酸标签和重组rTEV酶，将洗脱收集的液体超滤浓缩，得到重组人朊蛋白hPrP。本发明提供的制备重组人朊蛋白hPrP的方法中，步骤(I)所述重组表达载体优选为pPROEX-htb-hPrP ;所述感受态细胞优选BL21感受态细胞。本发明提供的制备重组人朊蛋白hPrP的方法中，步骤(2)所述的诱导表达是将步骤(I)构建好的人朊蛋白工程菌接种至20mL含有氨苄青霉素50mg/mL的LB培养基中过夜培养(18h左右)，按1%的量接种2L含50mg/mL氨苄青霉素的LB液 体培养基中，37 °C 200rpm培养至细菌生长对数期OD6qq=O. 4-0. 6。加入IPTG，使其终浓度为lmmol/L，37°C 160rpm培养，诱导后6h收集菌液。取ImL表达菌体离心，在沉淀中加入30 μ L PBS悬浮后，再加入30 μ L加样缓冲液混匀(加样缓冲液的配方SDS0. 5g，巯基乙醇lmL，甘油3mL，溴酚蓝4mg，IM pH6. 8 Tris-HCl缓冲液2mL,加蒸懼水定容至IOmL)裂解变性5min, 8000rpm离心后,取10 μ L上清液上样，同时设蛋白标准分子量孔，进行12% SDS-PAGE检测。本发明提供的制备重组人朊蛋白hPrP的方法中，步骤(2)是将鉴定正确的人朊蛋白纯化，具体为将诱导表达后的2L菌液进行12000rpml5min离心，收集沉淀，在沉淀中加入200mL结合缓冲液(8M尿素，20mM Na3PO4^OOmM NaCl、pH8. 0)，超声破碎一直到菌液变得澄清，O. 45 μ mm滤膜过滤。IOOmL结合缓冲液利用重力作用通过IOmL镍-NTA琼脂糖树脂层析柱进行平衡，过滤后的菌液通过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，用200mL结合缓冲液(20倍体积)自然冲洗镍柱以去除杂蛋白，然后用200mL洗脱缓冲液(8M尿素，20mM Na3PO4^OOmMNaCl、pH8. O)进行洗脱，洗下的液体即为纯化好的人朊蛋白hPrP。再进行12% SDS-PAGE检测，western-blot 鉴定。本发明提供的制备重组人朊蛋白hPrP的方法中，步骤(3)所述复性是将纯化好的蛋白装入透析袋中。透析袋经过常规方法处理把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段，在大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和lmmol/LEDTA(pH8. O)中将透析袋煮沸10分钟，用蒸馏水彻底清洗透析袋，放在lmmol/L EDTA (pH8. O)中将之煮沸10分钟，冷却后，存放于4°C，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。取用透析袋是必须戴手套，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净，将纯化好的蛋白装入透析袋中。放入IL透析液A中透析(透析液A配方含有8M尿素，20mM Na3P04、500mMNaCl、10%甘油pH7. 4、IOmM还原型谷胱甘肽)，之后每隔3h弃去IOOmL液体，同时加入IOOmL透析液B (析液B配方20mM Na3PO4^OOmM NaCl ,10%甘油pH7. 4、IOmM还原型谷胱甘肽)，经过20次透析后弃去500mL透析液，再补充500mL透析液B，之后完全在透析液B中透析5h，，然后放入透析液C中(透析液C配方20mM Na3PO4,10%甘油pH7. 4)透析5h，收集复性后的蛋白进行浓度测定。本发明提供的制备重组人朊蛋白hPrP的方法中，步骤(3)所述加入rTEV蛋白酶，切除组氨酸标签的具体步骤为按每Iml浓度为lmg/ml添加500U的rTEV蛋白酶(上海前尘生物科技有限公司)，4°C过夜消化后，通过Iml的镍-NTA琼脂糖树脂层析柱(使用前用IOml透析液C平衡)，收集到的液体就是最终的人朊蛋白hPrP，即除去了组氨酸标签及rTEV蛋白酶的人朊蛋白hPrP。本发明提供的制备重组人朊蛋白hPrP的方法，还包括对复性后的重组人朊蛋白hPrP 进行 western-blot 鉴定。本发明还提供了含有重组人朊蛋白hPrP的试剂盒或诊断试剂。本发明将定点突变技术融入到传统的蛋白表达技术中，在按传统的技术构建好表达载体后通过定点突变的方法使目的基因上游的酶切位点进行突变消除，从而构建重组人朊蛋白的全真表达载体，进一步表达获得重组人朊蛋白。实验证明本发明制备得到的重组人朊蛋白hPrP具有很好的特异性和免疫反应性。
图I为第一次PCR扩增得到的人朊蛋白hPrP基因的电泳图，其中M :marker ；1 :人朊蛋白DNA序列，含有上下游酶切位点，约630个碱基。图2为pPROEX-htb质粒经过双酶切之后的电泳图，其中M :marker ；1 :双酶切之后的质粒；2 :双酶切之前的质粒。图3为表达载体pPROEX-htb的结构图谱。图4为重组表达载体pPROEX-htb-hPrP酶切位点突变前后的序列对照图，其中I为突变前载体序列，2为突变后载体序列，灰色背景的碱基序列为定点突变去除的部分。
图5为在37 °C，160rpm、不同浓度IPTG下人朊蛋白hPrP表达情况，图中，MiMarker ;1、2、3、4 :诱导前 IPTGO. 2mM、0. 4mM、0. 6mM、l. 5mM ;箭头示目的条带。图6为本发明纯化后的重组人朊蛋白hPrP通过rTEV酶切除组氨酸标签结果电泳图，其中，M =Marker, 1-2 :经rTEV酶切除后的重组人朊蛋白hPrP，3 :未经rTEV酶切除的朊蛋白。图7本发明复性后的重组人朊蛋白hPrP与朊蛋白特异性单抗AH6和3F4的western-blot鉴定结果,其中，M Marker,0 :空白对照；1_5分别为不同浓度的朊蛋白(上样量不一样l，5yL ;2-3，10yL ;4-5，15yL)经单抗AH6处理结果；6 :单抗3F4处理结果。图8为重组人朊蛋白hPrP多克隆抗体的western-blot鉴定结果。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中所用的生化试剂为市售。实施例I重组表达载体pPROEX-htb-hPrP的构建I、PCR扩增人朊蛋白多肽基因(hPrPc基因)弓丨物上游cgcGGATCCCAAGAAGCGCC CGAAGC (划线部分为保护碱基及BamH I,酶切位点)，下游cccAAGCTTACGATCCTCTCTGGTAATAGG CC (划线部分为保护碱基及Hind III酶切位点)引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。模板人全血(在体检中心收集的健康人群的血液)基因为模板(所用全血基因提取试剂盒购自鼎国生物技术有限公司)。PCR体系及条件采用高保真PCR试剂盒(全式金生物技术有限公司)进行PCR扩增，反应体系总体积为50 μ L。反应体系
权利要求
1.一种重组人朊蛋白hPrP，其氨基酸序列为 a)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；或 b)SEQID No. 2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求I所述重组人朊蛋白hPrP的基因，是如下a)或b): a)其核苷酸序列如序列表中SEQID No. I所示；或 b)由SEQID No. I所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码hPrP的核苷酸序列。
3.—种重组表达载体，其为含有权利要求2所述基因的表达盒。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其为pPROEX-htb-hPrP。
5.含有权利要求3或4所述重组表达载体的细胞系及重组菌。
6.一种构建权利要求4所述重组表达载体的方法，包括以下步骤1) PCR方法扩增hPrPc基因； 2)将PCR产物和载体pPROEX-htb分别用内切酶BamHI和HindIII双酶切；酶切产物连接后转化感受态细胞，挑取阳性菌落，得到前期表达质粒； 3)以前期表达质粒为模板，以除去hPrPc基因前的酶切位点为目的设计引物，进行PCR反应，将PCR产物转化感受态细胞，选取阳性菌落提取质粒，得到重组表达载体pPROEX-htb-hPrPο
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤I)所述的PCR方法中所用的引物序列分别为 上游引物:cgcGGATCCCAAGAAGCGCCCGAAGC,划线部分为保护碱基及BamH I酶切位点， 下游引物cccAAGCTTACGATCCTCTCTGGTAATAGGCC,划线部分为保护碱基及Hind III酶切位点； 50 μ L反应体系为10 XBuffer 5 μ L，dNTP4 μ L，人全血基因I μ L，上、下游引物各2 μ L，ddH20 35 μ L,高保真 DNA 聚合酶 IyL; PCR反应条件为98°C预变性5min :94°C变性30s，55。。退火30s，72。。延伸2. 5min，30个循环；72°C延伸IOmin。
8.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤3)所述引物为Pl GAAAACCTGTATTTTCAGGGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGG,P2 CAGGCTTCGGGCGCTTCTTGCCCTGAAAATACAGGTTTTC ； 50 μ L 反应体系为10 X Buffer 5 μ L，dNTP4 μ L，前期表达质粒 I μ L，PU P2 各 2 μ L，ddH20 35 μ L,高保真DNA聚合酶IyL; PCR反应条件为98°C预变性5min :94°C变性40s，65。。退火30s，72。。延伸2. 5min, 18个循环；72°C延伸IOmin。
9.一种制备权利要求I所述重组人朊蛋白hPrP的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将权利要求3或4所述重组表达载体转化入感受态细胞，制得人朊蛋白hPrP表达工程菌； 2)将人朊蛋白hPrP表达工程菌经IPTG诱导表达；将表达产物过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱，洗脱得到纯化的人朊蛋白hPrP ；3)将纯化的人朊蛋白hPrP复性后加入rTEV内切酶，切除组氨酸标签，然后再次通过镍-NTA琼脂糖树脂层析柱除去组氨酸标签和重组rTEV酶，将洗脱收集的液体超滤浓缩，得到重组人朊蛋白hPrP。
10.含有权利要求I所述的重组人朊蛋白hPrP的检测试剂盒或诊断试剂。
全文摘要
本发明提供了一种重组人朊蛋白hPrP及其制备方法和应用，该重组hPrP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明以人全血基因为模板，以SEQ ID No3、4所示核苷酸序列为引物通过PCR方法获得带有酶切位点的人朊蛋白DNA序列，将其连接到pPROEX-htb质粒上，通过定点突变技术除去表达载体中目的基因之前的多余酶切位点，获得hPrP全真表达载体。将该载体在大肠杆菌中表达、过高亲和力层析柱纯化、复性，得到了重组人朊蛋白。本发明所得到的重组人朊蛋白hPrP具有较好的生物活性，可用于开发人朊蛋白多克隆抗体、单克隆抗体以及针对人的朊病毒病诊断试剂盒。
文档编号C12N15/66GK102887949SQ20121037479
公开日2013年1月23日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者杨利峰, 赵德明, 杨秀进, 王伊琴, 宋志琦, 姚皓, 周向梅, 尹晓敏, 张爽 申请人:中国农业大学