专利名称：肺炎链球菌多重降落pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及肺炎链球菌感染的分子诊断技术领域，具体涉及多重降落PCR检测方法在下呼吸道标本中肺炎链球菌(StrepiococciAs pneumoniae)检测中的应用。
背景技术：
肺炎链球菌又名肺炎球菌，是社区获得性肺炎(CAP)的主要病原体，培养要求较高。易发生肺炎链球菌肺部感染的高危人群有免疫缺陷者、呼吸道病毒感染后、婴幼儿、年老体弱者。肺炎链球菌是慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者发生CAP的主要病因，此外肺炎链球菌还可引起脑膜炎、中耳炎及脓毒血症等疾病。Corless, C. E 等(Corless, C. E. , et al. , Simultaneous detection ofNeisseria meningitidis，HaemophiIus influenzae，and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR. J ClinMicrobiol, 2001. 39(4): p. 1553-8.)建立了以/77,基因为靶标检测肺炎链球菌的实时PCR，支持基因为肺炎链球菌所固有。Murdoch，D. R报道了以基因为靶标建立的PCR可将部分甲型溶血性链球菌误鉴定为肺炎链球菌(Murdoch, D. R. , Molecular geneticmethods in the diagnosis of lower respiratory tract infections. APMIS, 2004.112(11-12) : p. 713-27.)同时针对肺炎链球菌的多个基因进行检测可提高检测方法的特异性。Korbie, D. J.等(Korbie, D. J. and J. S. Mattick, Touchdown PCR for increasedspecificity and sensitivity in PCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3(9):p. 1452-1456.)发现降落PCR可提高PCR的特异性与灵敏度。当前尚无同时针对肺炎链球菌rRNA基因以检测肺炎链球菌的多重PCR报道。本发明建立的多重降落PCR可直接检测下呼吸道标本中的肺炎链球菌，费时少，具高度特异性与灵敏性，有利于肺炎链球菌感染的快速诊断与流行病学调查。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可快速特异检测下呼吸道标本中/—朦的多重PCR检测试剂盒及检测方法。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术发案实现的
一种/歹炎链球菌多重降落PCR检测试剂盒，包括10XPCR缓冲液，MgCl2, dNTP, TaqDNA聚合酶，BSA,肺炎链球菌阳性对照DNA，3对肺炎链球菌引物；
所述3对肺炎链球菌引物对序列如下
第I对
SP_recA-F :5’ - CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC -3’ (SEQ ID NO. I)
SP_recA-R :5’ - CAGACTCAGGAGAGCAAGGT -3’ (SEQ ID NO. 2)；
第2对
SP_ply-F:5’ - GCCTCTATCCTGGAGCACTT -3’ (SEQ ID NO. 3)SP_ply-R:5’ - AGCAGCCTCTACTTCATCACT -3’ (SEQ ID NO. 4)；
第3对
SP_16S rRNA-F :5’ - CTGTGGCTTAACCATAGTAG -3’ (SEQ ID NO. 5)
SP_16S rRNA-F: 5’ - CTAGCACTCATCGTTTACA -3’ (SEQ ID NO. 6)。本发明还公开了应用上述试剂盒的检测方法
(一)提取待检样本DNA
(二)多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的recA、ply、16SrRNA基因，具体步骤如下
反应体系25 μ
H2O9. 05 μ
缓冲液(10 X PCR)2.5 μ
BSA(10 mg/ml)O. 25 μ
SP_recA-F (10 Mmol/L)3 μ
SP_recA-R (10 Mmol/L)3μ1
SP_ply-F (10 Mmol/L)0. 25 μ
SP_ply-R (10 Mmol/L)0. 25 μ
SP_16S rRNA-F (10 Mmol/L) 0. 5μ1 SP_16S rRNA-R (10 Mmol/L) 0.5 μMgCl2 (25 mM)3μ1
dNTP (10 mM)0. 5 μ
Taq DNA 聚合酶(5 U/μΙ)0. 2 μ
DNA模板2 μ
3对肺炎链球菌引物为
SP_recA-F :5’ - CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC -3’ (SEQ ID NO. I)
SP_recA-R:5，- CAGACTCAGGAGAGCAAGGT -3，’ (SEQ ID NO. 2)
SP_ply-F:5’ - GCCTCTATCCTGGAGCACTT -3’ (SEQ ID NO. 3)
SP_ply-R:5’ - AGCAGCCTCTACTTCATCACT-3’ (SEQ ID NO. 4)
SP_16S rRNA-F:5’ - CTGTGGCTTAACCATAGTAG -3，(SEQ ID NO. 5)
SP_16S rRNA-R:5’ - CTAGCACTCATCGTTTACA -3’ (SEQ ID NO. 6)
(三)PCR反应循环参数如下
94 V 5 min ；94 V 30s, 65 V (每循环降低 0. 5°C ) 30 s, 72 V I min，20 个循环；94 0C 30s, 55 °C 30s, 72 °C I min, 20 个循环；72 °C 7 min ；
(四)电泳检测鉴定
对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有217 bp,581 bp,735bp条带中的2条或3条则代表检出肺炎链球菌。有益效果本发明所建立的多重降落PCR可克服常规培养的耗时长、灵敏度低等问题，具有快速、简便、特异、灵敏度高等特征。可于当天出检测结果报告，可同时检测肺炎链球菌的3个基因，对肺炎链球菌DNA的检测下限达5 pg0该多重降落PCR可用于肺炎链球菌感染的快速诊断与流行病学调查。
图I为实施例I的检测结果；泳道I 一 13模板依次对应为大肠埃希氏菌iEscherichia coli)、金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aureus)Λ铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌U(lebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌{Acinetobacter baumannii)、卡它莫拉菌(Moraxella (Branhamella) catarrhaliS、、襄肠球菌IEnterococcus耻垢分枝杆菌Qfycobacterium 應iis)、流感嗜血杆菌{Streptococcus pneumoniae)λ^^ (Mycobacterium tuberculosi5*)Λb感嗜血杆菌、牛分枝杆菌牛分枝杆菌BCG (Mycobacterium bo vis占《 );泳道M为DL2000 DNA分子质量标准；泳道14 一 15模板依次为阳性对照肺炎链球菌pneumoniae)与阴性对照。图2为实施例2检测结果；泳道M为DL2000 DNA分子质量标准；泳道I 一 8模板为临床痰标本基因组DNA，泳道4、5于215 bp.620 bp.821 bp处出现3条对应大小的条带，判为检出肺炎链球菌；泳道9、10为阳性对照与阴性对照。
具体实施方式
实施例I:
选取分别含有文肠埃希氏菌{Escherichia coli )、金黄色葡萄球菌{Staphylococcusaureus ) Λ 铜绿假单胞鬼{Pseudomonas aeruginosa ) Λ 肺炎克雷伯鬼{Klebsiellapneumoniae)、鲍曼不动杆 HAcinetobacter baumannii)Λ 卡它莫拉 UMoraxella(Branhamella) catarrhalis\ 类肠球 HEnterococcus faecalis)^ 耻垢分枝杆菌(Mycobacterium 6^9#細iis)、流感嗜血杆菌 ^Streptococcus 應结核分枝杆菌(Mycobacterium型流感嗜血杆菌、牛分枝杆菌{Mycobacterium bovis、、
牛分枝杆菌BCG ^Mycobacterium bo vis Ad)的痰标本，对本发明建立的多重PCR体系的特异性进行验证。痰标本预处理痰标本应用生理盐水洗涤2次，加入等量的1%胰酶(当天现配现用)于37 Γ消化90 min。提取痰标本中的细菌DNA :取已消化的痰标本I. 5 ml用Takara minibest细菌基因组提取试剂盒(Takara，大连宝生)提取痰标本中的细菌DNA。提取的DNA直接用于PCR扩增或置于一 20 °C保存备用。PCR扩增总体系25 μ ，在200 μ PCR小管内依次加入9. 05μ1双蒸水，2. 5μ1缓冲液(10XPCR)，BSA(10 mg/ml)0· 25μ1、引物 SP—recA-F (10 Wnol/L) 3 μ ，SP—recA-R (10μ mol/L) 3gl，SP—ply-F (10 Wnol/L) 0. 25 μ ，SP—ply-R : (10 Wnol/L) 0. 25 μΙ,ΞΡ _16SrRNA-F (10 Wnol/L)0· 5μ1，SP _16S rRNA-R (10 Wnol/L)0· 5μ1，3μ1 MgCl2 (25 mM)，0.5 μ dNTP (10 mM)，0.2 μ Taq DNA聚合酶(5υ/μ1)，2 μ 提取的痰标本基因组DNA。模板依次对应为大肠埃希氏菌^(97i)、金黄色葡萄球菌(5^^/7知7<9^(9^心aureus)Λ铜绿假单胞菌〈Pseudomonas aeruginosa )、肺炎克雷伯菌 iKlebsiella pneumoniae )、鲍曼不动杆菌iAcinetobacter baumannii)、卡它莫拉菌Ο οΓαχθΙΙα (Branhamella)catarrhalis\ 类肠球菌 iEnterococcus faecalis)^ 耻垢分枝杆菌{Mycobacterium
應iis)、流感嗜血杆菌^Streptococcus 應结核分枝杆菌{Mycobacteriumtuberculosis')、b型流感嗜血杆菌、牛分枝杆菌(Mycobacterium AoKis)、牛分枝杆菌BCG(Jfycobacterium bovis BCG)；同时设肺炎链球菌阳性模板对照与阴性对照(双蒸水作为模板)。手指轻弹混匀，短暂离心后放入PCR仪。3对肺炎链球菌引物为SP_16S rRNA-F和SP_16S rRNA-R的扩增片断长度217bp ； SP_ply-F 和 SP_ply-R 的扩增片断长度 581 bp ；SP_recA-F 和 SP_recA_R 扩增片断长度 735 bp ο设置PCR反应循环参数94 V 5min ；94 V 30 s, 65 V (每循环降低O. 5 V)30 S，72 0C I min，20个循环；94 °C 30 s’ 55 °C 30 s，72 °C I min, 20 个循环；72 °C7 min。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为5 μ 与6X上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于I X TAE溶液中，在100V电压下，电泳30 min,电泳后经I μ@/μ1的溴化乙锭浸泡染色10 — 20 min后，于凝胶成像分析系统中分析检测结果。泳道I 一 13模板依次对应为大肠埃希氏菌(Mscherichia coli)、金黄色葡萄球菌{Staphylococcus atfreiAs)、铜绿假单 胞菌 iPsGudomorms aerwgifliosa)、肺炎克雷伯菌{Klebsiella鲍曼不动杆菌(Acine tobac ter baumannii )、卡它莫拉菌 iMoraxella (Branhamella) ca tarrhali51)、1 肠球菌iEnterococcus /aeca/is)、耻垢分枝杆菌{Mycobacterium 流感嗜血杆菌{.Streptococcus 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosi5)>b感嗜血杆菌、牛分枝杆菌AoKis)、牛分枝杆菌BCG Qfycobacterium bovis沒《 );均无条带出现，泳道14阳性对照于217 bp,581 bp,735 bp处出现对应大小的条带，泳道15阴性对照无条带。证实本发明所建立的多重降落PCR体系具有特异性(见图I)。实施例2:
痰标本预处理痰标本应用生理盐水洗涤2次，加入等量的1%胰酶(当天现配现用)于37 °C消化 90 min。提取痰标本中的细菌DNA :取已消化的痰标本I. 5 ml用Takara minibest细菌基因组提取试剂盒(Takara，大连宝生)提取痰标本中的细菌DNA。提取的DNA直接用于PCR扩增或置于一 20 °C保存备用。PCR扩增总体系25 μ ，在200 μ PCR小管内依次加入9· 05μ1双蒸水，2· 5μ1缓冲液(10XPCR)，BSA(10 mg/ml)0. 25μ1、引物 SP_recA-F (10 Mmol/L) 3 μ , SP_recA-R (10μ mol/L) 3Pl，SP_ply-F (10 Mmol/L) 0. 25 μ , SP_ply-R (10 Mmol/L) 0. 25 μΙ,ΞΡ _16SrRNA-F (10 Mmol/L) 0. 5μ1, SP _16S rRNA-R (10 Mmol/L) 0. 5μ1,3μ1 MgCl2 (25 mM), 0. 5μ dNTP (10 mM), 0. 2 μ Taq DNA聚合酶(5υ/μ1)，2 μ 提取的痰标本基因组DNA。同时设/歹炎慈獄朦阳性模板对照与阴性对照(双蒸水作为模板)。手指轻弹混匀，短暂离心后放入PCR仪。3对肺炎链球菌引物为SP_16S rRNA-F和SP_16S rRNA-R的扩增片断长度217bp ； SP_ply-F 和 SP_ply-R 的扩增片断长度 581 bp ；SP_recA-F 和 SP_recA_R 扩增片断长度 735 bp ο设置PCR反应循环参数94 V 5min ；94 V 30 s, 65 V (每循环降低0.5 V)30 S，72 0C I min，20个循环；94 °C 30 s’ 55 °C 30 s，72 °C I min, 20 个循环；72 °C7 min。
扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，上样量为5 μ 与6X上样缓冲液混匀后加入胶孔中，于I X TAE溶液中，在100V电压下，电泳30 min,电泳后经I μ8/μ1的溴化乙锭浸泡染色10 — 20 min后，于凝胶成像分析系统中分析检测结果。如阴性对照无条带，阳性对照于217 bp,581 bp,735 bp处出现对应大小的条带，检测样本出现217 bp,581 bp,735 bp条带中的2条或3条则代表检出肺炎链球菌(见图2);如阳性对照于217 bp,581 bp,735 bp处未出现对应大小的条带或阴性对照出现非特异性条带，则判为实验失败，需重新检测。
权利要求
1.一种肺炎链球菌多重降落PCR检测试剂盒，包括=IOXPCR缓冲液，MgCl2, dNTP, TaqDNA聚合酶，BSA,肺炎链球菌阳性对照DNA，3对肺炎链球菌引物；所述3对肺炎链球引物为SP_recA-F:5’ - CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC -3’SP_recA-R:5， -CAGACTCAGGAGAGCAAGGT -3，SP_ply-F:5’ - GCCTCTATCCTGGAGCACTT -3’SP_ply-R:5’ - AGCAGCCTCTACTTCATCACT-3’SP_16S rRNA-F:5’ - CTGTGGCTTAACCATAGTAG -3’SP_16S rRNA-R:5’ - CTAGCACTCATCGTTTACA -3’。
2.一种肺炎链球菌多重降落PCR检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (1)提取待检样本DNA (2)多重PCR法扩增检测待检样本DNA中的recA、Ply、16SrRNA基因，具体步骤如下 反应体系25 μ ，包括 H2O 9. 05 μ ，缓冲液(10 X PCR) 2. 5 μ ，BSA (10 mg/ml) O. 25μ , SP_recA-F (10 Mmol/L)3 μ , SP_recA-R (10 μ mol/L) 3μ1，SP_ply-F (10 Mmol/L)0.25 Pl，SP_ply-R :(10 Mmol/L) 0. 25 μΙ,ΞΡ _16S rRNA-F (10 Mmol/L) 0. 5 μΙ,ΞΡ _16SrRNA-R (10 Mmol/L) 0.5 μ ,MgCl2 (25 mM) 3 μ , dNTP (10 mM) 0.5 μl, aq DNA 聚合酶(5U/μΙ) 0. 2 μ , DNA 模板 2 μ 3对肺炎链球引物为SP_recA-F :5’ - CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC -3’SP_recA-R:5， -CAGACTCAGGAGAGCAAGGT -3，SP_ply-F :5’ - GCCTCTATCCTGGAGCACTT -3’SP_ply-R:5’ - AGCAGCCTCTACTTCATCACT-3’SP_16S rRNA-F :5’ - CTGTGGCTTAACCATAGTAG -3’SP_16S rRNA-R:5’ - CTAGCACTCATCGTTTACA -3’ (3)PCR反应循环参数如下 94 °C 5min ；94 V 30s, 65 V (每循环降低 0. 5 V ) 30 s, 72 V I min，20 个循环；94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C I min, 20 个循环；72 °C 7 min (4)电泳检测鉴定 对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有217 bp,581 bp,735bp条带中的2条或3条则代表检出肺炎链球菌。
全文摘要
本发明涉及一种肺炎链球菌多重降落PCR检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒包括10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，TaqDNA聚合酶，BSA，肺炎链球菌阳性对照DNA，序列如SEQIDNO.1-6所示的3对肺炎链球菌引物。本发明设计了3对肺炎链球菌的特异性引物，并建立了可检测肺炎链球菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。本发明建立的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法快速、简便、特异、灵敏，可用于肺炎链球菌感染的快速诊断与流行病学调查。
文档编号C12Q1/68GK102888460SQ20121038702
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者邵世和, 侯艳娇, 罗欲承, 邵晨, 管贤伟, 丁杰, 唐国建 申请人:江苏大学