专利名称：抗人cd146的单克隆抗体，包含其的组合物，检测可溶性cd146的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和生物技术领域。具体地说本发明涉及一组抗人⑶146的鼠单克隆抗体，这组抗体能够在生化、细胞和组织水平特异性识别人源⑶146蛋白。本发明还涉及一种夹心ELISA检测可溶性CD146的方法，在这种检测方法中捕获抗体是本发明中涉及的鼠单克隆抗体，检测抗体是用生物素标记的发明专利ZL 991075862中涉及的鼠单克隆抗体AA98。
背景技术：
⑶146，又名MUC18，Mel-CAM/MCAM,是一种属于免疫球蛋白超家族的细胞黏附分子。CD146胞外有五个免疫球蛋白样结构域(V-V-C2-C2-C2) (HolnessandSimmons 1994)，并被高度糖基化，介导钙离子非依赖的细胞间相互黏附。⑶146最早发现是黑色素瘤的标志分子，参与黑色素瘤的转移及恶化(Lehmann，Riethmuller et al. 1989 ；Sers,Kirsch et al. 1993)。CD146 在黑色素肿瘤中的异常高表达增强了肿瘤细胞之间的黏附，并对于肿瘤的侵袭和转移非常重要(Johnson，Rothbacheret al. 1993)。研究表明，⑶146的表达与黑色素瘤细胞的转移能力直接相关，而在不表达CD146的黑色素瘤细胞中过量表达CD146可以显著增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力(Bani，Rak et al. 1996 ；Shih, Speicher et al. 1997 ；Xie, Luca et al. 1997)。此外，CD 146 也表达在少量的正常组织中，比如平滑肌，血管内皮和滋养层等(Shih 1999)。同时，⑶146也被广泛认为是血管内皮细胞的特异性标志分子(Bardin，Franceset al. 1996 ；Bardin, Anfosso et al. 2001)。在之前的研究中，抗人CD146抗体被应用检测血液中的循环内皮细胞(George, Poncelet et al. 1991 ；Bardin, George et al. 1996 ；Solovey, Gui et al. 2001)。由于这一特征,在伴有内皮损伤、脱落现象的某些疾病中，⑶146可作为疾病进程的参考指标。另有研究表明⑶146分子还表达于单核细胞，有报道在激活的T淋巴细胞上也有高表达(Pickl，Majdic et al. 1997)。像其它很多黏附分子一样，体内CD146分子以细胞膜和可溶形式(soluble CD146，sCD146)存在(Neidhart，Wehrliet al. 1999 ；Bardin, Moal et al. 2003)。研究表明sCD146在风湿性关节炎滑液以及慢性肾衰竭患者的血清中的表达水平明显高于正常人。抗人CD146抗体在动物实验中体现出了很强的抑制肿瘤生长的治疗效果。Mills等开发的抗CD146全人抗体，ABX-MAl在裸鼠模型中显著地抑制黑色素肿瘤的生长、侵袭以及向肺部的转移(Mills,Tellez et al. 2002)。发明专利ZL 991075862中所述，开发的抗CD146鼠单克隆抗体AA98具有抑制肿瘤血管生成的作用，并在多种裸鼠荷瘤实验中明显抑制肿瘤(例如肝癌、胰腺癌等)的生长(Yan，Lin et al. 2003)。进一步的研究还揭示了AA98的抑制肿瘤血管生成的机制是通过抑制MAPK磷酸化以及NF κ B活化实现的(Bu，Gaoet al. 2006)。虽然抗人源⑶146的抗体已有一些报道，但是这些抗体对不同的血管内皮组织却有着不同的结合活性。例如S-endol能够结合各种类型的血管的内皮细胞，包括动脉、细动脉、静脉、小静脉、毛细血管、高内皮微静脉和淋巴血管系统等(George，Poncelet etal. 1991)。而另一株抗CD146抗体MUC18只结合毛细血管和高内皮微静脉(Kuzu，Bicknellet al. 1993)。S-endol结合胳带静脉内皮组织而MUC18不结合(Bardin, Frances etal. 1996)。此外，P1H12能够同时结合肿瘤和正常组织的血管内皮细胞(St Croix7Rago etal. 2000)，而AA98却特异性的结合肿瘤组织的血管内皮细胞(Yan, Lin et al. 2003)。这些证据表明，很可能不同的抗体结合表位在不同的组织和微环境中的暴露情况有所差异。因此，针对CD146蛋白上不同表位开发抗体，并研究其对于不同组织的结合能力，对于阐明⑶146在血管内皮细胞上的功能非常必要。
发明内容
本发明利用天然纯化的CD146蛋白免疫小鼠，获得杂交瘤细胞。用ELISA的方法筛选与重组表达的⑶146蛋白胞外区有强结合能力的抗体，获得六株抗体，分别命名为AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7，同时获得分泌这些抗体的杂交瘤细胞，依次是8E8、8F4、A5、GlO、H5①和H5②。这六株抗体均属IgGl，K亚型。ELISA和免疫印迹的实验证实了这些抗体和⑶146分子的特异性结合。利用重组表达的⑶146蛋白胞外不同的结构域以及免疫印迹的方法，证实AAl和AA2识别表位(序列为SEQ ID NO : I的人⑶146序列中的位置24-128)位于第一个IgV结构域，而AA3、AA4、AA5和AA7识别表位(序列为SEQ ID NO 1的人⑶146序列中的位置335-400)位于第二个IgC2结构域。因此，这六株抗体依照不同的抗原表位分成两类V1类(包括 AAl 和 AA2)和 C2-2 类(包括 AA3、AA4、AA5 和 AA7)。细胞免疫荧光，免疫沉淀及免疫组化实验发现Vl类抗体能够在分子、细胞及组织水平同时识别天然构象和变性的CD146蛋白质，而C2-2类抗体只识别变性的CD146蛋白质。这证实了不同的抗原表位在不同情况下的暴露有所不同。本发明同时利用Vl类抗体，如AAl和生物素标记的发明专利ZL991075862中涉及的鼠单克隆抗体AA98，开发了一套夹心ELISA的方法，用于检测溶液和体液中可溶性0)146分子。相比之前提供的商业化检测方法报道(CyQuant ELISA assay kit,Bioxytex,Marseille, France)的双抗夹心ELISA (灵敏度为10ng/ml),本发明的夹心ELISA方法灵敏度提高了一个数量级，达到lng/ml。此方法能够用于人血液及脑脊液中可溶性⑶146的检测，并在CD146表达异常的病症中具有临床诊断应用价值。运用本发明中的方法，发现在系统性血管炎等自身免疫病中，病人血清中的CD146分子含量显著升高，对于临床诊断具有指导意义和应用价值。具体地，本发明涉及一种人⑶146抗原表位，其氨基酸序列为SEQ IDNO 24或SEQID NO 25 所示。在一个实施方案中，本发明涉及一种抗人CD146抗体，其特征在于其能够特异性识别上述人⑶146抗原表位。优选地,所述抗人⑶146抗体特征在于包括抗体重链和抗体轻链，
其中所述抗体重链包括作为⑶R的由SEQ ID NO 26的氨基酸序列组成的⑶R1，由SEQ ID NO 27的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQ ID NO 28的氨基酸序列组成的CDR3组成，所述抗体轻链包括作为⑶R的由SEQ ID NO 29的氨基酸序列组成的⑶R1，由SEQID NO 30的氨基酸序列组成的⑶R2和由SEQ IDNO 31的氨基酸序列组成的⑶R3组成。更优选地，所述抗体的重链由SEQ ID NO :32的氨基酸序列组成，轻链由SEQ IDNO 33的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，本发明涉及一种抗人⑶146抗体，特征在于包括抗体重链和抗体轻链，其中所述抗体重链包括作为⑶R的由SEQ ID NO 34的氨基酸序列组成的⑶R1，由SEQ ID NO 35的氨基酸序列组成的CDR2和由SEQID NO 36的氨基酸序列组成的CDR3组成，所述抗体轻链包括作为⑶R的由SEQ ID NO 37的氨基酸序列组成的⑶Rl，由SEQID NO 38的氨基酸序列组成的⑶R2和由SEQ IDNO 39的氨基酸序列组成的⑶R3组成。优选地，所述抗体的重链由SEQ ID NO 40的氨基酸序列组成，轻链由SEQ ID NO 41的氨基酸序列组成。在本发明的另一方面，还涉及上述抗人CD146的抗体在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的应用。优选地，所述肿瘤是黑色素瘤、肝癌，胰腺癌。在本发明的另一个方面，还涉及上述抗人⑶146的抗体在制备用于靶向⑶146的人体肿瘤的成像定位诊断的诊断剂中的应用。在另一个方面，本发明还涉及一种组合物，例如用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含上述任一方面的抗人⑶146抗体，和药用载体。用于本文时，“药用载体”包括生理适合的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓试剂等。优选地，所述载体适合于静脉内的、肌内的、皮下的、肠胃外的、脊柱的或表皮的施用(例如，通过注射或灌输)。通过许多本领域已知的方法可以施用本发明的组合物。如本领域技术人员将理解，施用路径和/或模式将取决于所需结果而变化。为了通过某些施用路径来施用本发明化合物，用一种材料来包被化合物，或与一种材料共同施用化合物以预防其失活可能是必需的。例如，可以以适当载体，例如脂质体或稀释剂来给受试者施用所述化合物。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药用载体包括用于即时制备灭菌的可注射溶液或分散体的灭菌水溶液或分散体和灭菌粉末。将这些介质和试剂用于药用活性物质的应用为本领域所知。在用于本文时，短语“肠胃外的施用”和“经肠胃外施用”表示除肠内的和局部施用以外的通常通过注射的施用模式，包括但不局限于，静脉内的、肌内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的、硬膜外的、胸骨内的注射和灌输。无论选择何种施用路径，通过为本领域技术人员已知的常规方法，将可以以适合的水合形式和/或本发明的药物组合物形式使用的本发明的化合物配制成可药用剂型。对于特定患者、组合物和施用方式，本发明药物组合物的活性成分的实际剂量水平可以变化以获得有效实现理想的治疗反应而不会对患者具有毒性的活性成分的量。选定的剂量水平将取决于许多药物动力学因素，其包括所用的本发明特定组合物的活性，施用的路径，施用的时间，所用的特定化合物的排泄率，治疗的持续时间，与所用的特定化合物结合使用的其它药物、化合物和/或物质，待治疗的患者的年龄、性别、体重、疾病状况、一般健康和以前的疾病史和医学领域众所周知的类似因素。所述组合物必须是无菌且流体的，以到达组合物可以通过注射器进行传递的程度。除了水之外，载体优选是等渗缓冲盐溶液。在另一个方面，本发明还涉及分泌抗人CD146抗体的杂交瘤细胞株，保藏号分别为 CGMCC NO 2310 和 CGMCC NO :2311。在另一个方面，本发明还涉及编码能与下面定义的各个另外抗体链一起装配的多肽的核酸，其中所述多肽是下述多肽的任一种a)抗体重链，其为上述所定义的抗体重链之一；b)抗体轻链，其为上述所定义的抗体轻链之一。同时，本发明还涉及包括按照权利要求11的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。以及包括所述表达载体的原核或真核宿主细胞。在本发明的另一个方面，还涉及一种制备结合人CD146的抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达上述编码抗体重链的核酸和编码抗体轻链的核酸，并且从所述细胞中回收所述多肽。在本发明的另一个方面，涉及一种检测人⑶146的方法，其利用上述的抗人⑶146抗体，通过酶联免疫吸附法进行。优选地，所述酶联免疫吸附法是夹心酶联免疫吸附法，其中将上述的抗人CD146抗体的一种或多种作为捕获抗体，将中国专利ZL 991075862中的鼠单克隆抗体AA98作为检测抗体。更优选地，所述人⑶146存在于体液中。甚至更优选地，所述体液是组织液，血清，淋巴液或脑脊液。所述体液可采自系统性血管炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症以及格林巴利综合症等自身免疫性疾病病人或/和慢性肾衰等病症的病人。在本发明的另一个方面，还涉及所述抗人CD146的抗体的衍生物，其中所述衍生物为所述抗体与生物标记物(如生物素、HRP、碱性磷酸酶、FITC、PE、Cy3、Cy5等常规荧光染料、纳米磁珠等纳米材料)、抗肿瘤药物(如现有技术已知的卡钼、顺钼、五氟尿喃唳等)、毒素(如蓖麻毒素、淋巴毒素等)、放射活性剂(如m碘、9°钇、放射性铜等)结合的产物。本领域的普通技术人员基于说明书关于抗人CD146抗体的教导，结合现有技术的知识，完全可以毫无困难地获得上述衍生物，进而确定衍生物的效果。本发明的创新点在于(I)研制了一组针对人CD146蛋白的鼠单克隆抗体；(2)揭示了这组抗⑶146抗体识别的抗原表位，并证实了识别不同表位的抗体，在分子、细胞及组织水平上对于⑶146蛋白的结合有显著差别；(3)开发了一种高灵敏度的夹心ELISA方法用于可溶性CD146分子的检测。
图I :AA1-AA7特异识别重组人源⑶146分子胞外区段蛋白。图2 :各种⑶146胞外重组蛋白示意图。
图3 AA1-AA5和AA7的抗原表位鉴定。上图是D1-D5的蛋白电泳图。下图是分别利用AA1-AA5和AA7进行免疫印迹实验检测其与D1-D5的结合能力。图4 AA1-AA5和AA7在免疫印迹中识别还原和非还原⑶146蛋白。泳道1_6是非还原的A375细胞裂解液，泳道7-12是还原的A375细胞裂解液。图5 AA1-AA5和AA7用于流式细胞术的⑶146分子检测。图中mlgG作为阴性对照。只有AAl和AA2识别活细胞中的⑶146分子。图6 AA1-AA5和AA7用于细胞免疫荧光实验检测细胞膜上⑶146。AA98作为实验的阳性对照，mlgG作为实验的阴性对照。只有AAl和AA2以及AA98能够结合细胞膜上⑶146，箭头仅示其中之一。图7 AA1-AA5和AA7用于免疫沉淀实验捕获细胞裂解液中的⑶146。泳道1_7是分别用mlgG，AA1-5及AA7进行免疫沉淀捕获的蛋白复合物，泳道8是细胞裂解上清，作为阳性对照，用AA98进行免疫印迹检测。图8 AA1-AA5和AA7进行冰冻切片免疫组化实验检测组织水平的⑶146分子。AA98作为实验的阳性对照，CD31用于标记血管内皮细胞(如箭头所示)。如箭头所示，只有AAl和AA2能够结合冰冻切片上组织水平的⑶146分子。图9 :夹心ELISA检测5ng/ml_320ng/ml标准样品的标准曲线。图10 :夹心ELISA检测5ng/ml_80ng/ml标准样品的标准曲线,及拟合方程。图11 HMV6g载体的图谱，其含有ΜΒΡ-His标签。杂交瘤细胞株8E8和GlO (其分别分泌抗体AAl和AA4)于2007年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京，海淀区中关村北一条 13 号)，保藏号分别为 CGMCC No. 2310 和 CGMCC No. 2311。
具体实施例方式下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的。本发明的精神和范围由后附的权利要求所限定。实施例I :单克隆抗体AA1-AA5和AA7的制备及鉴定。应用杂交瘤技术(KohlerandMilstein1975 ；Yeh, Hellstrom et al. 1979 ；Yeh,Hellstrom et al. 1982)产生并筛选获得抗体AA1-AA6和AA7。简述如下从人脐带静脉内皮细胞中分离天然⑶146蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，核苷酸序列如SEQ IDN0:2所示)，按照(Yan，Lin et al. 2003)描述的单克隆抗体AA98抗原纯化方法纯化，将其作为免疫原对BALB/C小鼠(北京实验动物中心)进行免疫接种，每次腹膜内注射100 μ g蛋白/鼠，每两星期一次，共三次。取脾细胞之前加强免疫一次，腹膜内注射IOOyg蛋白/鼠。加强免疫之后三天，取脾脏，并将脾细胞悬浮于RPMI培养基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，将脾细胞和SP2/0-Agl4鼠骨髓瘤细胞(ATCC)进行融合，并用HAT选择性培养基对杂交瘤进行筛选。运用酶联免疫吸附(ELISA)的方法筛选能够大量产生高亲和力的抗人CD146抗体的杂交瘤细胞克隆。使用重组表达的⑶146分子胞外区蛋白，rh⑶146(序列为SEQ ID NO:I的人⑶146序列中的位置氨基酸24-552)作为包被抗原，检测杂交瘤细胞培养上清。具体的做法是，首先在ELISA板上过夜包被50 μ I I μ g/ml rh⑶146蛋白，用PBS洗三遍。加入2%牛血清白蛋白(Ameresco)封闭I小时。然后先后加入分泌抗体的杂交瘤培养上清、酶标抗体(I : 5000 稀释的羊抗鼠 HRP, Santa Cruz)和底物(200ng/ml TMB (Ameresco),O. 03% H2O2 (北京化学试剂公司)，pH4. 5)，进行ELISA筛选。通过三轮筛选获得了六个分泌高亲和力抗体的杂交瘤细胞株8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②，其分泌的抗体分别对应命名为AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7。将杂交瘤细胞株8E8和GlO (其分别分泌抗体AAl和AA4)于2007年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京，海淀区中关村北一条13号)，保藏号分别为CGMCC No. 2310和CGMCC No. 2311。而杂交瘤细胞株AA6是ELISA筛选时的阴性杂交瘤克隆，与CD146结合能力很弱。分别大量培养扩增杂交瘤细胞8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②，分别收集含有AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7抗体的培养上清用于抗体功能鉴定。另外分别将杂交瘤细胞8E8、8F4、A5、G10、H5①和H5②用无血清RPMI-1640培养基制成细胞悬液，用于制备抗体腹水。腹水的制备方法简述如下六周龄BALB/C小鼠腹腔注射降植烷(Sigma)O. 5ml/只。10天后，将杂交瘤细胞悬液IxlO6个/ml接种于BALB/C小鼠腹腔，O. 5ml/只，约十天后，收集腹水，离心取上清。通过蛋白A亲和层析，从培养上清或腹水中纯化单克隆抗体AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7。将纯化单克隆抗体无菌过滤，并冷藏或冷冻保存。应用BD Pharmingen公司鼠抗体亚型鉴定试剂盒(目录号550487),将发明专利ZL991075862中所述AA98(下同)作为实验阳性对照，ELISA方法鉴定出抗体AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7均属于IgGl亚型,如表I所不。表I 抗体 AAl、AA2、AA3、AA4、AA5、AA7 和 AA98 抗体分型
权利要求
1.SEQ ID NO :25所不的氣基酸序列。
2.一种抗人CD146抗体，其特征在于其能够特异性识别权利要求I的氨基酸序列，其由保藏号是CGMCC NO. 2311的杂交瘤细胞株分泌。
3.权利要求2的抗人CD146的抗体在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的应用，其中所述肿瘤是黑色素瘤、肝癌，胰腺癌。
4.权利要求2的抗人CD146的抗体在制备用于靶向CD146的人体肿瘤的成像定位诊断的诊断剂中的应用。
5.一种用于治疗肿瘤的药物组合物,其包含权利要求2的抗人CD146抗体和药用载体。
6.分泌抗人⑶146抗体的杂交瘤细胞株，保藏号分别为CGMCCNO :2311。
7.一种编码权利要求2所述抗人⑶146抗体的核酸。
8.—种包括按照权利要求7的核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。
9.一种原核或真核宿主细胞,其包括按照权利要求8的载体。
10.一种制备结合人CD146的抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达按照权利要求7的编码抗体重链的核酸和编码抗体轻链的核酸，并且从所述细胞中回收所述多肽。
11.权利要求2的抗人CD146抗体在制备用于检测人CD146的诊断剂中的应用，其中所述检测是通过酶联免疫吸附法进行的。
12.权利要求11的应用，其中所述酶联免疫吸附法是夹心酶联免疫吸附法，其中将权利要求2的抗人CD146抗体的一种或多种作为捕获抗体，将中国专利ZL 991075862中的鼠单克隆抗体AA98作为检测抗体。
13.权利要求11或12的应用，其中所述人CD146存在于人体液中。
14.权利要求12的应用，其中所述体液是组织液，血清，淋巴液或脑脊液。
15.权利要求2的抗人CD146的抗体的衍生物，其中所述衍生物为所述抗体与生物标记物、抗肿瘤药物、毒素、放射活性剂结合的产物，其中所述生物标记物是生物素，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，异硫氰酸荧光素，藻红素，Cy3，Cy5或纳米磁珠，所述抗肿瘤药物是卡钼，顺钼或五氟尿嘧啶，毒素是蓖麻毒素或淋巴毒素，放射活性剂是131碘，9°钇或放射性铜。
全文摘要
本发明是利用生物技术研制出的一组抗人CD146分子及建立的高灵敏度夹心ELISA检测可溶性CD146的方法。本发明包括抗人CD146鼠单克隆抗体AA1、AA2、AA3、AA4、AA5和AA7，利用抗体组合及夹心ELISA特异性检测可溶性CD146的方法。这组抗体能够在分子、细胞和组织水平特异性识别人源CD146，并基于其识别不同表位而分成两类。由抗体AA1与另一株抗人CD146鼠单抗AA98组合的夹心ELISA方法能够检测到每毫升钠克量级可溶性CD146。这些抗体及此种检测手段将成为基础研究或临床应用中有效的检测或诊断的工具及方法，同时也将为与CD146相关疾病的靶向治疗提供良好载体。
文档编号C12N15/63GK102936283SQ20121039485
公开日2013年2月20日 申请日期2008年1月31日 优先权日2008年1月31日
发明者阎锡蕴, 张莹, 郑超固, 杨东玲, 冯静, 卢迪 申请人:中国科学院生物物理研究所