专利名称：重组抗人cd4嵌合抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于抗体药物技术领域，具体涉及一种针对人T细胞表面⑶4分子的重组人/鼠嵌合抗体及其编码基因。
背景技术：
人CD4分子是一类分子质量约为55 kDa的单链跨膜糖蛋白，属免疫球蛋白超家族，主要表达于部分T细胞、胸腺细胞、某些B细胞和EB病毒转化的B细胞、单核-巨噬细胞以及特定区域的脑细胞表面。其在T细胞发育、成熟T细胞的活化以及信号转导中发挥重要作用，是适应性免疫应答发生的重要效应分子，在维护机体正常生理功能中作用巨大。然而，当CD4分子的正常免疫学功能失调或遭到破坏时即可能导致疾病。因此，CD4分子成为许多疾病治疗的靶标，如移植排斥反应、类风湿性关节炎、Crohn; s病、多发性硬化症、 肿瘤、Sjogren综合症、银屑病、哮喘、特应性皮炎、自身免疫性糖尿病以及AIDS和HIV的感染等。鉴于此，国外多个单位对抗人CD4抗体的治疗效果进行了广泛而深入的研究，如预防 HIV 感染(Kuritzkes DR, Jacobson J, Powderly WG, et al. JID, 2004, 189:286-291.)以及哮喘(Kon 0M, Sihra BS, Compton CH, et al. Lancet, 1998，352:1109-1113·)、关节炎(Pelegri C，Morante MP, Castellote C，et al. Clin ExpImmunol, 1996, 103: 273-278.)、多发性硬化症(Oosten Bff van, Lai M, Hodgkinson S，et al. Neurology, 1997, 49: 351-357. )、T 细胞淋巴瘤(Knox S，Hoppe RT, MaloneyD, et al. Blood, 1996，87 (3): 893-899.)、寻常性银屑病(Skov L, Kragballe K,Zachariae C, et al. Arch Dermatol, 2003, 139: 1433-1439.)和器官移植(MotoyamaK, Arima Τ, Yu S，et al. Transplantation, 2000, 69(2) : 285-293.)的治疗和预防等。其抗体类型包括嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。其中Biogen IDEC/GSK合作开发的嵌合抗体clenoliximab正在开展治疗哮喘和类风湿性关节炎的II期临床研究；Centocor Inc.开发的嵌合抗体priIiximab正在开展治疗Crohn’s病的II期临床研究；Orthclone开发的人源化抗体cedelizumab正在开展治疗自身免疫病和器官移植排斥的II期临床研究；Tanox Inc.公司开发的人源化抗体ibalizumab正在开展治疗AIDS/HIV感染的II期临床研究；而Medarex和Genmab公司合作开发的全人源抗体zanolimumab已经完成治疗皮肤T细胞淋巴瘤III期临床研究，并已获得了 FDA和EMA孤儿药的批准，由于商业原因现为美国EmergentBiosolution公司开发产品。然而，我国在相关领域的研究仍处于空白，究其根本原因是缺乏具有自主知识产权的抗人CD4抗体的核酸序列以及缺乏重组抗体高效表达技术平台。因此，本领域急需一种具有自主知识产权的且具有实用价值的抗人CD4抗体，以及相关高效表达技术。WuT4是我所20世纪80年代自主研发的抗人CD4分子IgG2a小鼠单抗，起初作为人T淋巴细胞分群试剂(国药准字S10930009)为HIV感染等诊断提供方案。然而，由于鼠源性单克隆抗体用于人体易导致抗鼠抗体反应(Human anti-mouse antibody, HAMA)而降低疗效，且半衰期短，反复应用能导致超敏反应以及不能发挥抗体Fe段生物学功能等缺点而一度限制其临床使用。为此，往往采用重组DNA技术将小鼠单抗改造成人鼠嵌合抗体以提升其临床应用效果。迄今获FDA或EMA批准的嵌合抗体有5种(Abciximab, Rituximab,Basiliximab, Infliximab, Cetuximab),其中 Infliximab、Rituximab 和 Cetuximab 均为重磅炸弹药物，2010年的销售额分别为80、67和32亿美元。此外，还有一种嵌合抗体类药物 Brentuximab vedotin 正在接受 EMA 审评。常规的扩增小鼠抗体可变区的方法是使用一组简并引物(Kettleborough CA,Saldanha J, Ansell KH, et al. Eur J Immunol, 1993, 23: 206-211·)。然而，由于抗体可变区基因的巨大多态性，现有的简并引物并不能完全覆盖所有的抗体基因序列，因此存在扩增不出或扩增出的基因序列存在突变等问题。RLM-RACE法(RNA ligase-mediatedrapid amplification of 5’ cDNA end)是一种不依赖于 DNA 模板序列的技术(Liu X,Gorovsky M. Nucleic Acids Research, 1993，21 (21): 4954-4960)，其为准确克隆出抗体可变区和信号肽序列以及与表达调控有关的5’非编码区(5’-UTR)提供了可能。
抗体在真核细胞内表达是一个非常复杂的过程，在多个节点上受到调控，如DNA或染色质的化学和结构修饰、转录和转录后的加工和修饰、mRNA的运输、mRNA的半衰期、翻译和翻译后修饰以及蛋白质的折叠和装配等。其中，构建抗体高效表达载体是实现抗体高水平表达的重要策略之一。抗体表达载体的调控元件(如启动子、增强子、内含子等)以及载体的结构排列(如单个载体多个启动子等)是通常需要考虑的因素。此外，抗体筛选标记基因的弱化如NPT II、DHFR等也是提高抗体表达水平的策略。
发明内容
本发明解决问题之一是采用RLM-RACE法准确克隆出WuT4鼠单抗的可变区序列。本发明提供的重组抗人⑶4嵌合抗体，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。本发明提供的重组抗人⑶4嵌合抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。 本发明解决问题之二是采用重组DNA技术构建了具有自主知识产权的抗人⑶4分子人鼠嵌合抗体IgGl K。本发明提供的重组抗人⑶4嵌合抗体，其重链核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，轻链核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。本发明提供的重组抗人⑶4嵌合抗体，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。本发明解决问题之三是采用抗体表达水平提高策略构建了抗人CD4嵌合抗体表达载体。本发明提供了一种抗体表达载体PHDC4，其包含上述抗人⑶4嵌合抗体重链和轻链基因。本发明提供的表达载体重链5’端“ATG”前添加了 Kozak序列“GCCGCCACC”，3’端“TGA”后添加了 “GCT”序列。本发明提供的表达载体轻链5’端“ATG”前添加了 Kozak序列“GCCGCCACC”，3’端“TAG”后添加了 “AGA”序列。本发明提供的表达载体CMV启动子内包含一段增强子序列。本发明提供的表达载体CMV启动子下游包含一段内含子序列。本发明提供的表达载体上的NPT II基因采用定点突变技术进行了弱化，使其对抗新霉素(Neo)的活性降低。所述的表达载体pHDC4在哺乳动物细胞内如HEK-293T、CHO-DHFR' C0S-7等表达后所获得的抗体为针对人CD4分子的人鼠嵌合抗体。所述核苷酸序列可经生物信息学软件进行序列和密码子优化。所述可变区序列可采用生物信息学软件进行人源化改造或采用展示技术进行全人源抗体的定向进化。 所述的重组抗人CD4嵌合抗体可用于诊断，也可用于自身免疫病和肿瘤的治疗应用如类风湿性关节炎、Crohn' s病、多发性硬化症、肿瘤、Sjogren综合症、银屑病、哮喘、特应性皮炎、自身免疫性糖尿病等，也可用于移植排斥反应的预防或AIDS和HIV感染的干预
坐寸ο有益效果本发明所提供的重组抗人⑶4嵌合抗体能特异性识别昆虫细胞(HEK293T)表达的重组⑶4分子胞外段以及人外周血⑶4+ T细胞，其与⑶4分子的亲和力大小为2.67X10_9 M0与亲本抗体相比，其亲和力和特异性不仅得到保留，而且在人体内的免疫源性将大大降低，半衰期将显著延长，并能发挥抗体Fe区的生物学功能，因而更符合抗体药物应用于人体治疗的要求。
附图I所示为采用RLM-RACE法克隆WuT4抗体可变区和信号肽序列以及5’ -UTR的琼脂糖凝胶电泳图，1、2分别为含有重、轻链可变区的片段。附图2所示为采用重组DNA技术构建抗人⑶4嵌合抗体重链和轻链基因的琼脂糖凝胶电泳图，3、6分别为完整重、轻链基因片段。附图3所示为所构建的抗人⑶4嵌合抗体表达载体图谱。附图4所示为采用Protein A亲和柱从稳定转染pHDC4的CHO-DHFR—细胞培养上清液中收获抗人CD4嵌合抗体的亲和层析图谱，1、2为目标抗体峰。附图5所示为抗人CD4嵌合抗体的非还原和还原SDS-PAGE电泳图(图2和4)，I、3为WuT4鼠单抗对照。附图6所示为抗人CD4嵌合抗体特异性鉴定的WB和Dot blot图，1、9为WuT4阳性对照，6、13以及7、14分别为纯化后和未纯化的抗⑶4嵌合抗体。
具体实施例方式一种重组抗人⑶4嵌合抗体，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，重链可变区前5’ -UTR序列为ATGAAAACAACCTATGATCAGTGTCATCTCCACAGTCCCTGAACACACTGACTCTAACC ；前导序列为ATGGAATGGAGGATCTTTCT CTTCATCCTG TCAGGAACTG CAGGTGTCCACTCC ；
HCDRl 为G GATACACATT CACTGAGTAT GTT ；HCDR2 为ATTTAT CCTGGAAGTG GTAGTAGT ；HCDR3 为GCAAGGGG GAATGATCAC TCCTGGTTTG CTTAC。其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，轻链可变区前5’ -UTR 序列为GAAGCATCCTCTCATCTAGTTCTCAGAG ；前导序列为ATGGAGACAGACACAATCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGGCTCCACTGGT ；HCDRl 为CA AAGTGTTGAT TATGATGGTG ATAGTTAT ； HCDR2 为ATCTATG CTGCATCCAA TCTA ；HCDR3 为CAGC AAAGTAGTCT GGATCCTCGG ACG。其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，其中信号妝为METGlu Trp Arg He Phe Leu Phe He Leu Ser Gly Thr Ala GlyVal His Ser ； HCDRl 为Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Val ；HCDR2 为Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ser ；HCDR3 为Ala Arg Gly Asn Asp His Ser Trp Phe Ala Tyr。其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示，其中信号妝为METGlu Thr Asp Thr He Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp ValPro Gly Ser Thr Gly ；HCDRl 为Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr ；HCDR2 为Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu ；HCDR3 为Gln Gln Ser Ser Leu Asp Pro Arg Thr。在获得编码本发明重组抗人CD4嵌合抗体的重链可变区和轻链可变区后，采用下述方法克隆本发明的单克隆抗体步骤I :抗人⑶4抗体可变区和信号肽序列以及5’ -UTR的克隆5’ -Full RACE kit购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为D315 ；PrimeSTAR HS DNA Poly-merase with GC Buffer购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为DR044A ;TRIzol为Invitrogen公司产品，货号为15596-026 ；pMD 18-T克隆载体试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为DlOlB ;Top 10感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为CB104-02。扩增含重链可变区核酸序列的引物(I) MGOuter :5’- ACCKYGGTSYTGCTKGCYGGGTG -3’ ；(2) MGInner : 5，- GCACACYRCTGGACAGGGATCCAG-3，。扩增含轻链可变区核酸序列引物(3) MKOuter : 5，- CTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC-3，；(4) MKInner :5’- GATACAGTTGGTGCAGCATCAGC -3’。5' RACE Outer Primer 5'- CATGGCTACATGCTGACAGCCTA -3’ ；5' RACE Inner Primer :5’- CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCA GTCGATG -3’。收集5-10 X IO6个对数生长期的WuT4杂交瘤细胞，使用TRIzol法提取总mRNA。然后，分别对此mRNA进行去磷酸化处理和烟草酸焦磷酸酶(TAP)去掉5’帽子结构。在T4RNA连接酶的作用下，将5’-RACE Adaptor连接在上述处理后的mRNA的5’端。继而使用逆转录酶合成cDNA后联合巢氏PCR和递减PCR法进行扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行鉴定。将所获得的目的大小的PCR片段纯化后与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞Top 10后挑取鉴定为阳性的克隆进行测序鉴定。步骤2 :抗人⑶4嵌合抗体的构建质粒pMD18-CH和pMD18_CK分别包含IgGl κ恒定区cDNA序列，其来源为前期采用PCR法从本人外周血中克隆出；质粒pcDNA3. 3-stuff和pOptiVEC-stuff载体部分购自Invitrogen公司，本实验室在其克隆位点为别引入EcoR I和Xho I酶切位点并保存。采用基因拼接法分别将抗体重、轻链可变区基因与抗体重、轻链恒定区进行拼接。纯化回收拼接后的基因片段后将其分别克隆至pcDNA3. 3和pOptiVEC上，挑选阳性克隆进·行测序鉴定。步骤3 :抗人⑶4嵌合抗体表达载体的构建采用基因拼接法分别在抗人⑶4嵌合抗体的重、轻链5’端上游插入一段人工合成的IVS序列(intervening sequence),然后将包含内含子序列的重、轻克隆至pcDNA3. 3和pOptiVEC上，挑选阳性克隆进行测序鉴定。分别合成一段增强子序列，然后分别利用Acc III和EcoR I双酶切位点将其克隆至CMV的下游、内含子的上游。采用定点突变法将pcDNA3. 3上NPT II基因182位氨基酸残基进行Glu — Asp突变，以降低其活性(YenofskyRL, Fine M, and Pellow Jff. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990，87: 3435-3439·)。由于原载体POptiVEC有Sal 117和3&1 I 2234 2个Sal I酶切位点，于是采用定点突变法将Sal I 2234删去。然后，分别使用Sal I酶切质粒mpcDNA3. 3-T4L和mp0ptiVEC_T4H，均纯化回收大片段后在T4 DNA连接酶的作用下进行组装即得抗人⑶4嵌合抗体表达质粒PHDC4。步骤4 :抗人⑶4嵌合抗体稳定细胞株的构建CH0-DHFR_细胞购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，资源编号为3115CNCB00292,由本实验室保存；MDM 培养基(货号为 12200-036)，Opti-MEM ReducedSerum Medium (货号为 31982-070)，透析FBS (货号为 26400-036)，Geneticin SelectiveAntibiotic (货号为 10131-027，50 mg/mL), Lipofectamine 2000 (货号为 11668-019)，0. 25% Trypsin with EDTA 4Na (货号为 25200-056)均购自 Invitrogen 公司；HT mediasupplement [50X ](货号为H0137)为Sigma公司产品；其它细胞培养耗材购自Corning公司或Nunc公司。常规传代培养CHO-DHFR-细胞。使用pvu I酶切质粒pHDC4后纯化回收并采用脂质体法将其稳定转染CHO-DHFR-细胞。转染48小时后，使用含500 μ g/mL Geneticin的无HT IMDM培养基进行筛选。约14天后采用有限稀释法进行克隆化筛选表达水平高的克隆。获得表达水平高的克隆后采用逐级提升MTX浓度的方法进行加压筛选，直至表达水平不再增高而细胞生长速度无明显减缓。扩大培养获得的稳定细胞克隆到一定细胞密度后，更换为无血清培养基。然后，使用Protein A亲和层析法从含有目的抗体的无血清培养上清液中纯化回收抗人CD4嵌合抗体。步骤5 :抗人⑶4嵌合抗体的鉴定以SDS-PAGE和WB分析⑶4嵌合抗体的纯度、分子量和来源；&FCM、WB和Dot Blot来评估嵌合抗体的结合活性和特异性；使用IEF测定其等电点；采用质谱分析法来分析CD4嵌合抗体的肽质量指纹；使用Edman化学降解法测定其N端氨基酸序列；并使用生物分子 相互作用仪来测定chT4和WuT4的平衡解离常数(KD)。结果表明WB和FCM结果表明抗CD4嵌合抗体与亲本抗体一样能特异识别人CD4分子；IEF测定其等电点约为7. 02 ;质谱分析法表明所获得的蛋白为目的抗体；N端测序表明与理论氨基酸序列完全一致且信号肽在预期的位点成功进行了剪切；生物分子相互作用仪测定抗人CD4嵌合抗体和亲本抗体的平衡解离常数(KD)分别为2.67X10_9 M和2.07X10_9 Μ。结论获得了具有自主知识产权且具备一定实用潜力的抗人CD4嵌合抗体。
权利要求
1.一种重组抗人CD4嵌合抗体，其重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示；其轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.—种重组抗人CD4嵌合抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示；其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示。
3.一种DNA分子，编码了权利要求I或2所述的重组抗人⑶4嵌合抗体。
4.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人CD4嵌合抗体的重链核苷酸序列如SEQID NO:5所示；轻链核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.权利要求3所述的DNA分子，所述重组抗人CD4嵌合抗体的重链氨基酸序列如SEQID NO:7所示；轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
6.一种抗体表达载体pHDC4，包含权利要求3所述的DNA分子的序列。
全文摘要
本发明公开了一种重组抗人CD4人鼠嵌合抗体，其重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO:2所示；其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；其完整重链核酸序列如SEQ ID NO:5所示，完整轻链核酸序列如SEQ ID NO:6所示；其完整重链氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，完整轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。本发明还公开了一种含有上述完整抗人CD4嵌合抗体重、轻链核酸序列的表达载体。本发明所公开的嵌合抗体能特异性识别人CD4分子，其平衡解离常数为2.67×10-9 M，不仅可用于疾病诊断，而且在器官移植、自身免疫病和某些肿瘤的治疗以及AIDS和HIV感染的干预方面具有潜在应用价值。
文档编号C12N15/13GK102898525SQ20121042306
公开日2013年1月30日 申请日期2012年10月29日 优先权日2012年10月29日
发明者胡迪超, 杨晓明, 张爱华 申请人:武汉生物制品研究所有限责任公司