专利名称：用于神经干细胞培养的细胞培养载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种-NH2化学基团修饰的细胞培养载体及其制备方法，以及所述的细胞培养载体在培养的神经干细胞中的应用，特别是所述细胞培养载体在促进培养的神经干细胞的粘附、迁移和分化中的应用。
背景技术：
神经干细胞(Neural Stem Cells, NSCs)作为种子细胞联合组织技术是治疗神经系统损伤和神经退行性疾病最有前途的方法之一。众所周知，细胞的粘附、迁移和分化能力与其所处的周围微环境尤其是所用生物材料表面物理化学特性有着密切的关系。已有报道表明生物材料表面特性影响微环境中的蛋白的吸附可引发不同的细胞应答，因此，一些具有生物活性的片段如肽链、多聚氨基酸甚至活性化学官能基团被引入生物材料，并试图通过控制细胞与材料表面间的相互作用而达到控制细胞行为的目的，而这些片段之所以具有生物活性功能，是由于其功能基团如羧基、羟基、氨基(-NH2)与微环境中利于细胞生长的粘附分子结合而发挥作用。已有报道表明，贴壁粘附是NSCs分化的前提之一，而不同化学功能基团对NSCs的行为具有不同的影响，相对于其他化学活性基团，-NH2能够明显促进NSCs在经化学修饰后在盖玻片上粘附和迁移，并似乎能提高神经元的分化比例，原因可能是由于细胞表面带负电荷，因此，具有正电荷特性和最大活性的官能基团-NH2，可能最适合细胞粘附。由于细胞之间信息传递对细胞发育和细胞生物学行为起着非常重要的作用，改变材料和局部接种细胞的密度可能会影响神经干细胞粘附、迁移、增值和分化。而在以往的报道中，在研究材料表面化学基团与细胞之间的相互作用时，使用的是含血清培养基或是包含粘附蛋白的培养基，因此，很难区分是化学基团还是粘附因子的作用改变了细胞行为
发明内容
在本发明中，我们将NSCs种植在经化学修饰后具有不同密度的-NH2盖玻片上，观察不同密度的-NH2基团在无血清培养条件下对NSCs粘附、迁移、增殖和分化等生物学行为的影响，从而确定-NH2作为一种适合细胞贴壁的化学修饰基团，对神经干细胞在材料表面的附着密度，及生物学行为的调控作用。更具体而言，本发明涉及一种-NH2化学基团修饰的细胞培养载体及其制备方法，以及所述的细胞培养载体在培养的神经干细胞中的应用，特别是所述细胞培养载体在促进培养的神经干细胞的粘附、迁移和分化中的应用。本发明所述的-NH2化学基团修饰的细胞培养载体的制备方法如下:步骤一，将盖玻片(石英盖玻片，大小22*22mm)浸泡在I %十二烷基硫酸钠(Sigma，USA)溶液中30分钟，随后再将其浸泡在0.1M盐酸溶液中30分钟，然后用双蒸水洗3遍，吹干，备用;
步骤二，将经上述步骤一处理后的得到的洁净盖玻片浸泡在> 70%的浓硫酸溶液和30%双氧水溶液中使之羟基化10分钟，再浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(Sigma，USA)中化学连接-NH2，去离子水清洗三遍，75%酒精隔夜清洗消毒，氮气吹干，即获得所述的NSCs细胞培养载体。所述的浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷中化学连接-NH2的步骤为，连接反应时间为2 14小时，优选为12小时；反应温度为4 40°C，优选为25°C;反应底物3-氨基丙基三乙氧基硅烷的浓度为05 20%，优选为20%。本发明所述的细胞培养载体在培养的神经干细胞中的应用方法如下，培养NSCs前，将所述载体放入培养板(Corning，USA)内，75%酒精隔夜消毒后用无菌缓冲磷酸盐溶液(PBS缓冲液，pH7.2-7.4)彻底清洗后备用。将细胞系形式增殖的神经干细胞(天坛神经外科研究所，干细胞室提供)在预冷的Hank’ s平衡盐液(pH7.2)中吹打成单细胞悬液，在无血清培养基(DMEN/F12，HyClone)条件下接种于上述放入所述载体的培养板中培养。需要指出的是，上述细胞系仅为例举所用，本发明所述的载体材料并不仅限于培养所述神经干细胞，申请入的相关工作表明，本发明所述的载体材料在培养例如CHB、HUES系列的干细胞(NIH干细胞库来源的干细胞株,可参见http://stemcells.nih.gov)时也获得了比较好的结果。采用本发明所述的培养载体，对神经干细胞的培养过程及培养结果如下:
培养的第I天，有大量的神经球贴壁，大量的细胞从神经球中游走出来，并有突起伸出，牢固贴附于载体材料表面。至第5天时，有更多的细胞迁移出来并网状交织在一起。神经球中迁移出来的细胞会向神经细胞分化，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。材料表面的-NH2浓度会影响神经球中迁移出来细胞向神经元的分化比例。
图1，修饰后盖玻片的表面特性检测结果:水接触角(water contact angle,WCA)；图2，修饰后盖玻片的表面特性检测结果:傅立叶变换红外光谱(Fouriertransform infrared spectroscopy, FT IR)；图3,修饰后盖玻片的表面特性检测结果:X光电子能谱(X-ray photoelectronspectroscopy, XPS)；图4，D组盖玻片神经球细胞贴壁显微镜照片，接种到材料上的神经干细胞增殖分化图；图5，共聚焦显微镜观察分化后的神经干细胞免疫荧光染色的结果；
具体实施例方式实施例1，-NH2修饰的盖玻片的制备及表征将盖玻片(石英盖玻片22*22mm)浸泡在I %十二烷基硫酸钠(Sigma，USA)溶液中30分钟，随后再将其浸泡在0.1M盐酸溶液中30分钟，然后用双蒸水洗3遍，吹干；
将经上述步骤处理后的得到的洁净盖玻片浸泡在> 70%的浓硫酸溶液和30%双氧水溶液中使之羟基化，处理lOmin，再浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(Sigma，USA)中化学连接-NH2，环境温度25°C，反应12h，所述的连接反应中，3-氨基丙基-三乙氧基硅烷反应浓度为，A组:浓度0.5% ;B组:浓度5% ;C组:浓度15% ；D组:浓度20% ;去离子水清洗3遍，75%酒精隔夜消毒，氮气吹干，即获得所述-NH2修饰的用于NSCs细胞的盖玻片培养载体。衰减全反射红外光谱法定量表征材料表面蛋白质或化学基团具有较高的准确度和灵敏度。我们选取经氨基基团化学修饰过的玻片分成4组检测红外光谱。表I表示ABCD4组玻片的红外光谱数据。由于相对于羟基而言，-NH2更疏水。故水接触角越大，表明-NH2浓度越高。通过控制反应时间和反应试剂氨基硅烷的浓度，水接触角测量结果呈现出上升梯度特征，这表明经过-NH2修饰后，盖玻片表面亲疏水性能发生了巨大的变化。在所有盖玻片表面接触角测量数据见表I和图1，D组盖玻片具有最高的水接触角。表.1比较不同反应浓度在固定时间内对接触角的影响
权利要求
1.一种-NH2化学基团修饰的细胞培养载体的其制备方法，所述方法包括如下步骤: (1)将载体材料清洗干净； (2)对载体材料表面进行羟基化； (3)通过3-氨基丙基-三乙氧基硅烷对载体材料进行表面处理，化学连接-NH2基团。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的羟基化步骤为:依次在浓硫酸溶液和30%双氧水溶液中浸泡。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的表面处理步骤为，浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷溶液中。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，浸泡在3-氨基丙基-三乙氧基硅烷溶液中进行连接时，连接反应时间为2 14小时，优选为12小时；反应温度为4 40°C，优选为25°C ;反应底物3-氨基丙基三乙氧基硅烷的浓度为0.5 20%，优选为20%。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养载体可以是玻璃或塑料材质的培养皿、培养瓶、载玻片、盖玻片、或其他贴壁型细胞生长载体。
6.权利要求1-4所述的方法制备获得的细胞培养载体。
7.权利要求1-4所述的方法制备获得的细胞培养载体在培养干细胞、对干细胞诱导分化中的应用。
全文摘要
本发明一种-NH2化学基团修饰的细胞培养载体及其制备方法及其应用，制备方法为，将载体材料清洗干净；然后通过浓硫酸溶液，双氧水溶液使之羟基化；再用3-氨基丙基-三乙氧基硅烷化学连接-NH2即得。该载体材料在神经干细胞的培养及诱导分化中相比于普通培养材料，有更好的效果。
文档编号C12N5/079GK103087914SQ201210452188
公开日2013年5月8日 申请日期2012年11月13日 优先权日2012年11月13日
发明者安沂华, 李海龙, 董健伸, 罗美华 申请人:安沂华