专利名称：酵母中自组装的具有免疫原性的肠道病毒病毒样颗粒的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是酵母来源的小RNA病毒科肠道病毒属病毒样颗粒的生产、纯化、免疫原性检测及其应用等相关技术。
背景技术：
病毒样颗粒与多价免疫原展示平台
病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)是由病毒的结构蛋白自发包装形成的空 心颗粒，不含病毒核酸，不能自主复制，无感染性，在形态和结构上与真正病毒颗粒相同或相似，免疫原性与病毒颗粒效价相当。与病毒的这种相似性使得病毒样颗粒成为了一种新兴的安全的结构病毒学和疫苗学研究载体。另外，作为新型异源免疫原展示载体，重组病毒样颗粒免疫原展示平台的研究近年来发展迅速。所谓重组病毒样颗粒免疫原展示平台，即通过基因重组技术，在病毒样颗粒暴露于表面的肽段中插入或置换异源的免疫原，使该免疫原展现在颗粒的最外层空间，以达到展示异源免疫原的目的。病毒样颗粒及重组病毒样颗粒免疫原展示平台的研究主要依赖于基因工程、发酵工程等技术手段及结构学和免疫学等领域的研究方法。目前从原核表达系统到哺乳动物表达系统都有病毒样颗粒成功表达的案例，较为成熟的且有代表性的重组病毒样颗粒免疫原展示平台有噬菌体衣壳蛋白颗粒、乙型肝炎核心蛋白颗粒(HBcAg)和兽棚病毒(flock house virus, FHV)病毒样颗粒。根据结构病毒学分析，肠道病毒病毒样颗粒具有潜在的外源免疫原插入或置换位点。小RNA病毒科肠道病毒概览
小RNA病毒科的成员都具有长度从6000-9000bp不等的单链RNA基因组，其无包膜的正二十面体病毒颗粒直径在22-30nm之间，通常通过粪口途径传播，其家族病毒成员庞杂，且感染哺乳动物群类广泛，最新的病毒分类学定义该科共分为五个属，即鼻病毒属、口蹄疫病毒属、肠道病毒属、心病毒属和甲肝病毒属。肠道病毒属主要包括脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒68-71型、埃柯病毒和柯萨奇病毒等感染人类的几类病毒。著名的脊髓灰质炎病毒可引发小儿麻痹症，人肠道病毒70型可引起急性结膜炎，而人肠道病毒71型、柯萨奇病毒和埃柯病毒可引起成人腹泻及婴幼儿手足口病或心肌炎。目前除脊髓灰质炎病毒外，其他病毒均无投产疫苗。当今在发展中国家通用的脊髓灰质炎萨宾口服疫苗是病毒减活疫苗，存在一定致病风险，WHO分析报告指出，目前脊髓灰质炎II型病毒已经从自然界消失，而萨宾疫苗包含脊髓灰质炎全部三型的病毒，所以目前感染脊髓灰质炎II型病毒的病例全部是由于使用疫苗后减活病毒活性增强而引发的。萨宾疫苗的另一大潜在风险不易觉察，但可能影响将是长期的和不可控的，由于使用的是减活病毒，病毒可以随粪便排出，可能与自然界野生的各类肠道病毒发生基因交换，产生新型肠道病毒。手足口病的致病病毒及其疫苗研究现状
手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD)是近年来引起全球高度重视的一种急性病毒性传染病，主要易感人群为五岁以下婴幼儿。患儿手、足、口腔等表皮部位可产生分散性疱疹，对少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症，重症患儿甚至可能死亡。自2007年来，这种疾病在我国华北、华中等地区持续性流行，且每年的病例数有递增趋势，严重危害我国儿童身体健康。人肠道病毒71型病毒和柯萨奇A16型病毒是在我国流行的手足口病主要的致病病毒。人肠道病毒71型病毒(Enterovirus 71, EV71)隶属小RNA病毒科OcYcoraaririaofe),肠道病毒属A类,是一种通过粪口及粘膜途径传播的病毒。该病毒由一条基因组单链RNA和正二十面体的衣壳构成，不含包膜，其中衣壳由VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白构成。在EV71病毒的生活周期中，病毒衣壳的包装是一个自发的并且具有多级步骤的过程。首先，病毒基因组RNA翻译出一个包括病毒所有结构蛋白和非结构蛋白的长的肽链(polyprotein)，在病毒蛋白酶剪切作用下，产生出结构蛋白前体Pl和病毒蛋白酶3⑶；P1通过3⑶的剪切作用生成结构蛋白VP1、VP3和结构蛋白VP2、VP4的前体蛋白VPO ；VP0、VP1和VP3可以自组装形成完整的正二十面体的不含基因组核酸的空衣壳颗粒(emptycapsid);若形成的空衣壳包裹了基因组RNAJU VPO剪切为VP2、VP4蛋白，并形成成熟的含 有病毒基因组的病毒颗粒。柯萨奇A16型病毒(Coxsackievirus A16, CVA16)与EV71病毒在生活周期、病毒蛋白的结构和功能等方面有极高的相似度。病毒和免疫学界已经针对手足口病疫苗制备进行了一系列的基础研究，提出并尝试了多种形式的备选疫苗，包括病毒减活疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗、亚单位疫苗，这些疫苗形式各具特色但也存在局限。其中以减活疫苗的免疫原性和保护性最高，且成本低，但由于其制备过程是模仿脊髓灰质炎病毒萨宾疫苗，所以存在一定的致病风险。DNA疫苗可以产生体液免疫和细胞免疫反应，但DNA疫苗这种疫苗形式本身的安全性争议一直是制约其发展最重要的因素。EV71病毒的两段合成肽，即SP55 (VPl 163_177aa)和SP70(VPI 208-222aa)，可诱导小鼠产生针对EV71病毒的中和性抗体，但由于效价问题尚未应用于疫苗开发。亚单位疫苗包括结构蛋白单体(如VPl)和病毒样颗粒两种形式，结构蛋白单体由于其较低的免疫原性而保护性较差，而病毒样颗粒很好的模拟了完整的病毒结构因而具有与减活病毒疫苗相当的免疫原性和保护性。平衡疫苗安全性和保护性这两项要素，病毒样颗粒是理想的备选疫苗。EV71病毒样颗粒的研究已经有近十年的历史，根据文献报道，使用昆虫杆状病毒表达系统可以成功制备出EV71病毒样颗粒，其原理是，通过杆状病毒载体在体外培养的昆虫细胞中共表达人肠道病毒71型病毒蛋白Pl和3CD，利用蛋白酶3CD特异性剪切Pl蛋白为VPO、VPU VP3三种蛋白，这三种蛋白在昆虫细胞中自组装成为病毒样颗粒。CVA16病毒也可以使用相同的方法制备病毒样颗粒。昆虫杆状病毒制备的病毒样颗粒的免疫原性已经得到证明。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种制备肠道病毒病毒样颗粒的方法，包括以下步骤(a)优化Pl基因，构建表达Pl蛋白的pYES2载体重组子；
(b)构建具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，优化3⑶基因，构建表达3⑶蛋白的pYES2-Trp载体重组子；
(c)将步骤(a)和步骤(b)中构建的载体重组子共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；
(d)将步骤(C)中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得肠道病毒病毒样颗粒，所述的肠道病毒病毒样颗粒由VPO、VP1、VP3三种蛋白单体组成。优选的，所述的步骤(C)中酵母发酵诱导培养基为YPG培养基，诱导表达的菌液初始浓度为10D，收菌浓度为50D。另一优选的实施例中，所述的肠道病毒为EV71病毒，包括以下步骤 (a)构建表达EV71-P1蛋白的pYES2载体重组子使用引物SEQID NO. 3、引物SEQ IDNO. 4，以基因合成产物SEQ ID NO. 11作为模板，通过PCR的方法扩增得到密码子优化后的EV71-P1基因片段，并对该扩增片段及PYES2载体分别进行Xhol/Xbal双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达EV71-P1蛋白的pYES2载体重组子pYES2_EV71_Pl ；
(b)构建具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，构建表达EV71-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子使用引物SEQ ID NO. 5、引物SEQ ID NO. 6以基因合成产物SEQ ID NO. 12作为模板，通过PCR的方法扩增得到优化后的EV71-3⑶基因片段，并对该扩增片段及pYES2-Trp载体分别进行BamHI/SphI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达EV71-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子pYES2-Trp-EV71_3CD ;
(c)将步骤(a)和步骤(b)中得到的重组子pYES2-EV71-Pl和pYES2-Trp-EV71_3CD共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；
Cd)将步骤(C)中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得所述的病毒样颗粒。另一优选的实施例中，所述的肠道病毒为CVA16病毒，所述的方法包括以下步骤
(a)构建表达CVA16-P1蛋白的pYES2载体重组子对基因合成产物SEQID NO. 13及pYES2载体分别进行Xhol/Xbal双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达CVA16-P1 蛋白的 pYES2 载体重组子 pYES2_CVA16_Pl ；
(b)构建具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp，构建表达CVA16-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子使用引物SEQ ID NO. 7、引物SEQ IDNO. 8，以CVA16病毒cDNA作为模板，通过PCR的方法扩增得到CVA16-3⑶基因片段，并对该扩增片段及pYES2-Trp载体分别进行BamHI/SphI双酶切处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达CVA16-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子pYES2-Trp-CVA16_3CD ;
(c)将步骤(a)和步骤(b)中得到的重组子pYES2-CVA16-Pl和pYES2_Trp-CVA16_3CD共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；
Cd)将步骤(C)中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得所述的病毒样颗粒。本发明的另一个目的在于，提供以上任一所述的方法制备得到的肠道病毒病毒样颗粒。本发明的第三个目的在于，提供以上所述的肠道病毒病毒样颗粒在制备预防肠道病毒感染疾病的疫苗中的应用。本发明的第四个目的在于，提供一种具有免疫原性的组合物，包括以上所述的病毒样颗粒和药学上可接受的载体。本发明的第五个目的在于，提供一种可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒的制备方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是一种可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤
(a)构建具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2_Trp，构建载体重组子PYES2-EV71-SP70-CVA16，该重组子可以表达SP70抗原表位置换为CV16相对应表位的EV71-P1重组蛋白；
(b)采用权利要求3的方法构建重组子pYES2-Trp-EV71-3CD;
(c)将步骤(a)和步骤(b)中得到的重组子pYES2-EV71—SP70-CVA16和 pYES2-Trp-EV71-3⑶共同转化进入酿酒酵母表达菌株，酵母培养发酵；
Cd)将步骤(C)中培养的酵母进行破碎、纯化和鉴定，即得所述的病毒样颗粒。另一优选的实施例中，所述的构建载体重组子pYES2-EV71-SP70-CVA16的方法制备重组子PYES2-EV71-P1，分别使用引物SEQ ID NO. I、引物SEQ ID NO. 9和引物SEQ IDNO. 2、引物SEQ ID NO. 10，以质粒pYES2_EV71_Pl为模板PCR，回收两种PCR产物并将其作为模板，使用引物SEQ ID NO. I、引物SEQ ID NO. 2进行Overlap-PCR，回收PCR扩增片段，并对该扩增片段及PYES2载体分别进行Xhol/Xbal双酶切处理，对两者进行连接及转化处理后，得到PYES2载体重组子pYES2-EV71-SP70-CVA16，该穿梭质粒可以表达SP70抗原表位置换为CV16相对应表位的EV71-P1重组蛋白。本发明的第六个目的在于，提供以上任一所述的方法制备得到的可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒。本发明的第七个目的在于，提供以上所述的可展示外源抗原的重组肠道病毒病毒样颗粒在制备预防手足口病的多价疫苗中的应用。本发明的第八个目的在于，提供一种具有免疫原性的组合物，包括以上所述的病毒样颗粒和药学上可接受的载体。本发明优点在于
本发明提供了一种新型的酵母来源的小RNA病毒科肠道病毒属病毒样颗粒的制备方法及其免疫原性检测的方法，以及以肠道病毒病毒样颗粒作为一种全新的多价免疫原展示平台的应用方法，免疫试验证明本发明制备的肠道病毒病毒样颗粒可产生保护性中和抗体。
附图I是EV71-VLP纯化及检测流程。附图2 是 pYES2-EV71-Pl 和 pYES2_EV71_3CD 载体构建图示。附图3是含有pYES2-EV71-Pl和pYES2_EV71_3CD表达质粒的INVScl酵母单克隆菌落。附图4是EV71-VLP蔗糖密度梯度离心蛋白质免疫印迹实验结果，图中三列印迹分别指示VPO (38KDa)和VPl (36KDa)，VP3 (27KDa)。(注资料中给出的图四中没有箭头，请确认，相应更正
或图片)附图5是EV71-VLP样品考马斯亮蓝染色结果，VPO (38KDa)，VPl (36KDa)，VP3 (27KDa)条带如图所示。附图6是EV71-VLP醋酸铀负染色样品透射电子显微镜成像照片。附图7是EV71-VLP小鼠免疫总IgG滴度测定(n=3)。附图8是EV71-VLP中和性抗体滴度测定(n=6)。附图9是CVA16-VLP蔗糖密度梯度离心蛋白质免疫印迹实验结果(Anti-VPO)，泳道1-13依次显示10-40%蔗糖密度梯度各密度组分。附图10是CVA16-VLP样品考马斯亮蓝染色结果，VPO (38KDa)，VPl (36KDa)，VP3 (28KDa)条带如图所示。
附图11是重组多价VLP蔗糖密度梯度离心蛋白质免疫印迹实验结果(Anti-VPO)，泳道1-12依次显示10-40%蔗糖密度梯度各密度组分。附图12是重组多价VLP醋酸铀负染色样品透射电子显微镜成像照片。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实验材料
1.菌株
大肠杆菌 DH5 a (Novagen)
酿酒酵母 INVScl (Invitrogen)
2.质粒
pYES2 (Invitrogen)、pGBKT7 (Clontech)
3.培养基
Luria-Bertani (LB)液体培养基1%(w/v)胰蛋白胨(OXIOD)，O. 5%(w/v)酵母抽提物(安琪酵母公司)，l%(w/v)氯化钠(Genebase), pH7. 0,121°C灭菌20min ;对于其固体培养基，在液体培养基的基础成分中再加入I. 5%琼脂粉(Genebase)。YPD 液体培养基1%(w/v)酵母抽提物(Angelyeast), 2%(w/v)蛋白胨(BD), 2%(w/V)D-葡萄糖(Genebase)，121°C灭菌20min ;对于其固体培养基，在液体培养基的基础成分中再加入I. 5%琼脂粉(Genebase)。YPG液体培养基l%(w/v)酵母抽提物(Angel yeast), 2%(w/v)蛋白胨(BD), 2%(w/v)半乳糖(J&K Scientific), 121°C灭菌 20min。Trp/Ura营养缺陷型液体酵母培养基0. 67%(w/v)酵母氮源(Genebase),
0.07%(w/v) -Trp -Ura Do Supplement (Shanghaigenomics),2%(w/v)D-葡萄糖(Genebase), 115°C灭菌15min ;对于其固体培养基,在液体培养基的基础成分中再加入
1.5% 琼脂粉(Genebase)。分子生物学试剂及材料
限制性内切酶KpnI、SphI、XhoI、XbaI、NcoI、ClaI (New England Biolabs)
DNA 聚合酶Prime STAR HS DNA Polymerase (TAKARA)
载体去憐酸化酶Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) (New EnglandBiolabs)DNA 连接酶DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 (TAKARA)
琼脂糖G-10 (Biowest)
DNA引物生工生物工程(上海)股份有限公司 DNA序列合成上海捷瑞生物工程有限公司
5.酵母转化相关试剂 PEG3350 (Sigma)
LiAc (Sigma)
Tris base (Genebase)
6.病毒样颗粒纯化相关试剂与材料
D-PBS Buffer Quick Solution Powder (Decent Biotech)
PEG8000 (鼎国昌盛)
蔗糖(AMRESCO)
蛋白酶抑制剂=PMSF (AMRESCO)、β巯基乙醇(Genebase)
超滤管截留量IOOKDa (Millipore)
蛋白质浓度测定试剂盒(BIO-RAD)
7.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及蛋白质免疫印迹实验相关试剂
丙烯酰胺(Genebase)、过硫酸铵(AMRESCO)、Tris base (Genebase)、盐酸(国药集团)、TEMED (Genebase)、甘氨酸(Genebase)、电泳缓冲液、膜转移缓冲液、TBST溶液、脱脂奶粉(光明)、Western Blue AP酶显色底物(Promega)、考马斯亮蓝R-250 (鼎国昌盛)
抗体抗EV71-VP1兔多抗(Abnova)、抗EV71-VP2鼠单抗(Chemicon)、山羊抗鼠AP酶交联单抗(Promega)、山羊抗兔AP酶交联单抗(Promega)
8.小鼠免疫相关材料和试剂 实验动物BALB/c雌性小鼠
佐剂Freund’ s adjuvant (Sigma)
哺乳动物细胞系RD细胞
抗体山羊抗鼠HRP标记单抗(Sigma)
病毒EV71中国安徽株
DMEM 培养基(Thermo Scientific HyClone)、月台牛血清(Thermo ScientificHyClone)、TMB 底物(Sigma)、IM 硫酸(国药)、PBS 溶液、PBST+1%BSA 溶液
9.实验仪器
场发射低温冷冻透射电镜(FEI Tecnai F20)
紫外分光光度计SmartSpec Plus (BIO-RAD)
PCR 仪C1000 Thermo Cycle (BIO-RAD)
恒温培养箱DNP-9162 (上海精宏实验设备有限公司)
GHP-9050 (上海一恒科学仪器有限公司)
恒温水浴锅DK-8D (上海一恒科学仪器有限公司)
冰箱4°C、-20°C (Haier)
低温冰箱-80°C MDFU53V (SANYO)
细胞破碎仪JN3000 Plus (JNBIO)摇床THZ-03MZR (SHENERGY BIOCOLOR)
THZ-C (培英)
ZHWY-211C (ZHCHENG)
常温台式离心机541 (Eppendorf)
冷冻台式离心机CT15RE (HITACHI)
冷冻落地式离心机5810R (Eppendorf)
超速离心机Optima L-80 XP (Beckman)
超净台AIRTECH
生物安全柜HR40-IIA2 (Haier)
电泳仪ESP300 (TANON)
酶标仪IMark microplate reader (BIO-RAD)
实施例I对PYES2载体营养缺陷型类型的改造
使用引物I (SEQ ID NO. I)、引物2 (SEQ ID NO. 2)，以pGBKT7质粒作为模板，通过PCR方法扩增色氨酸营养缺陷型基因表达盒(包涵启动子、阅读框和3’非编码序列)，并对该扩增片段及PYES2载体分别进行双酶切(Clal/Ncol)处理，对两者进行连接处理后，得到具有色氨酸缺陷互补基因且敲除Ura缺陷互补基因的改造载体pYES2-Trp。实施例2 EV71-VLP制备和免疫原性检测 实验方法
2.I载体构建
2.I. I对pYES2载体营养缺陷型类型的改造 与实施例I实验方法相同。EV71的Pl和3CD基因的导入
使用引物3 (SEQ ID NO. 3)、引物4 (SEQ ID NO. 4)，以基因合成产物I (SEQ ID NO. 11)作为模板，通过PCR的方法扩增得到密码子优化后的EV71-P1基因片段，并对该扩增片段及PYES2载体分别进行双酶切(Xhol/Xbal)处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达EV71-P1蛋白的pYES2载体重组子；使用引物5 (SEQ ID NO. 5)、引物6 (SEQ ID NO. 6)，以基因合成产物2 (SEQ ID NO. 12)作为模板，通过PCR的方法扩增得到EV71-3⑶基因片段，并对该扩增片段及pYES2-Trp载体分别进行双酶切(BamHI/SphI)处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达EV71-3CD蛋白的pYES2-Trp载体重组子。酿酒酵母转化实验
依照PYES2 user manual小量酵母转化操作方法，将重组子pYES2_EV71_Pl和pYES2-Trp-EV71-3CD共转入酿酒酵母INVScl菌株，使用Trp/Ura营养缺陷型固体培养基筛选得到具有以上两种重组子的酵母单克隆菌落，使用Trp/Ura营养缺陷型液体培养基对单克隆菌落进行培养，去少量菌液保藏于_80°C冰箱，余下用于发酵培养。酿酒酵母发酵培养和VLP诱导表达
取上一实验步骤中酵母菌液lOOul，接种于IOml Trp/Ura营养缺陷型液体培养基，300C 250rpm条件过夜培养；将此IOml菌液接种于IL Trp/Ura营养缺陷型液体培养基，300C 250rpm条件过夜培养后25°C IOOOg离心lOmin，弃上清，使用YPG液体培养基重悬菌体，以OD=I的接种密度接种于YPG培养基，300C 250rpm培养至密度为0D=5时，4°C 3000g离心30min，弃上清，使用预冷的D-PBS溶液清洗菌体，4°C 3000g离心30min，弃上清，菌体冷藏于-80°C冰箱。的纯化
将上述菌体以lg/ml的浓度重悬于预冷的D-PBS (含ImM PMSF、2mM 2-ME)溶液中，使用细胞破碎仪在4°C 1600Bar的条件下破碎重悬菌液3个循环，将破碎菌液于8000g 4°C条件下离心20min，取上清液加入PEG8000至终浓度为12%，4°C搅拌过夜，IOOOg 4°C条件下离心60min，沉淀重悬于2ml D-PBS溶液中，此即EV71-VLP粗提液；将粗提液置于10_50%(w/V)鹿糖D-PBS密度梯度上，Beckman SW28转子27000rpm 4°C离心Ihour (无刹车)，依照密度梯度分层收集样品，取少量进行蛋白质免疫印迹检测，确定含有EV71-VLP的组分，使用IOOKDa孔径蛋白质超滤管进行溶液置换和浓缩，得到终浓度lmg/ml溶于D-PBS溶液中的EV71-VLP样品(图I)。纯度和颗粒形态的检测
取上述EV71-VLP样品进行聚丙烯酰胺还原性变性电泳，使用考马斯亮蓝R-250染色液染色，观察样品纯度；取EV71-VLP样品进行醋酸铀负染色制样，使用透射电子显微镜观察样品并拍照(图I)。免疫原性检测
2.6. I小鼠免疫
将纯化得到的EV71-VLP溶于PBS溶液(200ug/ml)，伴以等体积的佐剂。随机取6周龄雌性BALB/c小鼠若干，每10只分为一组(n=10)，共三组，第一、二组分别接种EV71-VLP IOug/只、50ug/只，第三组(阴性对照)注射PBS溶液O. 5ml/只。每周取血制备血清样本冻存，每隔14天强化免疫一次。IgG效价检测
在96孔板上包被灭火的EV71病毒50ug/孔，4°C过夜，使用PBST+1%BSA溶液37°C封闭I小时，使用PBST溶液清洗3次，加入上述三组血清样本(使用10被稀释度梯度稀释，n=3)，37°C孵育I小时，使用PBST溶液清洗3次，加入山羊抗鼠HRP标记单抗(稀释度1:5000)，37°C孵育I小时，使用PBST溶液清洗7次，加入TMB底物反应，10分钟后使用IM硫酸终止反应，使用酶标仪在0D450处运用终点计量法检测数值。中和保护试验
使用DMEM+2%FBS培养基稀释上述三组血清样本(23到215的稀释倍数)，与等体积的EV71病毒液(100 TCID5tl)混合，37°C孵育I小时。将RD细胞铺于96孔板过夜培养，待其生长交会度约为80%时，使用上述血清病毒混合液孵育RD细胞IOOul/孔(n=6)。中和抗体保护性滴度定义为，产生CPE的孔数小于50%时的最大稀释倍数。实验结果
I.载体的构建
成功获得了具有Trp营养缺陷互补基因而敲除了 Ura营养缺陷互补基因的酿酒酵母表达载体 pYES2_Trp。在pYES2和pYES2_Trp载体的多克隆位点处分别成功导入了密码子优化后的EV71-P1和EV71-3CD蛋白质的基因(图2)。酵母转化和含有双质粒酵母单克隆菌落的获得成功共转化表达质粒PYES2-EV71-P1和pYES2_EV71_3CD进入INVScl酵母菌株，在Trp/Ura营养缺陷型固体酵母培养基上获得酵母单克隆菌落(图3)。的纯化和检测
通过对EV71-VLP蔗糖密度梯度实验的各密度组分进行蛋白质免疫印迹实验，发现组成EV71-VLP的两种蛋白质VPO和VPl主要集中在30%的蔗糖密度区间(图4)，再结合文献数据，提示EV71-VLP集中分布于30%蔗糖密度区间。取上述密度区间样品置于IOOKDa截留大小超滤管中进行浓缩和换液，浓缩和蛋白定量后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果(图5)显示，主 要包括三条蛋白条带，位置与组成EV71-VLP的三种蛋白单体VPO (38KDa), VPl (36KDa), VP3 (28KDa)分子量大小吻合。该样品的醋酸铀负染色透射电子显微镜成像结果可以清晰的看到EV71-VLP样品颗粒(图6)。免疫原性检测
体液免疫实验测定结果显示，接种EV71-VLP的小鼠，无论免疫剂量是IOug/只还是50ug/只，都在接种后产生了 IgG总量的显著提升，且在在初次免疫5到6周后达到峰值(O. 6 X 105)，而接种PBS溶液的小鼠的IgG总量没有明显变化，提示，EV71-VLP可有效激活体液免疫系统(图7)。细胞水平的中和抗体保护实验显示，EV71-VLP可诱导小鼠产生具有中和EV71病毒的保护性中和抗体，中和抗体滴度在初次免疫5到6周达到峰值，50ug免疫组(21°)略高于IOug免疫组(29)，而PBS阴性对照组，则不能产生有效保护性的抗体(图8)。综上所述，EV71-VLP可使小鼠产生体液免疫，并产生针对EV71病毒具有相当效价的的保护性中和抗体，说明EV71-VLP具有EV71病毒免疫原性。实施例3 CVA16-VLP的制备 实验方法
3.I载体构建
3.I. I对pYES2载体营养缺陷型类型的改造 与实施例I实验方法相同。CVA16的Pl和3CD基因的导入
对基因合成产物3(SEQ ID NO. 13，密码子优化后的CVA16-P1基因片段)及pYES2载体分别进行双酶切(Xhol/Xbal)处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达CVA16-P1蛋白的PYES2载体重组子；使用引物7(SEQ ID NO. 7)、引物8(SEQ ID NO. 8)，以CVA16病毒cDNA作为模板，通过PCR的方法扩增得到CVA16-3⑶基因片段，并对该扩增片段及pYES2-Trp载体分别进行双酶切(BamHI/SphI)处理，对两者进行连接处理后，得到可以表达CVA16-3⑶蛋白的pYES2-Trp载体重组子。酿酒酵母转化实验
依照PYES2 user manual小量酵母转化操作方法，将重组子pYES2_CVA16_Pl和pYES2-Trp-CVA16-3CD共转入酿酒酵母INVScl菌株，使用Trp/Ura营养缺陷型固体培养基筛选得到具有以上两种重组子的酵母单克隆菌落，使用Trp/Ura营养缺陷型液体培养基对单克隆菌落进行培养，去少量菌液保藏于_80°C冰箱，余下用于发酵培养。酿酒酵母发酵培养和CVA16-VLP诱导表达 与实施例2实验方法2. 3相同。
的纯化
与实施例2实验方法2. 4相同。纯度和颗粒形态的检测
与实施例2实验方法2. 5相同。实验结果
I. CVA16-VLP相关载体构建和酵母表达菌株的获得
与EV71-VLP载体构建相类似，在pYES2和pYES2_Trp载体的多克隆位点处分别成功导入了的CVA16-P1和CVA16-3⑶蛋白质的基因。载体共转酵母后成功得到CVA16-VLP表达菌株。 的纯化和检测
通过对CVA16-VLP蔗糖密度梯度实验的各密度组分进行蛋白质免疫印迹实验，发现CVA16-VLP组份之一的VPO蛋白主要集中在30%的蔗糖密度区间(图9)，结合CVA16与EV71的相似性，提示CVA16-VLP同样集中分布于约30%蔗糖密度区间。取上述密度区间样品置于IOOKDa截留大小超滤管中进行浓缩和换液，浓缩和蛋白定量后的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果(图10)与EV71-VLP纯化结果相似，同样主要包括三条蛋白条带，位置与组成CVA16-VLP的三种蛋白单体VPO (39KDa), VPl (36KDa), VP3 (28KDa)分子量大小吻合。实施例4
中国专利
发明者陈荣, 李浩洋, 吕柯, 何娅玲 申请人:中国科学院上海巴斯德研究所