一种多烯多醇大环内脂类化合物的生物合成基因簇的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种生物【技术领域】的新型抗菌抗肿瘤化合物WSS2277的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。该基因簇包括21个基因的核苷酸序列或由序列1形成的互补序列，其中负责碳骨架合成14个基因：siaA、siaB1、siaB2、siaC、siaD、siaE、siaF、siaG、siaH、siaI、siaJ、siaK、siaL、siaM，负责对生物合成进行调控的7个基因：siaN、siaO、siaP、siaQ、siaR、siaS、siaT。本发明提供了WSS2277生物合成相关基因的信息，为WSS2277生物合成的研究及遗传改造提供了基础；对其中的碳骨架合成基因进行修饰可以产生新的结构类似物；对其中的调控基因进行打断或高拷贝可以提供WSS2277或其衍生物的产量。本发明所提供的基因和蛋白也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
【专利说明】一种多烯多醇大环内脂类化合物的生物合成基因簇
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种生物医学【技术领域】的基因簇及其应用，具体涉及具有抗革兰氏阳性菌及抗肿瘤活性的抗生素WSS2277的生物合成基因簇的克隆、测序、分析及其应用。
【背景技术】
[0002]中国专利CN201010151873.4 (申请日2010年4月14日)公开了链霉菌(Streptomyces sp.SIIA-H8968)发酵产生的一种多烯多醇大环内脂类新抗生素WSS2277。多烯多醇类抗生素是一类具有特定结构的微生物天然产物，具有广泛的抗菌、抗真菌、抗肿瘤活性，其作用机制主要是与细胞膜中麦角固醇结合，干扰代谢、增加细胞膜通透性，导致细胞死亡。
[0003]研究证实WSS2277具有很强的抗革兰氏阳性菌和抗肿瘤细胞活性，其抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的IC9tl为0.58 μ Μ，抗人肺癌Α549细胞、人结肠癌ΗΤ-29细胞、人脑癌U-251MG细胞、人肝癌!fepG2细胞的IC50分别为0.079μΜ、0.090μΜ、0.092 μ Μ、0.110 μ Μ。与其它多烯类抗生素不同的是，WSS2277几乎不具有抗真菌活性(抗白色念珠菌(Canidia Albicans)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的 IC9tl 均大于 100 μ M),这预不着其可能存在特殊的作用机理，目前其作用机制尚不清楚。
[0004]关于WSS2277的生物合成途径至今尚未阐明，根据结构推测其由典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由一个1,3-二磷酸甘油酸的起始单元，12个丙二酰辅酶A的延伸单元，一个3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A的延伸单元进行组装形成碳骨架，途中经过多部还原及脱水，碳链末端环化形成邻羟基苯甲酸，最后二聚化形成最终产物。WSS2277的生物活性与其结构密切相关，随着WSS2277整个生物合成基因簇的克隆与功能分析，可以从分子水平上阐明WSS2277独特的生物合成机理，在此基础上运用代谢工程的原理，合理修饰WSS2277的生物合成途径，可以探索水溶性好`，生物利用度高，活性更好的新型衍生物。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于克服现有技术中的不足，公开WSS2277的生物合成基因簇，本发明包括由链霉菌Streptomyces sp.SIIA-H8968产生的具有抗革兰氏阳性菌及抗肿瘤活性的抗生素WSS2277的生物合成基因簇的克隆、测序、分析，为产生菌进行遗传改造生物合成系列衍生物提供了基础。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]本发明涉及一种WSS2277生物合成基因簇，其序列如序列I所示。
[0008]包括21个基因的核苷酸序列或由序列I形成的互补序列，其中负责碳骨架合成14个基因:siaA、siaBl、siaB2、siaC、siaD、siaE、siaF、siaG、siaH、sial、siaj、siaK、siaL、siaM,负责对生物合成进行调控的7个基因:siaN、siaO、siaP、siaQ、siaR、siaS、siaT。
[0009]本发明还提供了一个编码酮基合酶(KS)的核苷酸序列，由序列2中的氨基酸序列组成，命名为siaA，其基因核苷酸序列位于序列I中第582 - 1823碱基处。[0010]本发明还提供了一个编码丙二酸单酰辅酶A-ACP转酰基酶(AT)的核苷酸序列，由序列3中的氨基酸序列组成，命名为siaB2，其基因核苷酸序列位于序列I中第1859 - 2809碱基处。
[0011]本发明还提供了一个编码丙二酸单酰辅酶A-ACP转酰基酶(AT)/氧化还原酶(OR)的核苷酸序列，由序列4中的氨基酸序列组成，命名为siaBl，其基因核苷酸序列位于序列I中第3598 - 5949喊基处。
[0012]本发明还提供了一个编码烯酰辅酶A水合酶/异构酶的核苷酸序列，由序列5中的氨基酸序列组成，命名为siaC，其基因核苷酸序列位于序列I中第5950 - 6765碱基处。
[0013]本发明还提供了一个编码典型I型聚酮合酶(type I PKS)的核苷酸序列，由序列6中的氨基酸序列组成，命名为siaD，其基因核苷酸序列位于序列I中第7017 - 13772碱基处。
[0014]本发明还提供了一个编码典型I型聚酮合酶(type I PKS)的核苷酸序列，由序列7中的氨基酸序列组成，命名为siaE，其基因核苷酸序列位于序列I中第13790 - 20959碱基处。
[0015]本发明还提供了一个编码典型I型聚酮合酶(type I PKS)的核苷酸序列，由序列8中的氨基酸序列组成，命名为siaF，其基因核苷酸序列位于序列I中第20994 - 34916碱基处。
[0016]本发明还提供了一个编码典型I型聚酮合酶(type I PKS)的核苷酸序列，由序列9中的氨基酸序列组 成，命名为siaG，其基因核苷酸序列位于序列I中第34922 - 46726碱基处。
[0017]本发明还提供了一个编码典型I型聚酮合酶(type I PKS)的核苷酸序列，由序列10中的氨基酸序列组成，命名为SiaH，其基因核苷酸序列位于序列I中第46735 - 54993碱基处。
[0018]本发明还提供了一个编码典型I型聚酮合酶(type I PKS)的核苷酸序列，由序列11中的氨基酸序列组成，命名为sial，其基因核苷酸序列位于序列I中第54997 - 59922碱基处。
[0019]本发明还提供了一个编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HCS)的核苷酸序列，由序列12中的氨基酸序列组成，命名为siaj，其基因核苷酸序列位于序列I中第59949-61214碱基处。
[0020]本发明还提供了一个编码烯酰辅酶A水合酶/异构酶的核苷酸序列，由序列13中的氨基酸序列组成，命名为siaK，其基因核苷酸序列位于序列I中第61211 - 61966碱基处。
[0021]本发明还提供了一个编码酰基载体蛋白(ACP)的核苷酸序列，由序列14中的氨基酸序列组成，命名为siaL，其基因核苷酸序列位于序列I中第62065 - 62310碱基处。
[0022]本发明还提供了一个编码酮脂酰-ACP还原酶(KR)的核苷酸序列，由序列15中的氨基酸序列组成，命名为siaM，其基因核苷酸序列位于序列I中第62307 - 63056碱基处。
[0023]本发明还提供了一个编码完整膜蛋白的核苷酸序列，由序列16中的氨基酸序列组成，命名为siaN，其基因核苷酸序列位于序列I中第63164 - 63802碱基处。
[0024]本发明还提供了一个编码抗性转运蛋白的核苷酸序列，由序列17中的氨基酸序列组成，命名为siaO，其基因核苷酸序列位于序列I中第63907 - 64833碱基处。
[0025]本发明还提供了一个编码双组份调控系统反应调节蛋白(LuxR家族)的核苷酸序列，由序列18中的氨基酸序列组成，命名为siaP，其基因核苷酸序列位于序列I中第65330-65980碱基处。
[0026]本发明还提供了一个编码丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(STK)的核苷酸序列，由序列19中的氨基酸序列组成，命名为siaQ，其基因核苷酸序列位于序列I中第66262 - 68118碱基处。
[0027]本发明还提供了一个编码转录调控蛋白(GntR家族)的核苷酸序列，由序列20中的氨基酸序列组成，命名为siaR，其基因核苷酸序列位于序列I中第68316 - 68720碱基处。
[0028]本发明还提供了一个编码跨膜转运蛋白的核苷酸序列，由序列21中的氨基酸序列组成，命名为siaS，其基因核苷酸序列位于序列I中第68767 - 69747碱基处。
[0029]本发明还提供了一个编码抗性转运蛋白的核苷酸序列，由序列22中的氨基酸序列组成，命名为siaT，其基因核苷酸序列位于序列I中第69744 - 70688碱基处。
[0030]所述的序列I的互补序列可依据DNA碱基互补原则随时得到，序列I的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用限制性内切酶酶切DNA得到。
[0031]所述的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法从其他微生物中得到WSS2277生物合成基因的同源基因。
[0032]所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通过打断或修饰WSS2277生物合成的一个或几个结构基因而得的新的WSS2277衍生物。
[0033]所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因DNA片段通过打断或高拷贝SAI7248生物合成的调控基因来提高WSS2277或其衍生物的产量。
[0034]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果:利用本发明的基因簇可实现以下目的:
[0035]本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法从其他微生物中得到WSS2277生物合成基因的同源基因。
[0036]本发明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因DNA片段可用来从链霉菌Streptomyces sp.SIIA-H8968基因组文库中定位更多的文库粘粒。这些文库质粒至少包含有本发明中的部分序列，也包含有链霉菌基因组中以前邻近区域未克隆的DNA。
[0037]本发明所提供的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通过打断或修饰WSS2277生物合成的一个或几个结构基因或者引入其它同源基因而得的新的WSS2277衍生物。
[0038]本发明所提供的 核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通过打断或高拷贝SAI7248生物合成的调控基因来提高WSS2277或其衍生物的产量。
[0039]本发明所提供的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或基因簇可以通过遗传重组来构建质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。[0040]本发明所提供的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或基因簇可以通过合适的表达系统在外源宿主中表达以得到修饰的酶或更高的生物活性或更高的产量。这些外源宿主包括链霉菌，大肠杆菌，芽孢杆菌，酵母，植物和动物细胞等。
[0041]本发明所提供的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或基因簇可以通过转化、转导、接合转移等方式转入到其它聚酮类抗生素产生菌中，从而产生该抗生素的衍生物。
[0042]本发明所提供的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以被修饰或突变。这些途径包括插入或置换，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，或与其它来源的同源序列进行直接进化(DNA shuffling)，或提供紫外线或化学诱变剂等。
[0043]本发明所提供的核苷酸序列或部分序列可以用来分离所需的蛋白质并可用于抗体的制备。
[0044]本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某个或某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化蛋白动力学特征或其它致力于得到的性质。
[0045]本发明所提供的WSS2277生物合成相关的所有基因和蛋白信息，有助于阐明与理解WSS2277及相关多烯多醇大环内脂类抗生素及对称结构类抗生素家族生物合成的分子机理，从而为进一步利用基因工程手段改造提供理论基础与材料。本发明提供的基因及其所编码的蛋白质，也可以用来查找和发展可用于医药，工业，农业的化合物或蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1WSS2277的化学结构
[0047]图2WSS2277生物合成基因簇的结构组成
`[0048]其中:(A)4个重叠的粘粒代表了 Streptomyces sp.SIIA-H8968基因组73 kb的DNA区域；(B) WSS2277生物合成基因簇的结构组成。
[0049]图327 kb片段缺失突变株的构建与检测。
[0050]其中:(A)构建27 kb片段缺失突变株的过程示意图；(B)大片段缺失突变株的HPLC(高效液相色谱)检测，WT =Streptomyces sp.SIIA-H8968 野生型，ZYl, ZY2, ZY3:27 kb片段缺失突变株。
[0051 ] 图4推导的WSS2277生物合成途径示意图。
【具体实施方式】
[0052]以下结合附图对本发明的实施例作详细说明:以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等分子克隆:实验室手册(New York: Gold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0053]以下实施例中所涉及的菌种保藏信息如下:
[0054]链霉菌Str印tomyces sp.SIIA-H8968于2010年2月8日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号:CGMCC NO:3629 ;该单位的地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编:100101。
[0055]大肠杆菌DHlOB:购买自美国马里兰州盖色斯堡生物制剂公司Gibco_BRL。
[0056]1.WSS2277生物合成基因簇的克隆、分析:
[0057]如图1所示，WSS2277属于I型聚酮合酶合成的多烯大环内脂类抗生素，通过对其结构分析，我们推测其合成过程需要经历Beta-branch反应。以Beta_branch反应核心蛋白3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HCS)的核苷酸保守序列设计一对聚合酶链式反应(PCR)引物(5，- GAGGACCCGGTCWCSTWCGCSGTSAAC -3，)和(5，- AGCAGCCSGASCCGTASGAGAA-3’ )成功从WSS2277产生菌Sti^ptomyces sp.SIIA-H8968中扩增出一条预期大小的特异性产物，序列分析表明两者氨基酸序列的同源性达70%。接下来，通过两轮递归的聚合酶链式反应(PCR)筛选策略，从Str印tomyces sp.SIIA-H8968的基因组文库中筛选到了9个粘粒含有HCS相关序列，并最终通过酶切图谱分析，确认这9个粘粒属于同一序列重叠群(Contig)。为验证该序列重叠群(Contig)所含基因序列为WSS2277生物合成所必需，以粘粒15F2为出发，对其中含有HCS的27Kb序列，以卡那霉素抗性基因所替换，进行了大片段敲除实验。结果显示，Streptomyces sp.SIIA-H8968在缺失了该27Kb序列后,不再具有WSS2277的生产能力，如图3所示。由此说明，找到的序列重叠群(Contig)确实涵盖了 WSS2277生产所必需的关键基因。接下来，通过两轮染色体步移实验，最终确定了 10E3，16C9，3F8，8C8共4个粘粒涵盖的约73Kb的序列为整个WSS2277生产所必需的基因区域，如图2所示。
[0058]2.WSS2277生物合成基因簇边界的确定:
[0059]根据基因编码蛋白的功能分析，WSS2277的生物合成基因簇被确定为从基因siaA到siaT，涵盖了染色体 上73 kb的区域，包含21个开放读码框。通过基因中断实验进一步确认了 WSS2277生物合成基因簇的边界。中断orf-Ι不会影响WSS2277的生物合成，而中断相邻的siaA基因则失去产生WSS2277的能力，因此将基因簇的左边界定为siaA ;而根据生物信息学分析，基因SiaN — siaT编码负责调控和自身抗性的蛋白，这在抗生素的生物合成基因簇中是普遍存在的，同时WSS2277具有显著的抗革兰氏阳性菌的作用，因此基因簇中存在编码产生自身抗性的蛋白，而siaT的推测功能为抗性转运蛋白，对其中断可以显著降低WSS2277的产量，中断其相邻的基因orfl — orf3则不影响WSS2277的产生，所以将基因簇右边界定为siaT。
[0060]3.推测WSS2277的生物合成途径:
[0061]整个聚酮链的合成起始于I，3-二磷酸甘油酸被蛋白SiaD所识别，活化并加载，在接下来的模块2到模块7的六轮聚酮链延伸过程中，位于ClO与C16位酮基的还原由基因簇中的酮基还原酶所完成，而C12，C14，C18及其C20位的羟基的生成为游离的酮基还原酶SiaM所催化。当聚酮链延伸到模块8中时，由SiaA，C，J, K, L五个蛋白所共同完成类似于异戊烯基的烷基化反应生成了 C23的甲基以及C22-C24之间的双键。再接下来的模块9到模块11三轮延伸中，连续的四烯官能团得以形成；当模块13中的末端酮基还原酶将C33中的酮基加以还原时，WSS2277的生物合成进入了结束准备期。在最后一个模块14中，整个聚酮链经历了 C33-C34间反式双键的生成；C36-C31间自发环化成乙酰水杨酸环及其最终通过硫酯酶结构域进行整个聚酮链的二聚化及其分子内环化的三个复杂过程。这一系列精确的聚酮合成酶及其外源游离酮基还原酶SiaM的共同协作方式，保证了 WSS2277在菌株Streptomyces sp.SIIA-H8968中的顺利生成，如图4所不。
[0062]实施例1 WSS2277 产生菌 Str印tomyces sp.SIIA-H8968 基因组 DNA 的提取:
[0063]接种20 μ I 20% 甘油保存的 Streptomyces sp.SIIA-H8968 抱子至 10 ml 的种子培养基(TSB培养基，Oxoid公司)中，置于30°C摇床培养20小时，离心收集菌体待用，用500 μ I溶菌酶溶液重新悬浮50 mg菌丝体，在37°C温育约30 min，或温育至细胞成为半透明状。加入100 μ I 10% SDS，混合振荡约Imin直到溶液的粘度显著下降，37°C温育20min,然后加入250 μ I中性苯酹/氯仿,混合振荡均匀后，12000 r/min离心5 min,移取上清液，弃去白色中间层。用中性苯酚/氯仿重复二次抽提直至看不见(或非常少)中间层为止，最后加入0.1倍体积的3 M醋酸钠(pH自然)，混合后加入I倍体积的异丙醇(或2.2倍体积的无水乙醇)，再次混合后在室温下放置5 min (或者在_20°C放置30 min), 12000 r/min离心10 min,弃去上清液，用70%乙醇洗涤DNA沉淀两次，最后弃去所有上清液，待乙醇挥发后，溶解于一定量TE缓冲液中。
[0064]实施例2 WSS2277产生菌Str印tomyces sp.SIIA-H8968基因组文库的构建与筛选:
[0065]基因组文库的构建方法参照试剂盒CopyControl ? Fosmid Library ProductionKit提供的实验方法。
[0066]利用Beta-branch反应核心蛋白3_羟基_3_甲基戍二酰辅酶A合酶(HCS)的核苷酸保守序列设计一对聚合酶链式反应(PCR)引物(5’ - GAGGACCCGGTCWCSTWCGCSGTSAAC-3，)和(5，- AGCAGCCSGASCCGTASGAGAA -3’)成功从 WSS2277 产生菌 Str印tomyces sp.SIIA-H8968中扩增出一条预期大小的特异性产物，序列分析表明两者氨基酸序列的同源性达70%。根据此引物出发，利用聚合酶链式反应(PCR)来筛选基因组文库，首先将每个96孔板的克隆混合培养，提混合粘粒作为模板然后进行PCR反应，先将阳性信号定位于每个96孔板，同样的方法接着定位于排，最后定位`于点。
[0067]实施例3 WSS2277产生菌Str印tomyces sp.SIIA-H8968接合转移系统的建立:
[0068]收集生长于SFM培养基Streptomyces sp.SIIA-H8968的新鲜孢子备用。含有oriT的目标质粒必须在辅助质粒pUZ8002的协助下,才能通过接合转移导入到受体链霉菌细胞中。先将待转移到Str印tomyces sp.SIIA-H8968中的质粒转化大肠杆菌ET12567/PUZ8002，然后培养含目标质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，4 h后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体2次备用。作为受体的链霉菌孢子需经热激和预萌发处理。将链霉菌孢子重新悬浮于5 ml 0.05 M pH8.0的TES缓冲液中，在50°C水浴中热激10 min，冷却至室温后加入等体积2X孢子预萌发培养基(Oxoid酵母膏10%，Oxoid酪蛋白氨基酸1%，CaCl2 0.01M)预萌发2 -3 h，离心收集孢子并重新悬浮于适量的LB中，在混合器上振荡打散孢子，按IO8:1O8与大肠杆菌细胞等量混合，26-30 h后用I ml无菌水含适量抗生素和TMP (用来抑制大肠杆菌的生长)来覆盖，置30°C培养数天后即可看到接合子。
[0069]实施例4基因中断突变株的构建:
[0070]将构建的中断载体通过接合转移的方式转至Streptomyces sp.SIIA-H8968中，将生长出来的接合子在添加合适抗生素的SFM平板上抗性验证，验证正确后，分别接种于含有该抗生素和载体抗性抗生素的SFM平板中培养，挑选含有载体抗性抗生素平板上不能生长的菌落转接到种子培养基中提取总DNA，进行PCR验证正确后，突变株进行发酵培养。[0071]实施例5 WSS2277的发酵与分析:
[0072]发酵流程:
[0073]冻干管中菌种用种子培养基传一代后涂于SFM培养基，7天后收孢子于20%甘油管中保存。从甘油管中取适量孢子(约50 ul)接种至50 ml种子培养基(TSB培养基，Oxoid公司)，30°C，220 rpm培养24小时。以10%的接种量将种子接种至50 ml发酵培养基中(500 ml三角瓶)(葡萄糖10 g,糊精25 g,燕麦粉20 g，棉籽饼粉10 g，鱼粉5 g，酵母提取物2 g，碳酸钙3 g,蒸馏水定容至1000 ml，灭菌前将PH调至7.2)，30°C，220 rpm培养6天。[0074]分析流程:
[0075]发酵液离心取上清，加入等体积的正丁醇充分萃取，取Iml旋转蒸发去除溶剂，加Λ 100 μ I甲醇溶解，12000rpm离心3分钟取清液用于HPLC或LC/MS分析。
[0076]HPLC的分析条件为，流动相A:0.1%甲酸超纯水，流动相B:HPLC级乙腈，检测波长380 nm，0_5 min内，流动相B相从15%升至40%;5_7 min，流动相B维持在40%，;7_12min流动相B从40%升至55% ; 12-16 min,流动相B从55%升至85%; 16-34 min,流动相维持在85% ；34-35 min,流动相B从85%降至15%; 35-40 min,流动相维持在15%。色谱柱为Agilent TC-C18 (5 μ m, 4.6 X 250mm )反相柱，流速 0.6 ml/min，柱温箱常温。LC/MS 的分析条件为，检测模式为离子阱的正离子模式，干燥气流为101/min，喷雾器压力为30psi，干燥气温为350°C，多级质谱断裂分析轰击电压在1.0 - 1.8 V之间。所用仪器为安捷伦公司 Agilent 1100 series LC/MSDTrap system。
【权利要求】
1.一种新型抗菌抗肿瘤化合物WSS2277生物合成基因簇，其特征在于，包括21个基因的核苷酸序列或由序列I形成的互补序列，其中负责碳骨架合成14个基因:siaA、siaBUsiaB2、siaC、siaD、siaE、siaF、siaG、siaH、sial、siaj、siaK、siaL、siaM,负责对生物合成进行调控的 7 个基因:siaN、siaO、siaP、siaQ、siaR、siaS、siaT。
2.根据权利要求1所述的WSS2277生物合成基因簇，其特征是: 所述基因siaA，编码酮基合酶(KS)，由序列2的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第582 -1823位； 所述基因siaB2编码丙二酸单酰辅酶A-ACP转酰基酶(AT)，由序列3的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第1859-2809位； 所述基因siaBl编码丙二酸单酰辅酶A-ACP转酰基酶(AT) /氧化还原酶(0R)，由序列4的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第3598-5949位； 所述基因siaC编码烯酰辅酶A水合酶/异构酶，由序列5的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第5950-6765位； 所述基因SiaD编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS),由序列6的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第7017-13772位； 所述基因SiaE编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列7的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第13790-20959位； 所述基因SiaF编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列8的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第20994-34916位； 所述基因SiaG编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS)，由序列9的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第34922-46726位； 所述基因SiaH编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS),由序列10的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第46735-54993位； 所述基因sial编码典型的I型聚酮合酶(type I PKS),由序列11的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第54997-59922位； 所述基因siaj编码3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HCS)，由序列12的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第59949-61214位； 所述基因siaK编码烯酰辅酶A水合酶/异构酶，由序列13的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第61211-61966位； 所述基因SiaL编码酰基载体蛋白(ACP)，由序列14的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第62065-62310位； 所述基因siaM编码酮脂酰-ACP还原酶(KR)，由序列15的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第62307-63056位； 所述基因SiaN编码完整膜蛋白，由序列16的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第63164-63802位； 所述基因siaO编码抗性转运蛋白，由序列17的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第63907-64833位； 所述基因siaP编码双组份调控系统反应调节蛋白(LuxR家族)，由序列18的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第65330-65980位；所述基因siaQ编码丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(STK)，由序列19的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第66262-68118位； 所述基因siaR编码转录调控蛋白(GntR家族)，由序列20的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第68316-68720位； 所述基因siaS编码跨膜转运蛋白，由序列21的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第68767-69747位； 所述基因siaT编码抗性转运蛋白，由序列22的氨基酸序列组成，其基因核苷酸序列位于序列I中第69744-70688位。
3.根据权利要求1或2所述的WSS2277生物合成基因簇，其特征是，所述的序列I的核苷酸序列或部分核苷酸序列，通过聚合酶链式反应(PCR)或用限制性内切酶酶切DNA得到。
4.根据权利要求1或2所述的WSS2277生物合成基因簇，其特征是，所述的核苷酸序列或部分核苷酸序列，利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或以上序列的DNA作为探针进行Southern杂交或者碱基序列合成的方法得到WSS2277生物合成基因的同源基因。
5.根据权利要求1或2所述的WSS2277生物合成基因簇，其特征是，所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段通过打断或修饰WSS2277生物合成的一个或几个结构基因而得的新的WSS2277衍生物。
6.根据权利要求1或2所述的WSS2277生物合成基因簇，其特征是，所述的核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因 或DNA片段通过打断或高拷贝WSS2277生物合成的调控基因来提高化合物WSS2277或其衍生物的产量。
【文档编号】C12R1/465GK103820474SQ201210462273
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2012年11月16日 优先权日:2012年11月16日
【发明者】褚以文, 张春然, 翟龙飞, 孙敏 申请人:中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所