专利名称：一种三角帆蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因、蛋白及其抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(SolubleTNF-related apoptosis-inducing ligand, sTRAIL)基因、蛋白及其抗体的制备，属于生物技术领域。
背景技术：
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducingligand, TRAIL)，又称为凋亡素 2 配体(AP02 ligand, AP0-2L) (Wiley et al. , 1995 ；Pittiet al.，1996)，其胞外结构域在金属蛋白酶的作用下，可降解形成可溶性的细胞因子sTRAILCSoluble TRAIL )，TRAIL 具有 TRAIL 的生物学功能(Bodmer et al.，2000)。TRAIL 是TNF超家族中一类重要的跨膜细胞因子(Wiley et al. , 1995 ；Pitti et al.，1996)，可选择性地引起人类大多数肿瘤细胞发生细胞凋亡包括脑、肾、肝、肺、胃、结肠、乳腺、前列腺、胰腺、胆管、宫颈、皮肤和造血系统来源的肿瘤细胞，而对正常细胞无或仅具有极低的毒性(Dphil，2007;马远方，2007)，以TRAIL为靶点的分子治疗已成为肺癌等癌症治疗的新热点。我国是水产大国，三角帆蛘等贝类养殖是我国水产养殖的支柱产业之一。三角帆蛘不仅肉质细嫩、营养价值高，还具有抗癌降血脂等功效。目前国内外通过提取三角帆蛘等贝类体内的多糖等生物活性物质，并开发出了保健食品。但以上多为多糖等物质的混合物，是免疫调节产品，并且基础研究资料少，对肿瘤细胞的毒性作用较低，对其功效及副作用等所知不多。因此利用基因工程技术开发三角帆蛘中sTRAIL蛋白抗体产品，有助于新型抗肿瘤药物的研制与开发。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Soluble TNF-related apoptosis-inducing ligand, sTRAIL)基因、蛋白及其抗体的制备，设计了扩增三角帆蛘中sTRAIL编码序列的寡聚核苷酸引物，获得了三角帆蛘sTRAIL基因编码框全序列，并通过构建原核表达载体,表达并纯化了可溶性的sTRAIL蛋白质产品，并制备了其多克隆兔抗血清。为了达成上述目的，本发明的解决方案是
一种三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。—种三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白质，具有SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列。—种三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的抗体的制备方法，包括如下步骤
1)以三角帆蛘血淋巴细胞的总RNA为模板，反转录成cDNA，扩增sTRAIL蛋白基因的寡聚核苷酸引物，所述的引物具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列的，利用PCR技术获得具有SEQ ID NO. I所示的sTRAIL的基因编码框核苷酸序列；
2)利用DNA重组技术将sTRAIL基因编码框的序列片段克隆到合适的pMD19_T载体(Takara公司，日本)中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET_28 (a)原核表达载体(Novagen公司，美国)连接，利用PCR法筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的重组表达载体 pET-28a (+) -sTRAIL ；
3)将阳性重组质粒pET-28(a)_ sTRAIL转化到表达宿主菌万.coli Rossetta (DE3)(天根公司，中国)，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG) (Sigma公司，美国)诱导表达，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测；
4)将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒(Merck公司，德国)分离纯化重组蛋白质，制得的重组蛋白质具有SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列；
5)用纯化得到sTRAIL重组蛋白免疫新西兰大白兔，经过一次初始免疫和三次加强免疫后，颈动脉取血，分离血清，获得sTRAIL多克隆兔抗血清。本发明的有益效果为本发明设计了扩增三角帆蛘中sTRAIL编码序列的寡聚核苷酸引物，获得了三角帆蛘sTRAIL基因编码框全序列，并通过构建原核表达载体,表达并纯化了可溶性的sTRAIL蛋白质产品，并制备了其多克隆兔抗血清，有助于新型抗肿瘤药物的研制与开发。
具体实施例方式实施例I
本实施例的一种三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，具有SEQ IDNO. I所示的核苷酸序列。一种三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白质，具有SEQ IDNO. 2所示的氨基酸序列。一种三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的抗体的制备方法，包括如下步骤
I、PCR扩增剪取三角帆蛘的外套膜组织，用液氮研磨后，用TRIzoI (上海生工，加拿大)法提取三角帆蛘的的总RNA，利用反转录试剂盒(上海生工，加拿大)进行反转录，获得三角帆蛘的cDNA。以该cDNA为模板，设计扩增sTRAIL蛋白基因的引物，所述的引物具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，将设计好扩增sTRAIL蛋白基因的寡聚核苷酸引物序列作为目的片段进行扩增，进行嵌套聚合酶链式PCR反应，PCR扩增反应的参数为94°C预变性5min ;35个循环94°C 45sec, 58°C 45sec, 72°C 55 sec ;72°C 10 min ;获得具有SEQ IDNO. I所示的sTRAIL的基因编码框核苷酸序列。2.重组表达载体pET-28a(+)_sTRAIL的构建将PCR扩增得到的PCR产物与PMD19-T载体(Takara公司，日本)相连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(天根生物，德国)，涂布含氨苄青霉素的LB (上海生工，加拿大)筛选平板，挑取几个单克隆进行酶切和PCR鉴定；取一阳性克隆扩大培养，以碱裂解法抽提质粒，将纯化后的质粒以及和ZAoI限制性内切酶(上海生工，加拿大)双酶切，再插入经过同样双酶切的pET-28a(+)载体(Novagen公司，美国)的相应位点上，转化大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3) (Novagen，美国)。利用PCR法筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的重组表达载体pET-28a (+)-sTRAIL。3.重组蛋白的表达与鉴定将阳性重组质粒pET_28a(+)-sTRAIL转化表达宿主菌万.coli Rossetta (DE3 )(天根公司，中国)感受态，涂布含卡那霉素的LB(上海生工，加拿大)平板，37°C倒置培养过夜。挑取一个单克隆菌落，转入LB-Kan培养液(上海生工，加拿大)，37°C振荡培养过夜。取适量菌液，按1:100的比例扩大培养至OD6c 为O. 4-0.5时，将菌液分为若干等份，不加或分别加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG(Sigma公司，美国)诱导表达，使其终浓度在0-1. O mmol/L,继续培养6小时，离心收集细菌。细菌经超声波裂解后(300W，20分钟，超声2秒钟，间隔2秒钟)，离心分离上清液和沉淀，分别上样，进行SDS-PAGE电泳(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定目的蛋白。4、重组蛋白质的纯化将步骤3)中重组蛋白的表达为阳性的表达菌液扩大培养， 按上述方法进行超声处理后，将破碎过的菌液过Ni-NTA亲和层析柱(Novagen公司，美国)，sTRAIL重组蛋白结合在柱上,其它蛋白不能结合而流失；再利用蛋白试剂盒(Merck公司，德国)中提供的洗脱液，将sTRAIL蛋白洗脱下来，即得所需纯化的重组蛋白；采用12%的SDS-PAGE进行电泳鉴定；制得的重组蛋白质具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。5、蛋白质定量将纯化鉴定过的蛋白质按Brad-ford法进行定量(Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 1976，72:248-254)o6、sTRAIL多克隆兔抗血清的制备将纯化蛋白质定量后，取适量蛋白，挑选2只体重约2 kg的健康新西兰大白兔(雄兔)，进行多克隆抗体制备。用纯化所得的pET-28a(+)-sTRAIL为抗原加入等体积的佐剂充分乳化后免疫兔子，采用多点背部皮下注射，共免疫四次。(I)免疫前，从耳静脉处收集3_5ml正常血清作为抗体检测时的阴性对照。(2)用剪刀剪去兔子背部部分兔毛，酒精消毒后进行背部皮下多点注射。(3)初次免疫取约I mg抗原，加入等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后注射，背部选取8-10个点，每个点注射约0. I ml ;
(4)第二次免疫间隔14天后进行，抗原量为0.5mg，加入等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后注射，方法同上；
(5)第三、四次免疫间隔7天后按同样方法，进行第四次免疫后，从耳静脉采血Iml分离血清，用双相琼脂扩散法进行免疫血清的抗体效价检测，效价应达到1:16以上才能放血；
(6)血清分离第四次免疫后第4天，待抗体效价达到要求后，进行颈动脉采血并分离血清。分装后，保存于_80°C。7、抗体效价检测免疫后的兔抗血清用ELISA方法检测1:5000稀释的多克隆兔抗血清的效价，具体操作步骤如下
(I)包被与封闭用包被液将蛋白稀释至1-10 μ g/ml ;在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加入O. I ml，4°C过夜；弃去孔内溶液，用5%的脱脂奶粉封闭2 h，PBST洗3次，每次
5min。 (2)加样加入用PBST稀释指定倍数的待检抗血清于O. I ml于上述已包被的反应孔中，37°C孵育I h ；PBST洗3次，每次5 min (同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
(3)加酶标抗体于各反应孔中，加入O. Iml新鲜稀释的酶标抗体，37°C孵育I h，PBST洗3次，每次5 min。 (4)显色于各反应孔中加入新鲜配制的O. I ml OPD底物溶液，37°C，显色15-30分钟。 (5)反应终止于各反应孔中分别加入O. 05 ml反应终止液(2 M)。 (6)数据测定与计算用酶标仪于490 nm处测各孔的OD值，大于规定的阴性对照OD值的2. I倍，即为阳性。抗体效价计算公式为样本OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值。通过本实施例设计了扩增三角帆蛘中sTRAIL编码序列的寡聚核苷酸引物，获得了三角帆蛘sTRAIL基因编码框全序列，并通过构建原核表达载体，表达并纯化了可溶性的sTRAIL蛋白质产品，并制备了其多克隆兔抗血清，有助于新型抗肿瘤药物的研制与开发。SEQ ID NO. IATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTG
TCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCAGAGCAACTTGCACTCGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACGCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCCTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTAASEQ ID NO. 2
MVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFQSNLHSRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENAKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFSEQ ID NO. 3
sTRAILf :5’ 一 GAATGTTCAGAGCCTATTCC —3’
Adaptorp :5’ 一 CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC C TTTTTTTTTTTTTTT—3’
权利要求
1.一种三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，其特征在于具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
2.一种三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白质，其特征在于具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
3.—种如权利要求I所述的三角帆蛘的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤 1)以三角帆蛘血淋巴细胞的总RNA为模板，反转录成cDNA，扩增sTRAIL蛋白基因的寡聚核苷酸引物，所述的引物具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列的，利用PCR技术获得具有SEQ ID NO. I所示的sTRAIL的基因编码框核苷酸序列； 2)利用DNA重组技术将sTRAIL基因编码框的序列片段克隆到合适的pMD19_T载体中，再经限制性内切酶酶切，与经同样酶切的pET-28 (a)原核表达载体连接，利用PCR法筛选阳性克隆，经测序鉴定获得编码框正确的重组表达载体pET-28a(+)-sTRAIL ； 3)将阳性重组质粒pET-28(a)_ sTRAIL转化到表达宿主菌疋coli RossettaiM ,)，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测； 4)将阳性表达菌液扩大培养，利用蛋白质纯化试剂盒分离纯化重组蛋白质，制得的重组蛋白质具有SEQ ID NO. 2所不的氣基酸序列； 5)用纯化得到sTRAIL重组蛋白免疫新西兰大白兔，经过一次初始免疫和三次加强免疫后，颈动脉取血，分离血清，获得sTRAIL多克隆兔抗血清。
全文摘要
本发明公开了一种三角帆蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因，具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；一种三角帆蚌的可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白质，具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；及其抗体的制备。通过本发明得到三角帆蚌sTRAIL蛋白抗体产品，有助于新型抗肿瘤药物的研制与开发。
文档编号C12N15/28GK102965379SQ201210480470
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者杨受保 申请人:绍兴文理学院