专利名称：维生素c对效应记忆性t细胞的数量在体外扩增上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及维生素C对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增上的应用。
背景技术：
维生素C (Vc)是一种小分子药物，最早在临床上用于坏血病的治疗，其抗氧化作用被广泛的应用，近年来的研究发现，Vc在抑制肿瘤生长上发挥了一定的作用，并且可以高效的维持干细胞的存活和自我更新。HIV-I 感染导致的艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS)是本世纪威胁人类健康的重大传染病。目前，国际上多采用高效抗逆转录病毒(highly activeantiretroviral therapy, HAART)治疗艾滋病。HAART可在短期内将病毒载量控制在较低 的水平，改善艾滋病患者的生存质量，但不能完全清除体内病毒，需终身服药，且HAART费用昂贵、有严重的副作用、易耐药。随着我国HIV-I感染人数的日益增加，亟待研发新的行之有效的抗病毒治疗方法。随着研究的不断深入，发现特异性T淋巴细胞对于艾滋病患者的病毒清除和免疫重建中疗效显著。T细胞的体外扩增一直是免疫过继治疗的一大热点。在HIV-I病毒感染过程中，记忆性T细胞介导的免疫反应在清除HIV-I病毒方面发挥了关键性作用。并且效应记忆性T细胞(TEM)在病毒控制上效果更为显著。由于TEM细胞在T细胞的总数中占的比例非常小，用传统的体外扩增方法难以获得。目前一些研究者使用人工抗原来提成细胞，在体外提高T细胞的增殖并用于过继治疗，但是此技术成本闻并且尚未保证临床治疗的安全性。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供Vc对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增上的应用。本发明涉及Vc (Vc)对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增上的应用。本发明所述效应记忆性T细胞为⑶4+T细胞。本发明还提供了 Vc体外扩增T细胞的最适剂量为50 μ g/ml 125 μ g/ml，更优选为 100 μ g/mlο本发明采用小分子药物Vc对CD4+T效应记忆性T细胞进行了有效的体外扩增，并且找出了其促进体外扩增的最适浓度，该方法具有安全性高、成本低廉等优点，为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。
图Ia为不同浓度的Vc对⑶4+T细胞的扩增效果。图Ib为流式方法检测Vc对⑶4+T细胞的扩增效果。图2a为流式方法圈定待检测的⑶45RA_细胞。图2b为流式方法检测⑶4+TEM细胞。
图2c为不同浓度Vc处理后⑶4+TEM细胞比例的检测。图3为Vc处理后不同时间点的两组⑶4+TEM细胞数量的比较。
具体实施例方式为了更好地理解本发明的实质，下面结合试验和结果来说明Vc对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增上的应用。、试验材料
人的外周成分血由广州市血液中心提供，试验中随机选取了 20份正常人的血液样本。主要试剂RPMI1640培养基购自于INVERTR0GEN公司；胎牛血清购自于GIBCO公司；EDTA、BSA购于上海生工生物有限公司；Vc购自于SIGMA公司；淋巴细胞分离液购自 于天津灏阳生物制品有限责任公司；流式细胞仪检测抗体anti-⑶4-PE、anti_CD27_FITC、ant i-CCR7-PECY5、CFSE 购自于 BD 公司；anti-CD45RA_ECD 购自于 BECKMAN 公司；CD4+T 细胞阴性选择磁珠购自于BD公司。主要的实验仪器倒置生物显微镜(Leica)、CO2细胞培养箱(ThermoSCIENTIFIC)、台式高速离心机(Eppendorf Centrifuge 5810R)、生物安全柜(ThermoSCIENTIFIC)、流式细胞仪(Beckman Coulter 公司)、磁珠分选磁力架(BD Pharmigen) 、细胞培养
2.I细胞提取分离
将外周成分血与PBS (含2% BSA、0. 5% EDTA)按体积比1:4混合均匀；然后将稀释后的成分血液以1:1的体积比缓慢加入淋巴细胞分离液的上方；离心1450rmp 45 min ;小心吸取单核细胞，加入另一离心管中，用5倍体积的PBS (含O. 5% BSA,2% EDTA)稀释，混合均匀后，离心300Xg 15 min ;重复上一步骤一次；孵育⑶4+T细胞阴选试剂一抗，15 min ;用10倍体积的PBS (含O. 5% BSA,2% EDTA)稀释，离心300Xg 15 min ;磁珠二抗孵育，30 min ；进行过柱细胞分选，得到⑶4+T细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640重悬细胞，计数细胞后调整细胞至所需浓度。2. 2培养条件
将5X106/孔⑶4+T细胞置于I mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培养，培养条件是在5% CO2、饱和湿度及37°C下进行。、细胞铺板及加药处理
3.I铺板
将分选出来的CD4+T细胞铺在24孔板中，按照实验设计，每孔预期的细胞数为5X IO60铺板后用血球计数板和台盼蓝染色法进行细胞计数，每孔实际的活细胞数为
4.88X 106±1. 18X104。3. 2加药处理
对铺板后的CD4+T细胞进行5种不同的处理，每种处理设置三个复孔作为平行对照，并在细胞培养的第4天，第7天，第10天，第13天施加相应刺激。分组处理_
第一组~I μ g/ml (终浓度)Anti-CD3抗体+lug/ml (终浓度)Anti-CD28抗体+1 μ g/mL (终浓度)IL-7抗体+1 μ g/mL (终浓度)
_IL-15 抗体_
第二组~ I μ g/ml (终浓度)Anti-CD3抗体+1 μ g/ml (终浓度)Anti-CD28抗体+1 μ g/mL (终浓度)IL-7抗体+1 μ g/mL (终浓度)
_IL_15^^+5Q^g/ml (终浓度)Vc_
第三组~ I μ g/ml (终浓度)Anti-CD3抗体+1 μ g/ml (终浓度)Anti-CD28抗体+1 μ g/mL (终浓度)IL-7抗体+1 μ g/mL (终浓度)
_IL_15^^+75^g/na (终浓度)Vc_
第四组~I μ g/ml (终浓度)Anti-CD3抗体+lug/ml (终浓度)Anti-CD28抗体+1 μ g/mL (终浓度)I L-7抗体+1 μ g/mL (终浓度)
_IL_15^^+10Q^gM (终浓度)Vc_
第五组~I μ g/ml (终浓度)Anti-CD3抗体+lug/ml (终浓度)Anti-CD28抗体+1 μ g/mL (终浓度)IL-7抗体+1 μ g/mL (终浓度)_|lL-15 抗体+125ug/ml (终浓度)Vc。_3. 3细胞检测
在细胞培养的第14天，用血球计数板和台盼蓝染色法对每孔的活细胞进行计数，计算出不同处理作用下的CD4+T细胞的体外扩增倍数。在后续的实验中，选出最有利于CD4+T细胞体外扩增的刺激方式，进行下一步针对CD4+效应记忆T细胞的体外扩增实验。4、细胞亚群分析及细胞数量的检测
细胞培养10天，分别吸取不同供体(n=20)的培养孔中的细胞，用细胞计数仪进行计数；从相对应的培养孔中吸取5X10个细胞、离心300Xg 15 min，用PBS洗涤细胞两次，孵育检测⑶4+TEM的流式抗体(⑶45RA、⑶27、CCR7)半个小时；洗掉流式抗体，加入PBS稀释到相应浓度，运用流式细胞仪检测。对照组与实验组均为同一供体的⑶4+T细胞，每个时间点分别取不同供体的细胞进行检测。、统计学软件及统计方法
采用SPSS13. O分析软件进行统计学分析。计量资料所有结果均用均数土标准差表示。实验组与对照组比较采用t检验，P<0. 01为有显著性差异。、实验结果
6. I Vc对于⑶4+T细胞总数扩增效果的检测
选取V c处理第IO天的时间点进行检测，没有加V c处理对照组细胞数量为(9·29±0·81) XlO65Vc 浓度为 50 μ g/ml 的细胞数量为(9· 43±0· 41) XlO65Vc 浓度为75 μ g/ml的细胞数量为(9. 13±0. 76) X IO65Vc浓度为100 μ g/ml的细胞数量为(9·21±0· 15) XlO65Vc 浓度为 125 μ g/ml 的细胞数量为(8. 75±0. 16) X106，如图 Ia 所示。并对扩增结果进行CFSE检测，表示增殖的阳性峰在对照组和实验组之间没有差异，如图Ib所示，实验结果均显示，Vc对于CD4+T细胞的总量扩增没有影响。6. 2 Vc对CD4+TEM在CD4+T细胞中所占比例的流式检测
为了确定加入Vc刺激的CD4+T细胞中TEM的起始比例，将CD4+T cells以5X IO6个/孔铺于24孔板中，加入anti-⑶3抗体、anti-⑶28抗体、IL-2以及IL-15。对照组和实验组在10 d时使用流式抗体标记细胞，然后将样本通过流式细胞仪进行检测。从CD45RA阴性(C区域)的细胞中，选取⑶27与CCR7双阴性的细胞(J3区域)为所要观察的⑶4+TEM，如图2a、2b所示。按照上述通过流式细胞仪分选⑶4+TEM的方法，对⑶4+TEM在⑶4+T细胞中的比例进行检测。在⑶4+T细胞中，⑶4+TEM的比例随着Vc浓度的变化而呈现剂量依赖。未加Vc的对照组，CD4+TEM在CD4+T细胞中占13. 10%,向实验组中分别加入不同剂量的Vc后，Vc浓度为50 μ g/ml实验组CD4+TEM在CD4+T细胞中占17. 9% ；Vc浓度为75 μ g/ml实验组CD4+TEM在CD4+T细胞中占27. 6% ；Vc浓度为100 μ g/ml实验组CD4+ TEM在CD4+ T细胞中占38. 6%；Vc浓度为125 μ g/ml实验组⑶4+TEM在⑶4+T细胞中占30. 1%。实验结果表明，不同浓度的Vc对于CD4+TEM细胞的比例扩增作用在低于100 μ g/ml的情况下存在剂量依赖的趋势，100 μ g/ml是TEM细胞比例扩增的最佳Vc浓度，如图2c所示。6. 3 VitC对CD4+TEM细胞数量的影响
使用Vc (100 μ g/ml)处理细胞后，分别选取3个时间点使用流式细胞仪和细胞计数仪检测⑶4+TEM细胞的数量。药物处理O d，对照组同实验组细胞数量为I X IO6 ;第10天，对照组细胞数量为(I. 23±0· 15) X106，实验组细胞数量为(3. 56±0· 35) XlO6 ;第15天，对照组细胞数量为(1·85±0·75)Χ106，实验组细胞数量为(5·47±0· 11) Χ107。选取扩增效果达到最高点(第15天)的两组⑶4+ TEM细胞数量进行比较，对照组为(I. 85 ±O. 75) X IO6,实验组为(5. 47±0. 11) Χ107，两组间细胞数量差别有统计学意义0°〈0. 001)，如图3所示。结果分析
我们首次利用小分子药物Vc促进CD4+TEM细胞在体外的扩增。实验组中，CD4+细胞的 总数没有变化；但较对照组相比CD4+TEM细胞的比例在CD4+T细胞中有显著的提高；通过对⑶4+ΤΕΜ数量的检测，在实验组中发现⑶4+ΤΕΜ细胞数量有显著的扩增。T细胞的免疫过继治疗当中，如果大量的过继转移T细胞会产生过激反应，在实验过程中，我们找到了在T细胞总数不变的情况下，将大量的初始T细胞转化为CD4+TEM细胞的方法。实验中我们也进一步找出了 Vc可促进⑶4+ΤΕΜ在体外扩增的最适浓度100μ g/ml。我们发现，使用较低剂量的Vc处理细胞后，⑶4+TEM细胞在⑶4+T细胞中的比例上升存在显著的剂量依赖趋势；而当Vc的浓度达到125μ g/ml时，比例上抬效果明显下降(如图2c所示)，这可能是由于药物浓度过大使得细胞的生长环境发生了较大的改变而影响了细胞的正常生长。在本实验中，选取Vc处理细胞的10天以后进行计数和检测是由于在外周血中⑶4+TEM的起始数量非常少，⑶4+T细胞需要较长的时间才能在anti-⑶3与anti-⑶28共同刺激下逐渐形成较多的CD4+TEM。实验结果也表明选择培养较长时间后方进行检测可获得更好的效果(如图疒3)。Vc作为一种抗氧化剂，无毒副作用，易获得，作为常用的小分子药物具有较高的生物安全性，广泛的用于医疗，Vc在CD4+TEM的扩增作用可以作为新型的治疗方式用于艾滋病过继治疗当中，其作用机制有待后续的进一步研究。
权利要求
1.维生素C对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增上的应用。
2.根据权利要求I所述的维生素C对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增上的应用，其特征在于，所述效应记忆性T细胞为⑶4+T细胞。
3.根据权利要求I所述的维生素C对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增上的应用，其特征在于，所述维生素C的浓度为50 μ g/ml ^125 μ g/ml。
4.根据权利要求3所述的维生素C对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增上的应用，其特征在于，所述维生素C的浓度为100 μ g/ml。
5.根据权利要求I所述的维生素C对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增上的应用，其特征在于，所述效应记忆性T细胞的提取方法是先将外周成分血与含2% BSA和O. 5%EDTA的PBS按体积比1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的体积比为1:1 ;离心1450rmp 45 min ;小心吸取单核细胞，置入另一离心管中，力口入5倍体积的含O. 5% BSA和2% EDTA的PBS稀释，混合均匀后，离心300 X g 15 min ;重复上一步骤一次；孵育⑶4+T细胞阴选一抗，15 min ;用10倍体积的含O. 5% BSA和2% EDTA的PBS稀释,混合均勻后,离心300 Xg 12 min ;孵育带有磁珠的二抗,30 min ;过柱进行细胞分选，得到⑶4+ T细胞。
6.根据权利要求I所述的维生素C对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增上的应用，其特征在于，所述效应记忆性T细胞的培养方法是在5% CO2、饱和湿度及37°C条件下将5 X IO5个/孔的CD4+T细胞置于I mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培养。
全文摘要
本发明公开了维生素C对效应记忆性T细胞的数量在体外扩增的应用，并且找出了其促进体外扩增的最适浓度。该方法具有安全性高、成本低廉等优点，为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。
文档编号C12N5/0783GK102925411SQ201210502579
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者张辉, 张译文, 罗海华, 刘超 申请人:中山大学