水稻抗高温相关基因OsZFP、筛选标记及其分离方法

水稻抗高温相关基因OsZFP、筛选标记及其分离方法
【专利摘要】水稻抗高温相关基因OsZFP、筛选标记及其分离方法。本发明提供一种经分离的水稻内源抗高温基因（简称OsZFP基因）及其所编码的多肽；包含本发明的抗高温基因或其所编码的多肽的优选水稻细胞以及所述植物细胞的制备方法。并进一步提供选育作物抗高温新品种的新方法和新技术包括抗高温相关的调控序列和标定所述抗高温基因的紧密连锁分子标记及其序列。
【专利说明】水稻抗高温相关基因OsZFP、筛选标记及其分离方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程和分子育种【技术领域】。具体地说，更具体而言，涉及植物抗高温基因的定位、分离、功能分析、序列特征化、调控序列鉴定和共分离分子标记筛选与创造及其在改良水稻等作物的抗逆性方面的应用水稻中的一种抗高温基因的遗传转化和分子标记辅助选择方法与程序。此外本发明还涉及借助所述利用抗高温基因来改良水稻等作物的抗逆性方面的应用。
【背景技术】
[0002]水稻是最重要的粮食农作物，而且是世界上一半以上人口的主要食物来源(Khush, 2005)，报道显示，水稻产量以每年0.6-0.9%增长速率才能在2050年满足人们生活的需求(Carriger and Vallee, 2007)。作物产量的增加依赖农田，农业生产的可持续发展需要避免环境的恶化、生态平衡的破坏以及生物多样性的丧失(Cassman, 1999; Tilmanet al.，2002)。作物产量主要是由光合作用和呼吸作用决定的，然而，光合作用和呼吸作用均对温度敏感(Yoshida, 1981)，此外还受空气中C02浓度(Baker et al.，1990)、臭氧层(Maggs and Ashmore, 1998)的影响，这些因素也和温室效应有关(Rosenzweig andParry, 1994)。
[0003]气候的持续变暖已经给水稻生产带来灾难性的影响。2006和2007年，中国长江中下游的重庆、湖北、湖南、安徽、浙江和广东等省区连续两年出现大范围持续38°C以上的高温天气，导致水稻等粮食作物大面积减产，严重的使其结实率不到50%。因此，育种上迫切需要可资利用的抗高温遗传资源用以应对全球升温给水稻生产带来的严重威胁。因此，广泛开展耐热研究、深入挖掘抗高温遗传资源，努力从植物耐热新品种选育角度应对全球升温给水稻生产带来的严重威胁无疑在理论上和实践上都有重要意义。
[0004]近年来，国内外就水稻孕穗期(赵志刚等，2006)、抽穗期(张永生等，2009; Zhanget al., 2009)、开花期(曹立勇等，2003，2002 ;盘毅等，2005 ;陈庆全等，2008 ;张涛等，2008 ;奎丽梅等,2008 ; Zhang et al., 2009 ;Jagadish et al., 2010 ;)、灌衆期(朱昌兰等，2005 )以及稻米直链淀粉含量合成和胶稠度形成(朱昌兰等，2006 )等时期的抗高温特性进行了大量的遗传分析和染色体定位，定位到的耐热水稻数量形状(简称QTL)涉及水稻的每一条染色体，其中，遗传效应最显著的一个QTL位点是来自巴基斯坦的品系Bala，其对表型变异的解释率达18%。然而，由于不同的研究者使用的试验材料和高温处理程序与方法的不同，所获得的实验数据彼此难以相互印证和重演，所定位的QTL区间相对较大，以致无法确定候选基因和进行相关的分子克隆及功能互补验证。因此，对上述定位的耐热QTL而言，不仅在理论上缺乏必要的数据支持，而且在生产实践上也难以有效利用。
[0005]此外，一些研究者还通过同源克隆法对水稻耐热相关基因进行了研究。Yamanouchi等(2002)利用图位克隆法定位并克隆了一个关于水稻斑点基因Spl7，发现它的一个阅读框和热胁迫转录因子高度相似，在热胁迫条件下，突变体和野生型Spl7的表达量都上调。Yokotani等(2008)把水稻编码0sHsfA2e的耐热基因转移到拟南芥中去，转基因拟南芥对环境胁迫的耐性增强。对非胁迫条件下过量表达的拟南芥植株进行芯片分析，发现与胁迫相关的一些基因表达量升高，这其中包括几类热激蛋白。
[0006]—般认为,热激蛋白(heat shock protein, HSP)与高温响应相关。已有的报道结果显示rHsp90对盐、干旱及高温等几种胁迫均有响应，且42°C和50°C的高温处理30分钟能使rHsp90表达量显著增加(Liu等，2006)。另有报道结果显示水稻中有40个包含α-晶体的基因，其中，23种为热激蛋白(Sarkar等，2009)。对其进行芯片和RT-PCR分析表明，23个热激蛋白中的19个在高温下表达量上调。另外，Chang等人(2007)把水稻热激蛋白HsplOl转到烟草中，发现过量表达的植株在高温下存活情况比野生型对照要好。Wu等(2009)用HSPlO启动子驱动OsWRKYll表达，发现水稻转基因植株热处理后叶片萎焉较慢，存活率高。Yokotani等人(2011)通过在拟南芥中过量表达水稻OsCEST (叶绿体蛋白-能增强胁迫耐性)基因，发现转基因植株不仅耐盐胁迫，而且抗旱和抗高温。
[0007]锌指蛋白(Zinc finger protein)是一个庞大的转录因子家族,在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中(Gerisman & Pabo, 1997 ；Laity et al., 2001),特别是在抗逆基因表达调控中起重要作用(Li & Chen，2000)。根据锌指蛋白中半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基的数目和位置，可将含锌指蛋白结构域的转录因子分为C2H2，C2C2，C3H，C3HC4 (即RING finger),C3HC5 (即LM finger)等亚类。其中，C2H2型锌指蛋白是锌指蛋白中研究最为清楚的一类，由两个半胱氨酸和两个组氨酸与Zn2+形成配位键，进而形成一个包含β折叠和一个α螺旋的紧密指状结构。Kim等(2001)从大豆00嫩文库中分离到冷诱导锌指蛋白基因SC0F-1，其编码产物含有两个典型的C2H2锌指结构，SC0F-1的表达受低温和ABA的特异性诱导，而不受盐胁迫诱导，转基因研究证实SC0F-1的过量表达可以增强拟南芥和烟草的耐冷性。刘萌萌等(2007)克隆的一个大豆C2H2型锌指蛋白转录因子基因GmC2H2的表达与低温、ABA的胁迫诱导相关。至于C3HC4型兼CHY型锌指蛋白只在拟南芥、水稻、球蒴藓、沙蒿、玉米、菠萝、大豆等几种植物中有成功分离的报道(Stone etal.,2005 ；Ohyanagi et al.,2006 ；Rensing et al., 2008 ；Yang et al.，2008 ；Alexandrovet al.,2009 ;杨祥燕 等，2009 ;吴学闯等，2010)。沙蒿AdZFPl基因是编码这类锌指蛋白的典型例子(Yang等2008)，半定量PCR分析表明，AdZFPl基因受外源ABA的强烈诱导，同时在一定程度上受高盐、低温和高温的诱导。吴学闯等(2010)从大豆旱处cDNA文库中也筛选到一个编码C3HC4型锌指蛋白基因GmRZFPl，研究结果显示，该基因主要受高温和干旱的诱导，当高温胁迫1-6小时，GmRZFPl基因表达量与处理时间成正相关，胁迫12小时有则所下降，到24小时时，其表达量最高。这些研究结果因此表明GmRZFPl基因受多种胁迫处理的诱导，可能涉及到多种逆境胁迫信号传导。
[0008]此外，Huang等(2008)在粳稻上找到12个A20/AN1类型的锌指蛋白，芯片分析发现低温、干旱和H202分别诱导其中的四个基因(ZFP177，ZEP181，ZFP176, ZFP173)、两个基因(ZEP181和ZFP176)和一个基因(ZFP157)表达。进一步的研究表明ZFP177对低温和高温胁迫均有响应。对ZFP177基因进行过量表达，所获得的转基因烟草能耐2°C的低温和55°C的高温，但对盐胁迫和干旱胁迫反而更敏感，这说明ZFP177在植物各种非生物胁迫中起着重要的作用，但是不同的胁迫作用可能有不同的响应机理。
[0009]参考文献:
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[0010]发明概述
为解决上述问题，本申请的发明人通过锐意研究，开发出一种优化的定位植物抗逆性基因，尤其是抗高温基因的方法，提供了多种新的基因筛选、定位标记，并精确定位了一种水稻抗高温新基因，由此提供了将温度敏感型植物恢复为非温度敏感型植物、将普通植物转化为抗高温植物的育种方法。具体而言，本发明涉及下述方面:
I).一种多肽,其为选自下述任一:
A)包含如SEQID N0.3所示的氨基酸序列的多肽；
B)包含在如SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列中或经缺失、替换、插入一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，所述多肽具有抗高温功能；
C)具有SEQID N0.3所示的氨基酸序列的多肽；
D)氨基酸序列如SEQID N0:3所示的多肽。
[0011]2).一种基因该基因的多核苷酸序列为选自以下任一的多核苷酸序列:
A)包含如SEQID N0.1所不的核苷酸序列的多核苷酸；
B)包含对应于如SEQID N0.1所示的核苷酸序列中的第-1395到-1406位核苷酸为GGGGGGGGGGGG保持不变，在除此之外的核苷酸序列中经缺失、替换、插入一个或多个核苷酸所得的多核苷酸序列，其所编码的多肽具有抗高温功能；
C)具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列的多核苷酸；
D)核苷酸序列如SEQID NO:1所示的多核苷酸；
E)编码如权利要求1所述任一种的多肽的多核苷酸序列。
[0012]3).包含项所述2的基因的载体。
[0013]4).一种宿主细胞，其特征在于所述的细胞包含项I所述的多肽，或者项2所述的基因，或者项3所述的载体，所述宿主细胞优选真核生物细胞，更优选植物细胞和酵母细胞，所述植物细胞优选禾本科植物细胞，特别优选水稻sativa L.)细胞。[0014]5).用于筛选、定位、分离新核苷酸序列的分子标记，所述标记选自:
A)插入/缺失标记InDel5，该标记位于水稻第九染色体距短臂端9130_9150kb之间，所述标记的扩增产物具有长度多态性；
B)SNP标记，简称RBspl407，在感高温水稻和抗高温水稻植株中，基于SEQ ID NO:1所述多核苷酸序列，所述标记对应序列分别为TGT-3060ACA和TGG-3060ACA;
C)微卫星DNA标记RM7364，该标记位于水稻第九染色体距短臂端9440_9450kb之间，所述标记经引物的扩增产物具有长度多态性。
[0015]6).项5所述的标记在筛选、定位、分离抗/感高温基因中的应用，其中所述的高温优选42°C或以上，45°C或以上，48°C或以上，或50°C或以上。
[0016]7).植物育种方法，所述方法包含应用项2所述的基因，或应用项I所述的多肽，或项3所述的载体,或项4所述的宿主细胞,或项5或6所述的标记。
[0017]8).使温度敏感型水稻恢复为非温度敏感型水稻的方法，该方法包括通过遗传操作使温度敏感型水稻基因组第9号染色体中相应于SEQ ID NO:1第-3060位的核苷酸突变为G。
[0018]9).诱导水稻抗高温表型的方法，该方法包括通过遗传操作使不具备抗高温表型的水稻基因组第9号染色体中相应于SEQ ID NO:1第-1394位的5'端插入G，其中，所述的高温优选42°C或以上，45°C或以上，48°C或以上，或50°C或以上。
[0019]10).使温度敏感型水稻为抗高温型水稻的方法，该方法包括通过遗传操作使温度敏感型水稻基因组第9号染色体中相应于SEQ ID NO:1第-3060位的核苷酸突变为G，并且使其温度敏感型水稻基因组·第9号染色体中第-1394位的5 '端上游插入一个G，使所得核苷酸序列与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中的第-1395到-1406位核苷酸相同，即自-1395位起远离起始密码子方向序列包含连续的12个G，其中，所述的高温优选42°C或以上，45°C或以上，48°C或以上，或50°C或以上。
[0020]11)本发明涉及用于鉴定植物抗高温特性的方法，所述方法可概括如下:即以两叶一心期至三叶一心期的土培秧苗，经45-48°C高温处理79h，恢复5d后观察温度反应结果，作为耐高温鉴定的标准程序，相对湿度和其它栽条件设置在相同水平上。
[0021]12)上述第11项所述方法，优选还包括每次所用盆栽盆的大小均为长43cm，宽33cm和高10cm，盆栽土经称量后等量加入，栽培规格为每品种5行，每行12株，周围种植I行高温材料作为保护行，以消除边际影响，保护行和正式实验材料间预留清晰的界限；处理时生长箱内的湿度设定为75%，光暗周期轮换的时长设定为12h。
【专利附图】

【附图说明】
[0022]图1高温胁迫处理试验和抗、感品种HT54及HT13的耐高温反应。图中所示为处在两叶一心期的土培苗经不同高温处理79小时恢复5天后的生长状况，A:42°C高温处理；B:45°C高温处理；C:48°C高温处理；从图中照片结果可以看出，抗高温品种HT54和感高温品种HT13对45°C和48°C高温处理的热激反应都呈现质的存活与死亡差异。
[0023]图2为水稻抗高温基因定位建立的微卫星分子标记(SSLP)连锁遗传图。标记间的图距为物理距离。
[0024]图3 HT54 (抗)X HT13 (感)杂种F2代抗高温位点的初步连锁群检测结果。所用的分子标记为位于水稻第九连锁群的SSR标记RM444。图中，M表不分子量标记；RP为抗高温亲本；SP为感高温亲本；RB为抗高温极端单株DNA池；SB为感高温极端单株DNA池；Fl为杂种一代植株；1_9为F2隐性感高温极端单株。
[0025]图4抗高温基因OsHTAS在第9染色体上的连锁遗传图谱。(a):由61株定位群体产生的连锁遗传图谱；(b):由131株定位群体对(a)图中黑色区段精细定位产生的连锁遗传图谱。
[0026]图5利用候选基因(ZFP)序列中于抗、感高温亲本间呈现的一个单核苷酸多态性(SNP)转换的PCR-RFLP标记对用InDel5和RM7364标记定位时作图群体中出现的交换株进行检测的结果。图中，M、RP、SP、S分别表示分子量标记(DL2000)、抗高温亲本HT54、感高温亲本HT13和3个交换株。
[0027]图6 ZFP抗、感等位基因对45°C高温胁迫处理的动态表达模式分析。所用的分析方法为RT-PCR半定量分析法。PCR扩增数为25个循环，并以水稻肌动蛋白基因actin作为内标。图中，从上至下4排分别为HT54 (抗)/actin、HT13 (感)/actin、HT54 (抗)/ZFP和HT13 (感)/ZFP。图中可见，ZFP在处理6小时的抗、感高温样本中分别呈上调和下调表达。
[0028]图7抗高温基因OsZFP编码序列的亚细胞定位分析。图中显示:与对照35S-YFP相比，35S-ZFP-YFP即抗高温基因编码产物与黄色荧光蛋白的融合蛋白主要定位于细胞膜上。
[0029]图8本申请中所涉及的抗高温基因flsZ/P DNA序列、编码序列及其产物氨基酸列。
[0030]发明详述
为解决上述问题，本发明人经过锐意研究，在大量试验结果的基础上，完成了本发明。以下结合附图对本发明进行具体说明。
[0031 ] 一，水稻苗期耐高温标准化鉴定程序
首先，发明人建立了水稻苗期耐高温标准化鉴定程序。该鉴定程序的突出优点是抗、感分型清楚、结果重衍性好、实际应用性强。因此，该程序的建立将为水稻抗高温种质资源材料的筛选、评价，抗高温基因的遗传分析、染色体定位与克隆提供良好的技术基础。具体鉴定内容请参见实施例1所述的内容。
[0032]二，水稻抗高温基因进行了分子定位
在以上试验结果的基础上，发明人利用抗高温水稻材料HT54、感高温水稻材料HT13及其杂交后代Fl和F2为示例性试验材料，对水稻抗高温基因进行了分子定位。
[0033]试验方法
(I).亲本多态性标记的筛选
水稻抗高温基因的分子定位选用多态性高和重复性好的微卫星DNA长度多态性分子标记(SSLP)进行,所用SSR引物均根据Gramene数据库(www.gramene.0rg)和NCBI (www.ncb1.nlm.nih.gov)数据库上公布的引物序列，由上海生物工程技术服务公司合成。
[0034]水稻基因组DNA的抽提采用McCouch等(1988)报道的小量DNA提取法。具体方法步骤如下:1)剪取一小片叶片4-5 cm，加入700yL 1.5 X CTAB (含1.5% CTAB，75 mMTris-HCI, 15mM EDTA，1.05 M NaCl)，充分研磨；2)将研磨的匀浆转入1.5 ml的离心管，56°C水浴20 min后冷却至室温；3)加入等体积的氯仿:异戍醇(24:1),摇匀；4)最高速度(13200 rpm)离心10 min ；5)将上清液转入新的离心管,并加入两倍体积的预冷的100%酒精，静止20 min后离心收集DNA ；6)去上清，风干DNA，加50-100 μ L双蒸水，于紫外分光光度计中检测，稀释DNA浓度，制备一套DNA工作溶液，其浓度为50-100ng/ μ L左右，4°C冰
箱保存备用。
[0035]2)定位群体的构建
2008年秋在广东农科院水稻所试验基地以抗高温材料HT54为父本、高温敏感材料HT13为母本配制杂交组合。母本HT13以“温汤杀雄”的方法进行处理，考虑到HT13是对温度敏感的材料，温汤杀雄的温度的设定比通常情况低2°C，以避免其雌蕊受到伤害。具体做法是:于水稻抽穗期，在晴天的上午7:30左右，选好母本HT13的穗子(抽出2/3)，将水温调制到43°C的暖水瓶倒置套住母穗，并用棉花塞住瓶口保温，Smin后取出穗子，抖掉水珠，有部分颖花(已开花授粉或过几天才能开花)不开，应全部剪去，并立即套上纸袋，9:00左右取父本HT54的穗子，穗柄插在装有自来水的瓶中，以黑布罩住，待一个小时后，父本上的大部分小花均盛开，把花粉抖落在已进行高温杀雄并且开颖良好的母穗柱头上，重复2-3次授粉。授粉后立即给母穗套上牛皮纸袋，袋口用回形针夹住，但不要夹住穗梗，挂上牌子，记上名称及杂交日期，待8天左右可以取下纸袋，成熟时收获Fl种子。
[0036]2008年冬在海南种植杂种Fl，待植株长大后取叶片提取DNA，利用两亲本具有多态性的SSR标记3-4对检验植株是否为真杂种，并在植株抽穗后套袋自交收获F2种子用于后续抗高温鉴定，通过高温处理后的抗、感比进行抗高温基因的遗传分析并对抗高温基因定位。
[0037]3)高温处理程序
按照前述秧苗培 养方法和标准化的高温处理程序对亲本、Fl和F2进行高温处理。具体步骤是:a.育苗盆准备，即向每盆育苗盆(大小为43CmX33CmX10Cm)中加入等量的、且已经过筛、并经充分混匀的稻田土 ；b.播种，即把催芽的种子点播在盆中，11行/盆，18粒/行，同时，播种亲本各I行/盘作对照，周围设置2行保护行。肥水管理同一般盆栽水稻管理；C.取样，待秧苗长至三叶期时，每株取第2片叶约2-3cm置于-80°C冰箱，用于鉴定后对敏感单株提取DNA。D.待秧苗恢复生长2天后，即第3片叶即将完全长出的前一天，移入人工气候箱进行高温处理。人工气候箱设置具体如下:33°C Ih (光照Light，简写为L，下同)—360C Ih (L) — 390C Ih (L) — 42°C Ih (L) — 45°C Ih (L) — 48°C 7h (L)—48°C 12h (黑暗 Dark，简写为 D，下同)一48°C 12h (L) — 48°C 12h (D) — 48°C 12h (L)—48°C 12h (D) — 48°C 12h (L)0 湿度 75%。
[0038](4).PCR反应程序及检测
SSR分析主要参照Wu等(1993)的方法修订而成，PCR为25 μL体系:2.5 μ L IOX缓冲液(Mg2+) ；0.5μ1 IOMm dNTP ；1.ΟμL 5μΜ 5' _引物；1.0 μ? 5μΜ 3' _引物；0.5 μ? Taq聚合酶；1.0 μ? DNA; 18.5 μ? ddH20。dNTP订购于上海生工，Taq聚合酶订购于鼎国。PCR扩增程序为:94°C先预变性5 min，然后开始35个循环(94°C变性45s，选择引物适合的温度50-60°C退火45s，72°C延伸45s)，接着72°C继续延伸10 min。扩增产物用3%的琼脂糖凝胶电泳(AGE)或4%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测。
[0039](5).抗高温基因的初步定位选用F2代分离群体构建作图群体，基因定位采用隐性极端群体法，所用分子标记为微卫星DNA多态性分子标记(SSLP)。其具体程序是，首先对F2分离群体进行高温处理，筛选出感高温的单株用作基因定位的作图群体。然后，从F2分离群体中，随机挑选抗、感高温类型单株各10株，将叶片等量混合后研磨抽提DNA，用于构建感、抗高温的DNA池。之后，利用亲本间具有多态性的SSLP标记(Chen et al., 1997; Temnykh et al.，2000)，对两个DNA池首先进行标记分析，筛选出在两个DNA池中具有多态性的标记，籍此，初步确定基因所在的连锁群。在此基础上，再用在DNA池中获得的多态性标记对上述F2分离世代中隐性极端个体构建的作图群体逐一进行基因型测定，所获得的数据用于目标基因的初步定位。
[0040](6).抗高温基因的精细定位
在初步定位的基础上，进一步对定位区段进行标记加密分析，使其定位区段的长度至少，所用的SSLP标记或从禾本科基因组数据库中(http://www.gramene.0rg)获得,亦或是自己根据基因组序列设计合成，直到这类标记在目的基因涉及的连锁群上被用完为止。然后，利用生物学信息对标记区间(一般至少要小于或等于0.5Mb)内的编码序列进行生物学功能预测和分子特征化(包括基序、功能域、保守序列和调控序列等)分析，以便确定出候选基因。之后，针对候选基因设计特异引物，并通过TA克隆对候选基因进行克隆与测序，根据是否存在差异预测出目的基因。
[0041](7).遗传距离的计算
将电泳图片结果进行数值统计转换:与HT54带型一致的记为A，与HT13带型一致的记为B，同时具有两亲本带型的记为H，没有带的记为_。
[0042]连锁遗传分析采用MAPMAKER3.0软件(Lander et al, 1987)进行分析，计算遗传距离(CM)，并进行遗传作图Mapdraw2.1(刘仁虎和孟金陵，2003)，对抗高温基因进行定位分析。
·[0043]为精确定位所述基因，发明还开发了一种新的定位标记，所述标记的制备示例请参见下文中的实施例2。
[0044]遗传分析与基因定位结果
I)亲本多态性筛选和分子图谱建立
总共使用了 2304个SSLP分子标记对亲本进行了多态性筛选，从中筛选出322个在亲本间具有多态性的SSLP标记分子，其在染色体上的分布按照物理距离度量如图6，除第9染色体和着丝点附近外，获得的多态性SSLP标记较均匀覆盖了各个染色体。
[0045]水稻抗高温基因定位建立的微卫星分子标记(SSLP)连锁遗传图如图2所示。标记间的图距为物理距离。
[0046]2)遗传分析证实HT54在苗期的抗高温特性是受主效显性单基因控制
利用标准化的高温处理程序于两叶一心期对亲本、杂种Fl和F2进行高温处理。结果表明:高温处理后的Fl植株完全存活，F2群体则呈现明显的抗、感分离，其中，抗高温植株442株，感高温植株152株，抗、感分离符合3:1的分离比率(见表1)，卡平方测验，P>0.05，表明差异未达显著水平。该结果因此说明HT54在苗期的抗高温特性是受主效显性单基因控制，该基因现被命名为 OsHTAS {Oryza sativa Heat Tolerance at Seedling stage)。
[0047]表1 HT54抗高温特性的遗传分析结果
【权利要求】
1.一种多肽,其为选自下述任一: A)包含如SEQID N0.3所示的氨基酸序列的多肽； B)包含在如SEQID N0.3所示的氨基酸序列中或经缺失、替换、插入一个或多个氨基酸所得的氨基酸序列，所述多肽具有抗高温功能； C)具有SEQID N0.3所示的氨基酸序列的多肽； D)氨基酸序列如SEQID N0:3所示的多肽。
2.一种基因该基因的多核苷酸序列为选自以下任一的多核苷酸序列: A)包含如SEQID N0.1所不的核苷酸序列的多核苷酸； B)包含对应于如SEQID N0.1所示的核苷酸序列中的第-1395到-1406位核苷酸为GGGGGGGGGGGG保持不变，在除此之外的核苷酸序列中经缺失、替换、插入一个或多个核苷酸所得的多核苷酸序列，其所编码的多肽具有抗高温功能； C)具有SEQID N0.1所示的核苷酸序列的多核苷酸； D)核苷酸序列如SEQID NO:1所示的多核苷酸； E)编码如权利要求1所述任一种的多肽的多核苷酸序列。
3.包含权利要求所述2的基因的载体。
4.一种宿主细胞，其特征在于所述的细胞包含权利要求1所述的多肽，或者权利要求2所述的基因，或者权利要求3所述的载体，所述宿主细胞优选真核生物细胞，更优选植物细胞和酵母细胞,所述植物细胞优 选禾本科植物细胞,特别优选水稻sativa L.)细胞。
5.用于筛选、定位、分离新核苷酸序列的分子标记，所述标记选自: A)插入/缺失标记InDel5，该标记位于水稻第九染色体距短臂端9130_9150kb之间，所述标记的扩增产物具有长度多态性； B)SNP标记，简称RBspl407，在感高温水稻和抗高温水稻植株中，基于SEQ ID NO:1所述多核苷酸序列，所述标记对应序列分别为TGT-3060ACA和TGG-3060ACA; C)微卫星DNA标记RM7364，该标记位于水稻第九染色体距短臂端9440_9450kb之间，所述标记经引物的扩增产物具有长度多态性。
6.权利要求5所述的标记在筛选、定位、分离抗/感高温基因中的应用，其中所述的高温优选42°C或以上，45°C或以上，48°C或以上，或50°C或以上。
7.植物育种方法，所述方法包含应用2所述的基因，或应用权利要求1所述的多肽，或权利要求3所述的载体，或权利要求4所述的宿主细胞，或权利要求5或6所述的标记。
8.使温度敏感型水稻恢复为非温度敏感型水稻的方法，该方法包括通过遗传操作使温度敏感型水稻基因组第9号染色体中相应于SEQ ID NO:1第-3060位的核苷酸突变为G。
9.诱导水稻抗高温表型的方法，该方法包括通过遗传操作使不具备抗高温表型的水稻基因组第9号染色体中相应于SEQ ID NO:1第-1394位的5'端插入G，其中，所述的高温优选42°C或以上，45°C或以上，48°C或以上，或50°C或以上。
10.使温度敏感型水稻为抗高温型水稻的方法，该方法包括通过遗传操作使温度敏感型水稻基因组第9号染色体中相应于SEQ ID NO:1第-3060位的核苷酸突变为G，并且使其温度敏感型水稻基因组第9号染色体中第-1394位的5'端上游插入一个G，使所得核苷酸序列与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中的第-1395到-1406位核苷酸相同，即自-1395位起远离起始密码子方向序列包含连续的12个G，其中，所述的高温优选42°C或以上，45°C或以上，48°C或以上,或5 0°C或以 上。
【文档编号】C12N15/29GK103848906SQ201210515449
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2012年12月5日
【发明者】凃巨民, 钟旭华, 刘建平, 张晓波, 黄农荣, 张集文 申请人:浙江大学, 广东省农业科学院水稻研究所