专利名称：一种银杏酚酸的生物降解方法
技术领域：
本发明旨在建立一种漆酶生物降解银杏酚酸的方法，涉及到酶工程及食品领域。
背景技术：
银杏叶提取物(EGB)的主要成分为黄酮和内酯类化合物，具有抗氧化、抗血小板激活因子(PAF)作用和拮抗PAF特异性受体作用。大量的药理分析和临床实验证实，银杏叶提取物对冠心病、高血压、心绞痛、动脉硬化、脑功能减退、老年性痴呆、老年性记忆减退、衰老等与心脑血管循环有关的疾病都有显著的预防和治疗效果。银杏叶提取物广泛用于医药、保健品、食品与化妆品中，德、法等国每年从东亚几个国家(主要是韩国、中国)大量进口银杏叶，作为制药原料，成品销售全世界。但银杏酚酸存在于银杏外种皮、银杏叶和银杏果中，在外种皮中含量最高。其结构可看作是水杨酸分子在苯环C6位上有较长侧链的系列化合物，该长链分烷基和烯基两大类，一般由13-17个碳原子组成，属细胞毒素，可能与诱导机体突变和致癌有关，能引起皮肤、粘膜等处的过敏性炎症反应。因此，银杏酚酸(Ginkgolic acids)是银杏叶提取物中关键的限量指标。但在提取银杏叶黄酮和内酯类化合物等活性物质过程中，银杏酚酸也会同时被浸提出来。其含量随提取工艺、纯化工艺不同而不同。但国内绝大部分银杏叶提取物中银杏酚酸严重超标，严重危害着人们的健康。目前，国际上对银杏叶提取物中银杏酚酸含量的严格控制，促进了人们对选择性脱除银杏酚酸类物质的研究力度。目前，所报导的方法主要是改进提取工艺、强化提纯环节。无疑降低了活性物质的得率，增加了制备成本。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，该酶在白腐菌中普遍存在，少数低等真菌和植物中也产生，多为分泌型糖蛋白。由于漆酶是一种氧化还原酶，其作用主要是催化氧化还原反应，能够催化很多酚型化合物的氧化反应，但由于其氧化还原电势较低，对非酚类结构化合物却不能够直接氧化降解，或对许多酚型化合物降解效率不高。若在某些小分子氧化还原介质帮助下，漆酶作用的底物范围可进一步扩大，能够氧化非酚型的有机化合物，也能够显著地提高酚型化合物的降解效率。漆酶氧化还原介质系统(LMS)是指漆酶在介体和氧的存在下进行生物催化的过程。介体在酶的作用下会形成活性高且有一定稳定性的中间体，这些活性中间体能从氧分子中获得电子传递给底物，从而使底物降解。漆酶/氧化还原介质系统作为一种具有很大潜在应用价值的体系越来越受到国内外的关注。鉴于国内绝大部分银杏叶提取物中银杏酚酸严重超标，严重危害着人们的健康。目前，所报导的方法主要是改进提取工艺、强化提纯环节。不仅降低了活性物质的得率，增加了制备成本，而且效果不够明显，难以达到国际上对银杏叶提取物中银杏酚酸含量的限量标准。且到目前为止，利用漆酶或漆酶介质系统对银杏酚酸进行生物降解在国内外还未见研究报道。
发明内容
解决的技术问题
本发明的目的是建立一种生物降解银杏酚酸的方法，旨在将一些银杏制品在经过漆酶降解后有效地除去银杏酚酸。技术方案一种银杏酚酸的生物降解方法，利用漆酶LacC，降解体系中漆酶LacC的浓度为
0.004U/mL-0. 006U/mL,降解体系的pH4. 0-6. 0，降解温度为45°C 60°C，降解处理时间为10 24小时。降解体系中添加有终浓度0.1 ImM的2，2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)U-羟基苯并三唑(HOBT)、紫脲酸(VA)或愈创木酚。所述漆酶LacC由下述方法制得培养栓菌(Trametes versicolor),培养基为麸皮20g/L,葡萄糖5g/L,酒石酸铵120mmol/L, 200mmol/L pH 5. 0朽1檬酸缓冲液，Immol/L愈创木酚，0.1mL Tween 80，0. 3mmol/L Cu2+，培养条件为28°C培养5d ;将IL培养好发酵液置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心IOmin收集上清液即为漆酶粗酶液；然后在上清液中加入终浓度为80%wt 的硫酸铵，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心30min,沉淀用20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer溶解透析；透析处理过的酶液进行 DEAES印harose CL-6B 离子交换柱层析，采用平衡液20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer,洗脱缓冲液20mM pH 7. OTris-HCl buffer，NaCl的浓度梯度为0-0. 6mol/L，洗脱体积为800mL，洗脱速度1. 5mL/min，每4mL收集一管检测漆酶活性，通过蛋白检测仪检测到三个蛋白峰，最后一个峰所收集的为漆酶LacC。所述漆酶LacC也可以由下述方法制得(I)栓菌(Trametes versicolor)的培养培养基为PDA :葡萄糖20g/L,马铃薯汁20%wt,接种新鲜的栓菌菌丝，28°C下180rpm培养3_4天过滤收集菌丝体；(2)栓菌总RNA的提取取收集的栓菌的菌丝体用PBS缓冲溶液清洗后，在液氮下研磨菌丝体至粉末状，收集到2mL离心管中,加入ImL Trizol后剧烈震荡，4°C下12000g离心IOmin后转移上清液至2mL离心管，加入200 ii L氯仿震荡15s混匀后30°C下孵育2-3min，4°C下12000g离心IOmin取上层清夜，加入上清液0. 8倍体积的异丙醇混匀后4°C下12000g离心lOmin，去净上清后用75%wt乙醇水溶液清洗2次后4°C下7500g离心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入DEPC水溶解RNA沉淀，作为模板RNA，-20°C下保存；(3)栓菌cDNA的合成以栓菌总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液50 u M Oligo dTIuL,IOmM dNTP Mixture IuL,总RNAlug,DEPC-H2O7uL；混勻后6515C下保温5min后冰上放置Imin ；在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液上述RNA/Primer 混合液10 u L,5 X PrimeScript Buffer4 u L,40U/ u L RNase Inhibiter0. 5 u L,200U/ u L PrimeScript RTase IuLRNase free H2O4. 5 U L;
上述反应液混匀后在50°C下保温lh，70°C下保温15min后冰上冷却，得到的反应液立即用于cDNA第二链的合成；(4)栓菌基因的克隆设计LacC引物，载体为pPICZaB :P9:GGGGAATTCATGGGCAAGTTTCACTCTTTTGTGAA ；P10:GGGTCTAGATCAGAGGTCGGACGAGTCCAAA ；基因LacC的克隆利用引物P9和P10，反应条件为94 °C，5min ;暂停计时，加ExTaq 聚合酶，加 40iiL 石蜡油密封；30 次循环(94°C，30s ；58°C,30s ；72°C,90s) ；72°C,IOmin ;反应停止，4°C保温；得到基因LacC，用EcoR I，Xba I酶切，同时表达载体也用相同的酶分别酶切，基因LacC和酶切后的载体分别连接过夜，转化大肠杆菌，得到重组质粒pPICZa B-LacC；(5)重组漆酶LacC的制备将重组质粒pPICZ a B-LacC线性化后，电转化毕赤酵母得到重组菌，将重组酵母菌划线于YPD平板上进行活化，28°C培养2天，至长出单菌落后接种于IOmL BMGY液体培养基中，于30°C，200r/min摇床培养48h，OD600达2 6，3000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用无菌纯净水洗涤菌体f 2次；将菌体用BMMY诱导培养基稀释至0D_=1,用4层纱布代替棉花塞,于28°C, 180r/min摇床培养,每天补加甲醇至终浓度为0. 6%(V/V);将培养好的培养基置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心IOmin收集上清液即为漆酶粗酶液；首先超滤装置对漆酶粗酶液浓缩；然后在浓缩液中加入终浓度为80%wt的硫酸铵，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心30min，沉淀用20mM pH 7. OTris-HCl buffer溶解透析；透析处理过的酶液进行DEAE Sepharose CL-6B离子交换柱层析，采用平衡液20mM pH 7. OTris-HCl buffer，洗脱缓冲液含0. 4、
0.6、1. OM 的 20mM pH 7. OTris-HCl buffer，洗脱速度0. 5mL/min，每 6min 收集一管，检测漆酶活性，得到重组漆酶LacC。所述降解温度为50°C。所述2，2’ -联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐的浓度为0. 6mM。降解反应时间为12h。漆酶LacC在降解银杏酚酸中的应用。具体方案内容为本发明所建立的一种降解银杏酚酸的方法是用漆酶对其进行生物降解，为了提高降解效率，加入介体，构成漆酶-介体系统，可以高效的降解银杏酚酸。本发明所采用的降解体系为银杏酚酸+IOOmM的pH4. 5柠檬酸缓冲液+漆酶+介体，共5mL。反应温度50°C，水浴摇床转速lOOrmp，反应时间12小时。降解后的反应体系用IOmL的正己烧萃取,共萃取三次,每次吸取上清ImL于小试管中，合并三次萃取液(3mL)用N2吹干，加入ImL的色谱甲醇，过0. 45 ii m有机滤膜后做HPLC。HPLC的条件为Agilent1260，Eclipse XDB-C18 色谱柱(4. 6 X 250mm，5 y m)，流动相为 V (甲醇)V (3% 冰醋酸)=92:8，柱温为40°C，检测波长为310nm，流速为1. 5mL/min，进样量20 y L，运行时间lOmin。本发明所采用的漆酶酶活的测定方法为用紫外分光光度计测量，检测波长为420nm，缓冲液为IOOmM的pH4. 5的柠檬酸缓冲液，反应体系为1980 y L缓冲液+lmLlmMABTS+20 u L漆酶，缓冲液和ABTS加入后先在50°C水浴锅中预热5min，加酶液后计时3min (包括加酶后在水浴锅中振荡30s)，每分钟记下A值，计算公式为漆酶酶活(U/L) = It(A3-A1)/2] X5000/12} X 稀释倍数。
有益效果单纯的用漆酶对银杏酚酸进行降解，其降解效率不到30%，加入介体物质后，特别是加入ABTS后，其降解效率最高可达100%。
图1为不同重组漆酶同工酶降解银杏酚酸的结果；图2为加入不同的小分子介体对漆酶LacC降解银杏酚酸的影响；图3为不同的ABTS浓度对漆酶LacC降解银杏酚酸的影响；图4为不同的酶用量对漆酶LacC降解银杏酚酸的影响；图5为不同pH值对漆酶LacC降解银杏酚酸的影响；图6为温度对漆酶LacC降解银杏酚酸的影响。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明，所列实施例仅在于说明本发明而不限制本发明。实施例1漆酶的制备1.1 杂色云芝(Coriolus versicolor)重组漆酶 Lccl 和 Lcc2 的制备1.1.1 杂色云芝(Cori olus versicolor)的培养杂色云芝(Coriolus versicolor,该微生物可以从自然界中筛选获得，也可以从商业途径购买得到(例如可以购自中国工业微生物菌种保藏管理中心))的培养基为PDA :葡萄糖20g/L,马铃薯汁20%wt,接种新鲜的杂色云芝菌丝,28°C下180rpm培养3_4天过滤收集菌丝体。1.1. 2 杂色云芝(Coriolus versicolor)总 RNA 的提取取收集的杂色云芝(Coriolus versicolor)的菌丝体用PBS缓冲溶液清洗一次后，在液氮下研磨菌丝体至粉末状，收集到2mL离心管中，加入ImL Trizol后剧烈震荡，4°C下12000g离心IOmin后转移上清液至2mL离心管，加入200 u L氯仿震荡15s混匀后30°C下孵育2-3min,4°C下12000g离心IOmin取上层清夜,加入上清液0. 8倍体积的异丙醇混勻后4°C下12000g离心lOmin，去净上清后用75%wt乙醇水溶液(DEPC处理过的，去除了 mRNA酶)清洗2次后4°C下7500g离心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入DEPC水溶解RNA沉淀，作为模板RNA，-20°C下保存。1.1. 3 杂色云芝(Coriolus versicolor) cDNA 的合成以杂色云芝(Coriolus versicolor)总RNA为模板,利用逆转录合成cDNA第一链(以下各逆转录所用试剂均来自于试剂盒“PrimeScriptTMlstStrand cDNA SynthesisKit”,购自 Takara 公司)。在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液50 U M Oligo dTIuL,IOmM dNTP Mixture IuL,总RNAI u g,DEPC-H2O7u L ；混勻后65°C下保温5min后冰上放置Imin
在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液上述RNA/Primer 混合液10 ii L，5XPrimeScript Buffer4 U L,40U/u L RNase Inhibiter0. 5 U L,200U/ u L PrimeScript RTase IuLRNase free H2O4. 5 U L;上述反应液混勻后在50°C下保温lh,70°C下保温15min后冰上冷却,得到的反应液立即用于cDNA第二链的合成。1.1. 4 杂色云芝(Coriolus versicolor)基因的克隆根据NCBI公布的杂色云芝(Coriolus versicolor)漆酶基因序列(Lccl:HMl37002 和 Lcc2:D84235)分别设 计引物Pl :GCGGAATTCGCTATCGGGCCTGTGACC,下划线表示 EcoR I 位点；P2 GGGTCTAGATTAGAGGTCGGATGAGTC,下划线表示 Xba I 位点；P3 CCCATCGATAGCCATTGGGCCCGTC,下划线表示 Cla I 位点；P4 CCCTCTAGATCAGAGGTCGGACGAG,下划线表示 Xba I 位点。基因Lccl的克隆利用引物Pl和P2，基因Lcc2的克隆利用引物P3和P4。反应条件为94°C，5min ;暂停计时，加Ex Taq聚合酶，加40 y L石蜡油密封；35次循环(94°C，50s ；55°C,90s ；72°C,80s) ；72°C, IOmin ;反应停止，4°C保温。得到基因 Lccl 和 Lcc2，分别用EcoR I，XbaI和Cla I和Xba I酶切，同时表达载体pPICZ a A也用相同的酶分别酶切，基因Lccl，Lcc2和酶切后的载体pPICZ a A分别连接过夜，转化大肠杆菌，得到重组质粒pPICZa A-Lccl 和 pPICZaA_Lcc2。1.1.5重组漆酶的制备将重组质粒pPICZ a A-Lccl线性化后，电转化毕赤酵母得到重组菌，将重组酵母菌划线于YPD平板上进行活化，28°C培养2天，至长出单菌落后接种于IOmL BMGY液体培养基中，于30°C，200r/min摇床培养48h，OD600达2 6，3000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用无菌纯净水洗涤菌体f 2次。将菌体用BMMY诱导培养基稀释至0D_=1，用4层纱布代替棉花塞，于28°C，180r/min摇床培养，每天补加甲醇至终浓度为0. 6%(V/V)。将培养好(培养至第13天为最佳)的培养基置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心IOmin收集上清液即为漆酶粗酶液。首先超滤装置对漆酶粗酶液浓缩；然后在浓缩液中加入终浓度为80%wt的硫酸铵，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心30min,沉淀用20mM Tris-HCl buffer (pH 7. 0)溶解透析；透析处理过的酶液进行DEAE Sepharose CL-6B 离子交换柱层析,米用平衡液20mM Tris-HCl buffer (pH 7. 0),洗脱缓冲液含 0. 4,0. 6、1. OM 的 20mM Tris-HCl buffer (pH 7. 0)，洗脱速度:0. 5mL/min,每6min收集一管，检测漆酶活性，得到重组漆酶Lccl。用上述同样的方法，得到重组漆酶Lcc2。1. 2用原始菌栓菌(Trametes versicolor)直接培养发酵制备漆酶LacA和LacB和 LacC培养栓菌(Trametes versicolor),培养基为麸皮20g/L,葡萄糖5g/L,酒石酸铵 120mmol/L,朽1 樣酸缓冲液(200mmol/L, pH 5. 0), lmmol/L 愈创木酌 ，0.1mL Tween 80,0.3mmol/L Cu2+，培养条件为28°C培养5d。将培养好发酵液(IL)置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心IOmin收集上清液即为漆酶粗酶液。然后在上清液中加入终浓度为80%wt的硫酸铵，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心30min，沉淀用20mMTris_HCl buffer (pH 7. 5)溶解透析；透析处理过的酶液进行DEAE Sepharose CL-6B离子交换柱层析，采用平衡液20mM Tris-HCl buffer (pH 7. 5)，洗脱缓冲液20mMTris-HCl buffer (pH 7. 0)，NaCl 的浓度梯度为 0_0. 6mol/L，洗脱体积为 800mL，洗脱速度1. 5mL/min，每4mL收集一管检测漆酶活性，通过蛋白检测仪检测到三个蛋白峰图，分别收集三种漆酶，并命名为漆酶LacA和LacB和LacC。1. 3 检菌 Trametes versicolor 重组漆酶 LacA、LacB 和 LacC 的制备1. 3.1 栓菌 Trametes versicolor 的培养栓菌Trametes versicolor该微生物可以从自然界中筛选、诱变获得,也可以从商业途径购买得到(例如可以购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)，培养方法同1.1.1。1. 3. 2 栓菌 Trametes versicolor 总 RNA 的提取方法同1.1. 2。ld3. 3 栓菌 Trametes versicolor cDNA 的合成方法同1.1. 3。1. 3. 4 栓菌 Trametes versicolor 基因的克隆根据NCBI 公布的检菌Trametes versicolor 漆酶基因序列(LccA:AB212732; LccB:AB212722;LccC:AB212734)分别设计引物LacA 引物(载体 pPICZ a B)P5:GGGGAATTCATGGGTCTGCAGCGATT ； 下划线表示 EcoR I 位点P6:GGGTCTAGATCACTGGTTAGCCTCGCTCA ；下划线表示 Xba I 位点LacB 引物(载体 pPICZ a C)P7:GGGGAATTCATGGGCAGGGTCTCATCTCTCTG ；P8:GGGTCTAGATTAGAGGTCGGATGAGTCAAGAGCG ；LacC 引物(载体 pPICZ a B)P9:GGGGAATTCATGGGCAAGTTTCACTCTTTTGTGAA ；P10:GGGTCTAGATCAGAGGTCGGACGAGTCCAAA ；反应条件为94°C，5min ;暂停计时，加Ex Taq聚合酶，加40 y L石蜡油密封；30次循环(94°C，30s ;58°C，30s ;72°C，90s) ；72°C, IOmin ;反应停止，4°C保温。得到基因 LacA、LacB和LacC，均用EcoR I，Xba I酶切，同时表达载体也用相同的酶分别酶切，基因LacA、LacB和LacC和酶切后的载体分别连接过夜，转化大肠杆菌，得到重组质粒pPICZ a B-LacA,pPICZa C-LacB 和 pPICZa B-LacC01. 3. 5重组漆酶LacA、LacB和LacC的制备方法同1.1. 5，得到重组漆酶LacA、LacB和LacC的纯酶。实施例2不同重组漆酶同工酶降解银杏酚酸的结果以0. 02%wt银杏酚酸作为底物，在含有该底物的反应体系中分别加入五种漆酶至0. 5U/mL ;用柠檬酸缓冲液调节pH至4. 5，控制温度在50°C;在水浴摇床中以IOOrpm的转速下反应12h后检测银杏酚酸的残留量。
银杏酚酸的检测方法如下首先对5mL的反应体系，加入2倍体积的正己烷进行液-液萃取，每个样品萃取三次，以保证反应体系中的银杏酚酸完全萃取，静置30min待溶液完全分层后分别取上层正己烷溶液lmL，氮吹仪吹干后用ImL甲醇溶解处理样品。对上述反应体系中的银杏酹酸残留量用HPLC进行分析检测。液相色谱仪为Agilent 1260,Eclipse XDB-C18 色谱柱(4. 6X250mm，5iim)，流动相为 V (甲醇)V (3% 冰醋酸))=92:8，流速为1. 5mL/min，进样量20 y L，运行时间lOmin。本发明银杏酚酸降解率的计算公式为降解率(%) = [(初始浓度一残留浓度)/初始浓度]X 100%。具体结果如图1所示,在反应进行了 12h后五种漆酶LacA、LacB, LacC、Lccl及Lcc2对银杏酚酸的降解率分别为15. 5%、8. 7%,27. 0%、11. 7%、4. 1%。表明单独用这五种漆酶对银杏酚酸进行降解，降解效果相对较好的为漆酶LacC。实施例3研究加入不同的小分子介体对漆酶LacC降解银杏酚酸的影响以0. 02%wt银杏酚酸作为底物，在含有该底物的反应体系中加入漆酶LacC至
0.5U/mL,分别加入小分子介体物质ABTS、愈创木酚、HOBT及VA至ImM ;用柠檬酸缓冲液调节pH至4. 5，控制温度在50°C;在水浴摇床中以IOOrpm的转速下反应12h后检测银杏酚酸的残留量。具体结果如图2所示，在反应进行了 12h后加入ABTS、愈创木酚、HOBT及VA的漆酶对银杏酚酸的降解率分别为100%、86. 6%,54. 4%,57. 7%。表明加入小分子介体物质后银杏酚酸的降解效果显著提高，加入ABTS的降解效果最好，达到100%，其次是愈创木酚，HOBT和VA的相对低些。实施例4研究不同的酶用量对漆酶LacC降解银杏酚酸的影响以0. 02%wt银杏酚酸作为底物，采用pH 4. 5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，添加ABTS 至浓度为 0. 2mM,分别添加漆酶 LacC 至浓度为 0. 002U/mL、0. 004U/mL、0. 006U/mL、
0.008U/mL、0. 01U/mL、0. 025U/mL、0. 05U/mL、0. 075U/mL、0. lU/mL、0. 125U/mL,控制温度在50°C，在水浴摇床中以IOOrpm的转速下反应12h后检测银杏酚酸的残留量。具体试验结果如图3所示可得上述浓度的酶量对应的降解率分别为49. 4%,58. 1%、63. 4%,63. 5%,64. 5%、64. 0%、61. 3%,59. 2%,59. 9%,57. 7%。酶用量在 0. 004U/mL_0. 006U/mL 比较适宜。实施例5研究pH值对漆酶LacC降解银杏酚酸的影响以0. 02%wt银杏酚酸作为底物，添加ABTS至浓度为0. 2mM,添加漆酶至浓度为
0.01U/mL,用柠檬酸缓冲液调节反应体系的pH分别至3. 0,4. 0,4. 5,5. 0,5. 5,6. 0，控制温度在50°C，在水浴摇床中以IOOrpm的转速下反应12h后检测银杏酚酸的残留量。具体试验结果如图4所示反应在pH4. 0-6. 0都有很好的降解效果。实施例6研究温度对漆酶LacC降解银杏酚酸的影响以0. 02%wt银杏酚酸作为底物，采用pH 4. 5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，添加ABTS至浓度为0. 2mM,添加漆酶至浓度为0. 01U/mL,控制温度分别为30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C，在水浴摇床中以IOOrpm的转速下反应12h后检测银杏酚酸的浓度。具体试验结果如图5所示漆酶在45°C 60°C的条件下对银杏酚酸都有较好的降解效果，其中在50°C条件下银杏酚酸的降解效率最好。实施例7研究不同的ABTS浓度对漆酶LacC降解银杏酚酸的影响以0. 02%wt银杏酚酸作为底物，采用pH 4. 5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，添加漆酶LacC至浓度为0. 5U/mL，分别添加ABTS至浓度为0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6mM，控制温度在50°C，在水浴摇床中以IOOrpm的转速下反应12h后检测银杏酚酸的残留量。具体试验结果如图6所示ABTS的浓度为0.1 0. 6mM时银杏酚酸的降解率分别为55. 3%,58. 7%、73. 2%,88. 1%、96. 8%,99. 7%，可见随着介体ABTS浓度的增加，银杏酚酸降解率随之增加，
0.6mM时就有近乎降解完全。
权利要求
1.一种银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于利用漆酶LacC，降解体系中漆酶LacC的浓度为O. 004U/mL-0. 006U/mL,降解体系的pH4. 0-6. O,降解温度为45°C 60°C，降解处理时间为10 24小时。
2.根据权利要求1所述的银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于降解体系中添加有终浓度O.1 ImM的2，2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑_6_磺酸)二铵盐(ABTS)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、紫脲酸(VA)或愈创木酚。
3.根据权利要求1所述的银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述漆酶LacC由下述方法制得培养栓菌(Trametes versicolor),培养基为麸皮20g/L,葡萄糖5g/L,酒石酸铵 120mmol/L, 200mmol/L pH 5. O 朽1 樣酸缓冲液，lmmol/L 愈创木酌·, O.1mL Tween.80,0. 3mmol/LCu2+，培养条件为28°C培养5d ;将IL培养好发酵液置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心IOmin收集上清液即为漆酶粗酶液；然后在上清液中加入终浓度为.80%wt的硫酸铵，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心30min，沉淀用20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer溶解透析；透析处理过的酶液进行DEAE Sepharose CL-6B离子交换柱层析，采用平衡液20mM pH 7. 5Tris_HCl buffer，洗脱缓冲液20mMpH 7. OTris-HCl buffer, NaCl的浓度梯度为0-0. 6mol/L，洗脱体积为800mL，洗脱速度.1.5mL/min，每4mL收集一管检测漆酶活性，通过蛋白检测仪检测到三个蛋白峰，最后一个峰所收集的为漆酶LacC。
4.根据权利要求1所述的银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述漆酶LacC也可以由下述方法制得 (1)栓菌(Trametesversicolor)的培养培养基为PDA :葡萄糖20g/L,马铃薯汁.20%wt,接种新鲜的栓菌菌丝，28°C下180rpm培养3_4天过滤收集菌丝体； (2)栓菌总RNA的提取取收集的栓菌的菌丝体用PBS缓冲溶液清洗后，在液氮下研磨菌丝体至粉末状，收集到2mL离心管中，加入ImL Trizol后剧烈震荡，4°C下12000g离心IOmin后转移上清液至2mL离心管，加入200 μ L氯仿震荡15s混匀后30°C下孵育2_3min，.4°C下12000g离心IOmin取上层清夜，加入上清液0. 8倍体积的异丙醇混匀后4°C下12000g离心lOmin，去净上清后用75%wt乙醇水溶液清洗2次后4°C下7500g离心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入DEPC水溶解RNA沉淀，作为模板RNA，-20°C下保存； (3)栓菌cDNA的合成以栓菌总RNA为模板，利用逆转录合成cDNA第一链 在微量离心管中配制下列模板RNA/Primer反应液 .50 μ M Oligo dTI μ L, IOmM dNTP Mixture I μ L, 总 RNAI μ g， DEPC-H2O7 μ L ; 混勻后65°C下保温5min后冰上放置Imin ； 在上述微量离心管中配制下列cDNA合成反应液 上述RNA/Primer混合液IOuL, .5XPrimeScript Buffer4 μ L, .40U/μ L RNase Inhibiter0. 5 μ L, .200U/ μ L PrimeScript RTase IuLRNase free H2O4. 5 μ L; 上述反应液混匀后在50°C下保温lh，70°C下保温15min后冰上冷却，得到的反应液立即用于cDNA第二链的合成； (4)栓菌基因的克隆设计LacC引物，载体为pPICZaB:P9:GGGGAATTCATGGGCAAGTTTCACTCTTTTGTGAA ；PlO:GGGTCTAGATCAGAGGTCGGACGAGTCCAAA ； 基因LacC的克隆利用引物P9和P10，反应条件为94°C，5min ;暂停计时，加Ex Taq聚合酶，加 40 μ L 石蜡油密封;30 次循环(94°C，30s ；58°C,30s ；72°C,90s)；72°C, IOmin ;反应停止，4°C保温；得到基因LacC，用EcoR I，XbaI酶切，同时表达载体也用相同的酶分别酶切，基因LacC和酶切后的载体分别连接过夜，转化大肠杆菌，得到重组质粒pPICZ a B-LacC ； (5)重组漆酶LacC的制备将重组质粒pPICZa B-LacC线性化后，电转化毕赤酵母得到重组菌，将重组酵母菌划线于YPD平板上进行活化，28°C培养2天，至长出单菌落后接种于IOmL BMGY液体培养基中，于30°C，200r/min摇床培养48h，OD600达2 6，3000rpm离心5min收集菌体，弃上清，用无菌纯净水洗涤菌体f 2次；将菌体用BMMY诱导培养基稀释至0D_=1,用4层纱布代替棉花塞,于28°C, 180r/min摇床培养,每天补加甲醇至终浓度为O. 6%(V/V);将培养好的培养基置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心IOmin收集上清液即为漆酶粗酶液；首先超滤装置对漆酶粗酶液浓缩；然后在浓缩液中加入终浓度为80%wt的硫酸铵，在4°C下放置24h后置于IOOOOrpm的冷冻离心机中4°C下离心30min，沉淀用20mM pH 7. OTris-HCl buffer溶解透析；透析处理过的酶液进行DEAE Sepharose CL-6B离子交换柱层析，采用平衡液20mM pH 7. OTris-HCl buffer，洗脱缓冲液含O. 4、O. 6、1. OM 的 20mM pH 7. OTris-HCl buffer，洗脱速度0. 5mL/min，每 6min 收集一管，检测漆酶活性，得到重组漆酶LacC。
5.根据权利要求1所述的银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述降解温度为50。。。
6.根据权利要求1所述的银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述2，2’_联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐的浓度为O. 6mM。
7.根据权利要求1所述的银杏酚酸的生物降解方法，其特征在于所述降解反应时间为12h。
8.漆酶LacC在降解银杏酚酸中的应用。
全文摘要
一种银杏酚酸的生物降解方法，利用漆酶LacC，按比例，当降解体系中含有一定浓度的银杏酚酸，添加漆酶LacC的浓度为0.004U/mL-0.006U/mL，降解体系的pH4.0-6.0，降解温度为45℃～60℃，降解处理时间为10～24小时。单纯的用漆酶对银杏酚酸进行降解，其降解效率不到30%，加入介体物质后，特别是加入ABTS后，其降解效率最高可达100%。
文档编号A23L1/30GK103053876SQ201210552048
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者赵林果, 孙伟, 曹福亮, 姜艳, 汪贵斌, 郑璐 申请人:南京林业大学