专利名称：增加甲硫氨酸得率的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过在包含碳源和硫源的适宜培养基中培养微生物来生产甲硫氨酸及其衍生物的方法。该微生物和/或该培养基经修饰使得其甲硫氨酸/碳源得率增加。本发明还要求保护从发酵培养基中分离甲硫氨酸及其衍生物。
背景技术：
含硫化合物如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺苷甲硫氨酸对细胞代谢是关键的，并工业上生产用作食物或饲料添加剂以及药物。尤其甲硫氨酸是一种动物无法合成的必需氨基酸，在许多身体功能中起着重要作用。除了它在蛋白质生物合成中的作用，甲硫氨酸也涉及转甲基作用，以及硒与锌的生物利用。甲硫氨酸还直接用作对于病症如过敏与风湿热的治疗。然而，大部分生产出的甲硫氨酸添加于动物饲料。随着动物来源的蛋白质因BSE与禽流感(chicken flu)的缘故而减少使用，对纯甲硫氨酸的需求增加。D，L_甲硫氨酸通常自丙烯醛、甲硫醇以及氰化氢通过化学方法产生。然而，该外消旋混合物的性能并不像纯L-甲硫氨酸一样好，例如在鸡饲料添加剂中(Saunderson, C.L., (1985)British Journal of Nutrition54, 621-633)。纯 L-甲硫氨酸可自外消旋甲硫氨酸产生，例如通过酰基酶处理N-乙酰-D，L-甲硫氨酸来进行。这极大地提高了生产成本。对纯L-甲硫氨酸需求增加，连同对环境的考虑，使甲硫氨酸的微生物生产具有吸引力。微生物发展出高度复杂的`调控机制来调整细胞组分的生物合成，从而允许最大生长速率。结果，仅仅必需量的代谢物如氨基酸被合成，通常无法在野生型菌株的培养物上清中检测到。细菌主要通过酶的反馈抑制及基因转录的阻抑或激活来控制氨基酸生物合成。在大部分情况下，这些调控途径的效应物是相关途径的终产物。因此，在微生物中过量生产氨基酸的策略要求对这些控制机制解除调控。在许多微生物中L-甲硫氨酸合成途径众所周知(
图1)。甲硫氨酸衍生自氨基酸天冬氨酸，但是其合成需要另外两条途径的合流(convergence),即半胱氨酸生物合成与Cl代谢。天冬氨酸自草酰乙酸合成。在大肠杆菌(E.coli)中，稳定的草酰乙酸储备(pool)是柠檬酸循环的正常发挥功能所需的。因此将草酰乙酸转化为天冬氨酸需要对从该储备中移出草酰乙酸进行补偿的反应。数种称为添补反应(anaplerotic reaction)的途径,在大肠杆菌中实现了这些功能(Sauer&Eikmanns (2005) FEMS Microbiol Reviews29p76_94)。在指数生长条件及葡萄糖过剩的情况下，PEP羧化酶催化PEP的羧化产生草酰乙酸。羧化的效率取决于胞内PEP浓度及其他。PEP是参与多种反应的中心代谢物。这些反应之一，PEP糖酵解转化为丙酮酸对大肠杆菌不是必需的，因为葡萄糖通过PTS系统摄入可将产自葡萄糖的两个PEP分子之一转化为丙酮酸。在糖酵解中，酶丙酮酸激酶(其在大肠杆菌由基因PykA和pykF编码的两个同工酶编码)催化PEP转化为丙酮酸。天冬氨酸通过顺序的三个反应转化为高丝氨酸。高丝氨酸可随后进入苏氨酸/异亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途径。在大肠杆菌中，进入甲硫氨酸途径需要将高丝氨酸酰化为琥珀酰高丝氨酸。这个激活步骤允许随后与半胱氨酸缩合，生成含有硫醚的胱硫醚。胱硫醚水解生成高半胱氨酸。生成甲硫氨酸的最后甲基转移通过B12-依赖或B12-非依赖的甲基转移酶进行。在大肠杆菌中，甲硫氨酸生物合成通过阻抑和激活甲硫氨酸生物合成基因分别经由 MetJ和MetR 的蛋白来调控(在Figge RM(2006), Wendisch VF编，Microbiol Monogr (5)Amino acid biosynthesis pl64_185的综述)。已知MetJ连同其共阻抑物S-腺苷甲硫氨酸调控基因metA、metB、metC、metE和metF。MetR在其共激活子高半胱氨酸的存在下激活编码涉及甲硫氨酸生成的酶的其它基因，如glyA、metE、metH和metF,而metA仅在高半胱氨酸不存在时被MetR激活。所有这些酶参与Cl单元的产生及其从丝氨酸到甲硫氨酸的转移。编码丝氨酸羟甲基转移酶的GlyA催化丝氨酸到甘氨酸的转化，以及Cl单元在辅酶四氢叶酸(THF)上的伴随转移。甘氨酸可随即转化为C02、NH3，而另一个Cl单元转移到THF上。该反应受到由基因gcvTHP和Ipd编码的甘氨酸裂解复合物催化。由上述两个反应所产生亚甲基-THF形式的Cl单元可随后还原为甲基-THF或进一步氧化为甲酰-THF。甲硫氨酸生物合成需要还原为甲基-THF。因此氧化反应与甲硫氨酸生物合成竞争Cl单元。甲酰-THF或甲酸对嘌呤和组氨酸的生物合成是必需的。在大肠杆菌中，在通过由PurU基因编码的甲酰基-THF脱甲酰基酶催化的反应中，甲酰-THF可转化为 THF 及游离的甲酸(Nagy 等(1995) J.Bacteriol 177 (5)p.1292-98) 亚甲基-THF到甲基-THF`的还原由MetF蛋白催化。甲基到高半胱氨酸上的转移由MetH通过维生素B12或直接由MetE催化。已知MetH酶的催化速率是MetE酶的一百倍。当缺乏维生素B12因而缺乏活性MetH时，MetE可构成多至5%的总细胞蛋白。活性MetH的存在降低MetE的活性，可能是通过降低通常经由MetR激活metE转录的高半胱氨酸的量来进行。因此，通过MetH产生甲硫氨酸为细胞节约了重要的资源，因为MetE并非大量表达。高半胱氨酸的积累对大肠杆菌是有毒的(Tuite等，2005J.Bacteriol, 187，13，4362-4371.)，而且同时对经由MetR的metA表达具有负面的调控效应。因此，显然酶MetH和/或MetE的强表达对有效的甲硫氨酸生成是必需的。在大肠杆菌中，还原的硫整合至半胱氨酸中，并随即转移到甲硫氨酸前体O-琥珀酰-高丝氨酸上，该过程称为转硫化作用(在Neidhardt, F.C.(主编)，R.Curtiss III, J.L.1ngraham, E.C.C.Lin, K.B.Low, B.Magasanik, ff.S.Reznikoff, M.Riley, M.Schaechter,和 H.E.Umbarger(编).1996.Escherichia coli and Salmonella:Cellular andMolecular Biology.American Society for Microbiology 中综述)。半胱氨酸通过硫氢化反应由O-乙酰丝氨酸和H2S产生。该过程受到其产物半胱氨酸的负反馈调控，半胱氨酸作用于由cysE编码的丝氨酸转乙酰酶。N-乙酰丝氨酸(其由O-乙酰丝氨酸自发产生)与转录因子CysB —同激活编码参与如下的酶的基因:含硫化合物的运输，它们变为H2S的还原及它们在有机硫化合物半胱氨酸(其与甲硫氨酸一样是必需氨基酸)中的整合。在缺乏半胱氨酸时，MetB催化甲硫氨酸前体0_琥珀酰高丝氨酸转化为氨、α -酮丁酸及琥拍酸，该反应称为γ-消去(Aitken&Kirsch, 2005，Arch BiochemBiophys433, 166-75)。α -酮丁酸可随后被转化为异亮氨酸。该副反应对甲硫氨酸的工业生产而言是不希望的，因为这两种氨基酸难以分开。因此低Y-消去反应活性或保持低异亮氨酸产生的其它手段是甲硫氨酸工业生产的重要方面。临时专利申请US60/650，124描述了如何通过优化酶MetB来减少Y -消去反应。优化半胱氨酸生物合成也可减少Y -消去反应由此减少副产物异亮氨酸的产生，并构成本发明的一个实施方案。
发明内容
本发明涉及一种在发酵过程中产生甲硫氨酸、其衍生物或前体的方法。所述方法包括:-在包含碳源与硫源的适当培养基中培养经修饰的微生物，和-从培养基中回收甲硫氨酸，其中与未修饰的微生物和/或方法相比，该微生物和/或方法通过如下修饰的至少一种或它们的组合而被修饰，以提供增加的甲硫氨酸/碳源得率:1-减少微生物中甲酰-THF的脱甲酰化2-减少微生物中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的消耗3-通过在培养基中对微生物限制或使其缺乏(starving) —种或数种无机底物而限制微生物的生长。在本发明的描述中 ，使用大肠杆菌中相应基因的名称来鉴定基因与蛋白质。然而，除非另外指明，根据本发明使用这些名称具有更一般的含意，并涵盖了其它生物中，尤其是微生物中所有相应的基因和蛋白质。还可以详明来自其它生物的基因和蛋白质，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的基因和蛋白质作为附加的信息。此附加信息的目的并不是限定基因或蛋白质的一般定义。在本发明的一个特定实施方案中，通过降低甲酰基-THF的脱甲酰基化(这通过消弱PurU基因(在谷氨酸棒杆菌中称为YP_001137322)的表达而实现)来增加甲硫氨酸/碳源得率。PurU酶催化甲酰基-THF脱甲酰基酶反应。脱甲酰基酶活性的削弱增加了甲基-THF的产生，而甲基-THF对于高半胱氨酸的甲基化所需的。脱甲酰基化造成的Cl代谢物的损失导致不能转化为甲硫氨酸的高半胱氨酸产量增加。于是，高半胱氨酸可成为酶胱硫醚ga_a合酶(MetB)的底物,该酶可催化O-琥拍酰高丝氨酸与高半胱氨酸之间的反应，导致高羊毛氨酸的生成。在本发明另一个特定的实施方案中，通过降低磷酸烯醇化丙酮酸(PEP)的消耗(这通过削弱丙酮酸激酶编码基因PykA和/或pykF而实现)来增加甲硫氨酸/碳源得率。增加的PEP利用率(availability)可增加天冬氨酸的重要前体草酰乙酸的产生，而天冬氨酸又是甲硫氨酸的前体。谷氨酸棒杆菌仅携带一个丙酮酸激酶基因，其对应于YP_226326。在本发明的另一个实施方案中，通过限制微生物的生长，或使该微生物缺乏无机底物来增加甲硫氨酸/碳源得率。这可通过限制培养基中可用的磷酸盐和/或钾的量来实现。上述对细胞生长的限制允许改善甲硫氨酸/碳源得率，因为碳并非用来生产生物质和/或维持此生物质，而是用来生产甲硫氨酸。具体而言，培养基中磷酸盐浓度允许生长至OD600小于200，优选为150，更优选为100。对于大肠杆菌，OD600为100相应于30到35g/l生物量，对于酵母为40-50g/l。对于其它微生物，该转换因子是本领域的技术人员所知的。对于大肠杆菌，产生Ig生物量所需的磷酸盐量为10-20mg,优选约18mg。产生Ig生物量所需的钾量为10-20mg,优选约18mg。对于谷氨酸棒杆菌,产生Ig生物量所需的磷酸盐量为14-21mg，优选约17mg。产生Ig生物量所需的钾量为23_33mg，优选约28mg。对于其它微生物，该转换因子是本领域的技术人员所知的。微生物可在丰富培养基或基本培养基中，优选在基本培养基中生长。合适的基本培养基如下所述。上述三种调节甲硫氨酸/碳源得率的方法可以单独使用或者与其它一种或两种方法组合使用。因此，通过削弱purU基因表达减少甲酰基-THF脱甲酰基化可与通过削弱基因PykA和/或pyKF的表达来减少PEP消耗以及与在培养基中限制或缺乏磷酸盐和/或钾相
彡口口 类似的，通过削弱purU基因表达减少甲酰基-THF脱甲酰基化可与通过削弱基因PykA和/或pyKF的表达来减少PEP消耗相结合。类似的，通过削弱purU基因表达减少甲酰基-THF脱甲酰基化可与在培养基中限制或缺乏磷酸盐和/或钾相结合。类似的，通过削弱基因pykA和/或pyKF的表达来减少PEP消耗可与在培养基中限制或缺乏磷酸盐和/或钾相结合。如本申请使用的下列术语`可用来解释权利要求与说明书。根据本发明，术语“培养”、“发酵”或“发酵过程”可以互换使用，以表示在含有简单碳源的合适生长培养基中培养细菌。总甲硫氨酸/碳源得率定义为甲硫氨酸+NAM(与甲硫氨酸等当量的NAM质量)(g)%/在发酵操作过程中消耗的葡萄糖(g)。甲硫氨酸衍生物源自甲硫氨酸转化和/或降解途径。具体而言，这些产物是S-腺苷甲硫氨酸(SAM)硫甲基核糖和N-乙酰甲硫氨酸。特别的，NAM是一种可易于回收的甲硫氨酸衍生物，可将其分离并通过脱乙酰作用转化为甲硫氨酸。短语“从培养基中回收甲硫氨酸”表示回收甲硫氨酸，SAM与NAM，以及所有其它可能有用的衍生物的行动。甲硫氨酸前体定义为其为甲硫氨酸特异代谢途径一部分的代谢物，或可由这些代谢物得到。具体而言，这些前体是O-琥珀酰高丝氨酸(0SH)，ga_a-胱硫醚，高半胱氨酸和高羊毛氨酸。甲硫氨酸特异性途径始自通过酶高丝氨酸琥珀酰转移酶将高丝氨酸转化为琥珀酰高丝氨酸。术语“微生物”表示细菌，酵母或真菌。优选地，微生物选自肠细菌科(Enterobacteriaceae)、芽抱杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，微生物为埃希杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒杆菌属(Corynebacterium)的菌种。还更优选,微生物为大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌菌种。术语“经修饰的微生物”指以增加甲硫氨酸/碳源得率为目标而经遗传修饰的微生物。本领域的技术人员知道如何调节特定基因的表达。通常的修饰包括用遗传元件转化微生物，包括基因替代、修饰启动子，以及引入用于表达异源基因的载体。术语“甲硫氨酸/碳源得率”定义为发酵过程中获得的甲硫氨酸量除以消耗的碳源量。它可以g甲硫氨酸/g碳源百分比，或mol甲硫氨酸/mol碳源来表示。术语“增强的”在此上下文中描述与无特定修饰的微生物和/或无修饰的培养基相比可测量的增加。在优选实施方案中，该增加为至少2%g/g,优选至少4%g/g,更优选至少7%g/g。总甲硫氨酸/碳源得率优选为至少7%g/g，优选至少12%g/g,优选至少15%g/g,最优选至少19%g/g。为测量该增加，需确定消耗的葡萄糖量与产生的甲硫氨酸量。消耗的碳源量可通过如下方法计算:通过HPLC用折射检测或根据Brix针对补料分批溶液的方法确定生长培养基中的葡萄糖浓度。对于分批培养，消耗的葡萄糖对应于实验开始时残留的葡萄糖量减去实验结束时残留的葡萄糖量。对于补料分批发酵(关于详细的解释参见实施例)，消耗的葡萄糖量对应于分批培养中葡萄糖量，接种时加入的葡萄糖量以及补料分批阶段过程中注入的葡萄糖量之和减去实验结束时残留的葡萄糖量。术语“获得的甲硫氨酸”包括L-甲硫氨酸与易于回收的甲硫氨酸衍生物NAM。培养基中获得的甲硫氨酸量可在OPA/Fmoc衍生化后用HPLC，以L-甲硫氨酸(Fluka，Ref64319)为标准品通过荧光检测获得。使用折射HPLC使用NAM(Sigma，Ref01310)作为标准品测定NAM的量。根据本发明的术语“碳源”是指本领域的技术人员可用来支持微生物正常生长的任何碳源，其可为己糖(如葡萄糖、半乳糖或乳糖)，戊糖，单糖，二糖，寡糖(如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)，糖蜜，淀粉或其衍生物，半纤维素，甘油或它们的组合。一种特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一种优选的简单碳源是蔗糖。本发明中术语“基因表达的削弱”表示基因表达的部分或完全抑制，此时该基因的表达被称为“削弱的”。此表达抑制可以是基因表达的抑制，基因表达所需的启动子区的部分或全部缺失，基因编码区的缺失，或将野生型启动子交换为较弱的天然或合成启动子。优选地，基因削弱基本上是 所述基因的完全缺失，该基因可替换为选择性标记基因以帮助鉴定、分离和纯化本发明所述的菌株。优选通过同源重组技术使基因失活(Datsenko，K.A.&ffanner, B.L.(2000)^One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichiacoli K_12using PCR products”.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:6640-6645)。术语“增强的”或“过表达的”在本上下文中描述由相应DNA编码的酶活性的胞内活性的增加，例如通过增加基因的拷贝数，使用更强的启动子或使用具有增加活性的等位基因，及可能地组合这些方法。术语“表达增加” “表达增强”或“过表达”在本文中可互换使用，含意相似。为增加基因表达，该基因可编码于染色体中或染色体外。如于染色体中，可通过本领域技术人员所知的重组方法将一个或数个拷贝引入基因组中。如于染色体外，可用不同类型的质粒携带基因，所述质粒的复制起点和由此在细胞内的拷贝数方面不同。所述基因可以1-5拷贝，大约20拷贝或者直至500拷贝存在，对应于严紧复制的低拷贝数质粒(PSC101、RK2)，低拷贝数质粒(pACYC、pRSF1010)或高拷贝数质粒(pSK bluescript II)。在本发明的一个优选实施方案中，该基因可用不同强度的启动子表达，该启动子可为诱导型。这些启动子可为同源的或异源的。本领域的技术人员知道哪些启动子最为便利，举例而言，启动子Ptrc、Ptac、Plac或lambda启动子cl是广泛使用的。
酶的表达可由使其相应信使RNA(Carrier 和 Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15, 58-64)或蛋白质(例如GST标签，Amersham Biosciences)稳定化或不稳定化的元件而增大或减小。本发明还涉及含有根据本发明要增强的基因的一个或数个等位基因的微生物。在本发明的描述中，使用大肠杆菌中相应基因的名称来鉴定基因与蛋白质。然而，除非另外指出，根据本发明使用这些名称具有更一般的含意，并涵盖了其它生物中，尤其是微生物中所有相应的基因和蛋白质。PFAM(protein families database of alignments and hidden Markov models,比对和隐藏马尔可夫模型的蛋白质家族数据库http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)是蛋白质序列比对的大集合。每个PFAM可用于观察多重比对，观察蛋白质域，评价生物中的分布，获准进入其他数据库，以及观察已知蛋白质结构。COGs (clusters of orthologous groups of proteins 蛋白质正向同源组的簇；http://www.ncb1.nlm.nih.gov/COG/)可通过比较来自66个全部测序完成的基因组的蛋白质序列来获得，所述基因组代表了 30个主要的系统发生系。每个COG自至少三个系定义，其允许鉴定以前保守的域。识别同源序列及其百分比同源性的方法对于本领域的技术人员来说是公知的，并具体地包含BLAST程序，可由网址http://www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST/以该网址上所示的默认参数使用该程序。获得的序列可以使用如CLUSTALW(http://www.eb1.ac.uk/clustalw/)或者 MULTALIN(http://prodes.toulouse.1nra.fr/multalin/cg1-bin/multalin.pl)以这些网站上所示的默认参数加以利用(例如，比对)。使用GenBank上给出的关`于已知基因的参考文献，本领域的技术人员可确定在其它生物体、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中等同的基因。可以使用可通过与源自其它微生物的基因进行序列比对而确定的共有序列并设计简并探针以克隆在另一种生物中的相应基因而有利地完成此常规工作。这些分子生物学常规方法对于本领域的技术人员而言是熟知的，并描述于例如Sambrook等(1989 Molecular Cloning:a LaboratoryManual.第 2 版.Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York.)。“对生物体限制无机底物”定义为该微生物的生长受到添加的非有机化合物的量支配，但仍允许微弱生长的情况。上述底物的实例为磷酸盐、钾、镁或它们的组合。使生物体缺乏无机底物定义为由于缺乏无机底物而导致微生物生长完全停止的情况。上述底物的实例为磷酸盐、钾、镁或它们的组合。在本发明中，发明人旨在通过代谢工程改造生产菌株以增加甲硫氨酸/碳源得率。在本发明的一个特定实施方案中，甲硫氨酸/葡萄糖和/或甲硫氨酸/蔗糖得率(g/g)为至少10%g/g,优选至少15%g/g,更优选19%g/g。在本发明的一个特定实施方案中，参与硫同化、丝氨酸生成、丝氨酸转化为甘氨酸或甘氨酸裂解的至少一个基因的表达增加。增加微生物的硫同化是有利的，因为甲硫氨酸是一种含硫氨基酸(C5H11NO2S)。此外，增加氨基酸丝氨酸和甘氨酸的产量以及甘氨酸裂解(即代谢)是有利的。甘氨酸裂解与丝氨酸转化为甘氨酸是生成亚甲基-THF的两个主要的反应，亚甲基-THF可还原为甲基-THF，甲基-THF又是高半胱氨酸甲基化生成甲硫氨酸所需的。丝氨酸生成由3-磷酸甘油酸脱氢酶，磷酸丝氨酸磷酸酶和磷酸丝氨酸氨基转移酶等酶催化。甘氨酸裂解由甘氨酸裂解复合体催化。在大肠杆菌与谷氨酸棒杆菌中，涉及前述活性且其活性可增加的酶由下述基因编
码(其后为登录号和相应多肽的功能):
权利要求
1.饰的微生物，其具有增加的甲硫氨酸/碳源得率，其中基因purU缺失。
2.饰的微生物，其具有增加的甲硫氨酸/碳源得率，其中基因PykA和/或pykF缺失。
3.饰的微生物,其具有增加的甲硫氨酸/碳源得率，其中基因purU、pykA和pykF缺失。
4.利要求2或3的微生物，其中 -基因metH、metF、cysE、反馈敏感性降低的metA等位基因和反馈敏感性降低的thrA等位基因过表达， -基因metj缺失， -操纵子cysPUWAM和cysJIH过表达。
5.利要求4的微生物，其中基因gcvTHP的表达增加。
6.利要求4的微生物，其中基因metF或Ipd过表达。
7.利要求4的微生物，其中基因serA、serB和serC过表达。
8.利要求4的微生物， 其中基因glyA过表达。
全文摘要
本发明涉及增加甲硫氨酸得率，具体地涉及通过在包含碳源和硫源的适当培养基中培养微生物来生产甲硫氨酸或其衍生物的方法。该微生物和/或该培养基经修饰，使得甲硫氨酸/碳源得率增加。本发明也描述了从发酵培养基中分离甲硫氨酸或其衍生物。
文档编号C12N1/21GK103087971SQ201210557318
公开日2013年5月8日 申请日期2008年9月25日 优先权日2007年10月2日
发明者雷纳.菲格, 菲利普.苏凯勒, 吉劳姆.巴比尔, 格温耐尔.贝斯特尔-科雷, 锡德里克.博伊萨特, 米歇尔.查蒂厄 申请人:代谢探索者公司