专利名称：一种通用的植物表达载体构建方法
技术领域：
本发明涉及一种构建通用植物表达载体的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
在植物基因工程研究中，构建植物表达载体是很重要的一个环节。载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的媒介，没有载体，目的基因无法进入受体，即使进入受体细胞也无法表达。细菌质粒载体或噬菌体载体连接启动基因及多聚核糖体的基因序列就组成了表达型载体。表达载体的构建是一项非常重要但又比较繁琐的工作，因此，研究表达载体的构建方法便具有重要的现实意义。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。在为某种特定的植物构建表达载体时，为了使外源基因高效、安全表达，或由于特定的要求，需要构建新载体或改造已有载体，而选择一种 合适的载体构建方法，从而达到方便、快捷的目的就显得十分重要。传统的载体构建方法，主要是在体外经限制性内切酶酶切质粒载体DNA，然后在DNA连接酶的作用下同目的基因结合成环，最终得到转化载体。在此过程中，一般的步骤是，先在具有多克隆位点的初步载体上寻找合适的酶切位点，得到入门载体。为了与合适的启动子、选择性标记基因等序列元件连接，中间还需要转换多个载体和一系列的酶切、连接、转化、回收等工作，因此，传统的载体构建方法在构建多片段拼接的复杂载体时，其路线设计和实际操作往往比较麻烦，通常需要构建多个中间载体，费时费力。但是，在没有更便捷的方法之前或者构建的载体比较简单时，采用传统的构建方法还是一种比较安全、稳妥的选择，而且能够获得预期的结果。Gateway技术是Invitrogen公司开发的一项基因克隆和表达的新技术,它利用位点特异重组构建入门载体(entry clone)后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶，而且一旦拥有了一个入门载体，就可以利用它将目的基因多次转移到各种不同的表达载体(目的载体,destinationvector)上。此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不会影响不同基因的测序结果，因而每当使用一种新的表达系统时，可以节省大量时间。Gateway技术是一种通用性的克隆方法，利用该技术可以快速、高效地将目的基因同时构建到多种与Gateway技术兼容的载体系统中，用于基因的蛋白质表达和功能分析。Gateway的优势有以下几个方面(1)简单快速的反应在室温60min后即可转化E. coli ； (2)克隆效率高> 90%甚至>99%的克隆是目标克隆；(3)快速直接克隆PCR产品；(4)特异性反应保持阅读框架和基因的位置不变。目前，Gateway技术已经应用在许多领域中，如构建RNAi载体时优先考虑使用此技术。含三段T-DNA载体是获得无筛选标记转基因植株关键。抗生素筛选标记基因是目前转基因植物安全性的隐患之一，很多植物转基因材料因此而不能获准商品化生产。现在有几种无筛选标记的植物转基因技术，包括共转化法(cotransformation)、定位重组体系(site-specif icrecombination)、多兀自动转化载体系统(mult-auto-transformationvector)、转座子系统(transposition system)和同源重组体系(homologousrecombination)等，但只有共转化法的应用最为成功。共转化法就是利用基因枪介导将分别携带目的基因和标记基因的二个质粒载体混合转入受体细胞中，之后即可在Tl或T2的分离后代中获得无筛选标记的转基因植株，不足的是转化频率比较低。利用分别含有不同双兀表达载体的农杆菌混合侵染植物细胞，同时含有二个不同双兀表达载体的农杆菌侵染植物细胞或含有二段T-DNA双元表达载体的农杆菌侵染植物细胞。由于目标基因和选择标记基因位于不同载体或不同T-DNA上，后代中能够获得无标记转基因植株，获得频率同样比较低。传统的载体构建方法在构建多片段拼接的复杂载体时，往往操作步骤繁琐，通常要构建多个中间载体，陆云华等构建质体定点表达载体PRSMGA时，采用了一种通用高效的复杂载体构建新方法，它属于多片段拼接的水稻单交换表达载体，是一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法。此法在引物设计时，在目的片段5’端加上随机设计的接头，利用PCR克隆目的片段，再用T4DNA聚合酶3’ -5’外切酶活性处理PCR克隆目的片段，产生多个首尾相匹配的粘性末端，进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。七个片段拼接的表达载体pRSMGA的构建，只需做两次连接转化就可以完成，且其重组转化效率高。陆云华等已经用这 种方法构建了几十个载体，证明这是一种简便、通用、高效的复杂构建载体的方法。以上是构建植物表达载体的几种方法，其中传统构建法通用，不受限制，但构建效率不稳定，在酶切、连接过程中需要选择合适的位点，一旦没有合适的位点，一个简单的构建也会非常耗时耗力。Gateway技术也较为通用，通过两次反应就可完成载体构建，其效率极高，但它往往需要与其他手段结合获得入门克隆，且其成本高昂。三段T-DNA法需要农杆菌介导的共转化法以去除选择标记，能获得安全的转基因植株，但其一般需要田间筛选分离，只适用于转基因研究的目的载体，需要得到种子进行下一代植株分离，才能得到无标记植株。复杂载体构建法适于大片段载体构建，步骤相对较少，且其效率很高，而对于一些简单载体构建则无优势可言，同时它需要与PCR结合，也限制了其应用范围。结合以上载体构建方法的优点和不足，急需一种通用高效，应用范围较广的载体构建方法。
发明内容
本发明提供了一种构建通用植物表达载体的方法。技术问题本发明的目的是针对植物表达载体传统构建方法中，构建效率不稳定，在酶切、连接过程中需要选择合适的位点，一旦没有合适的位点，一个简单的构建也会非常耗时耗力的不足，提供一种构建通用植物表达载体的方法，以克服在植物表达载体构建过程，因为没有合适的酶切位点而导致效率大幅下降的缺陷。该方法的应用，将会大大提高一些简单载体的构建效率，提高植物表达载体的构建成功率，从而大大拓宽该方法的应用范围。技术方案本发明所提供的一种构建通用植物表达载体的方法是通过以下方法构建而成I)目的基因序列选取了 fla基因作为目的基因。2) fla基因作为目的基因构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pCMBIA1300上(I)用于构建双元转化一表达载体的质粒的是由T-DNA改造而来，其中除T-DNA25bp重复序列(LB和RB)，真核生物表达的花椰菜花叶病毒的启动子35S(p35S)和终止子夕卜，还有在原核生物(细菌)中作为选择标记使用的nptl和在真核生物(植物)中作为选择标记使用的hptll。用于选择的抗生素均为Km和HYG。作为目的基因使用的fla基因插入在pCMBIA1300质粒的p35S和T-DNA 25bp重复序列RB之间的多克隆酶切位点上，我们所采用的转基因载体PCAMBIA1300，其上含有一个35S启动子和终止子。质粒pCAMBIA1300经过XhoI酶切后自连得到7. 9kb的重组质粒片段。设计引物添加酶切位点BamHI和SalI扩增35S启动子和终止子，扩增得到的DNA片段连入pMD18-T载体。最后得到一个含有BamHI和SalI酶切位点的35S启动子和终止子克隆pMD18-T :35S。(2)将fla基因用XhoI酶切，将pMD18-T :35S用XhoI单酶切并用去磷酸化酶CIAP处理后回收3. 6kb大片段。将此大片段和酶切回收的fla基因一起进行连接。最后酶切验证并测序得到pMD18-T 35S fla重组片段。 (3)将pMD18-T 35S fla重组片段用SalI酶切位点切下2kb左右35S fla基因片段，同时用SalI单酶切pCAMBIA1300载体，二者混合连接即可得到pCAMBIA1300 fla重组植物表达载体。
图lpCMBIA1300: :fla基因重组载体构建图XhoI酶切pCAMBIA1300后自连；扩增35S启动子和终止子并连入pMD18-T载体；构建pMD18_T 35S fla重组片段；SalI酶切连入 PCAMBIA1300。
具体实施例方式I.在植物中表达fla基因的双元转化-表达载体pCMF(pCMBIA1300: :fla)的构建用于构建双元转化-表达载体的质粒的是由T-DNA改造而来，其中除T_DNA25bp重复序列(LB和RB)，真核生物表达的花椰菜花叶病毒的启动子35S(p35S)和终止子外，还有在原核生物(细菌)中作为选择标记使用的nptl和在真核生物(植物)中作为选择标记使用的hptll。用于选择的抗生素均为Km和HYG ;作为目的基因使用的基因插入在PCMBIA1300质粒的多酶切克隆位点上，所用内切酶为BamHI，即获得基因重组载体。双元载体 pCMBIA1300 为公知公用载体(Roberts, C.，Rajagopal, S.，Smith, L. Μ.，et al. 1994，Plant Mol. Biol. 25(6)，989-994)。双元转化-表达载体pCMBIA1300: :fla转化植物及fla基因在转基因植物中的表达构建的双元转化载体质粒pCMBIA1300: :fla，可以直接转化于含vir区辅助质粒、不带卡那霉素抗性的pTiBo542衍生质粒的感受态根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105 中。EHA105 是 EHAlOl (C58/pTiBo542)的 Km 敏感衍生株。重组根癌土壤杆菌转化植物细胞的方法用胚转化法。基因转化参照Hiei等的方法并加以修改。取开花后12 15d的稻穗脱粒，表面灭菌后接种在NB培养基上，26°C下暗培养诱导愈伤组织。约5 7d后取愈伤组织在相同条件下继代培养，用于共培养。农杆菌于含50mg/L卡那霉素(Km)的YM平板上划线，28°C下暗培养3d，用金属匙收集农杆菌菌体，悬浮于共培养CM液体培养基中，调整菌体浓度至0D_为O. 3 O. 5，加入乙酰丁香酮(AS，终浓度为100mg/L)，SP为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。将继代培养4天后的愈伤组织浸于此菌液中，20min后取出并用无菌滤纸吸去多余菌液，随即转入铺有无菌滤纸的固体培养基上，于26°C下暗培养2 3天。共培养后的愈伤组织在含50mg/L潮霉素的筛选培养基上，26°C下暗培养14天，再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14天。然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/L潮霉素的分化培养基上，暗培养3天后转至15h/天光照条件下培养，再生的小苗在1/2MS上生根壮苗两周左右。选择高约10cm、根系发达的小苗，按编号移栽入土。对Tl代植株按株系检测转化频率以及植株中fla基因的表达。转化株系的检测方法是用PCR法检测转化植株叶片中fla基因，fla基因的表达用定量RT-PCR方法检测植株叶片中fla基因的RNA的积累。根癌土壤杆菌EHA105为公知公用菌株，基因转化和转化细胞的植株再生方法为转基因植物的常规方法。(Hiei Y, Ohta S, Komari T, et al. Efficient transformationof rice(Oryza sativa L. )mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the、boundaries of the T-DNA. Plant J, 1994, 6 :271-282)。2. fla基因转基因水稻的表型特征将I所得到的fla基因转基因水稻的T1代种子分别播种在温室和病害流行区隔离田块中，用人工接种法测定fla基因转基因水稻株系对稻痕病(Magnaporthe grisea)和水稻细条斑病(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)的抗病型。人工接种法用常规喷雾(稻瘟病菌)和针刺接种法(细条斑病)。通过43个转基因水稻株系约4000个单株的鉴定结果,对稻瘟病中抗的单株占10 %，对水稻细条斑病表现中抗的单株约占5 %，与对照相比，防病效果分别达到60-80%和40 50%。用于转基因的亲本水稻品种有优质粳稻武育粳3号及日本晴(图I)。进行抗病性鉴定的水稻细条斑病菌和稻瘟病菌均为公知公用。转基因亲本水稻品种武育粳3号及日本晴是生产上使用的品种，公知公用。表达fla基因的转基因植物品系分子生物学特征从水稻T1代植株中有约80%的单株可以用PCR方法检测到fla基因的全长插入序列。用定量RT-PCR方法可检测到fla基因表达，PCR和RT-PCR方法是分子生物学常规研究方法。
权利要求
1.一种通用的植物表达载体构建及转化方法，包括以下步骤本发明方法可利用载体的双多克隆酶切位点构建植物表达载体，从而大大拓宽该方法的应用范围。
a.构建含有启动子终止子的中间载体； b.利用中间载体将目的基因连入高效植物转化载体PCMBIA1300上，获得植物表达载体； c.将构建的植物表达载体转化水稻细胞，外植体在植物再生培养基中筛选被转化的再生植株(TciR),检测转化株系，获得转基因水稻。
2.按照权利要求I所述的方法，其特征在于，用带有目的基因植物表达载体转化水稻受体组织是将待转化植物受体组织与有转化能力的根农杆菌接触转化所述组织，所述中间载体是含有启动子和终止子的PMD-18T载体，所述高效植物转化载体是PCMBIA1300载体。
3.按照权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的水稻是籼稻、粳稻和爪哇稻。
4.按照权利要求3所述的籼稻、粳稻和爪哇稻，是常规稻，杂交稻不育系、保持系和恢复系。
5.按照权利要求I所述的目的基因是有应用价值的抗逆基因、抗虫基因、抗病基因、抗除草剂基因、抗衰老基因、品质改良基因以及由上述基因组成的融合或多价基因。
全文摘要
本发明提供了一种构建通用植物表达载体的方法，属于生物技术领域。包括构建含有启动子终止子的中间载体；利用中间载体将目的基因连入高效植物转化载体pCMBIA1300上，获得植物表达载体；将构建的植物表达载体转化水稻细胞，外植体在植物再生培养基中筛选被转化的再生植株(T0代)，检测转化株系，获得转基因水稻。本发明方法可利用载体的双多克隆酶切位点构建植物表达载体，从而大大拓宽该方法的应用范围。
文档编号C12N15/82GK102978237SQ201210575410
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者王晓宇, 刘文真, 陈志谊, 罗楚平, 张荣胜, 周华飞 申请人:江苏省农业科学院