专利名称：水稻nwl1基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及水稻NWLl基因及其编码蛋白与应用。
背景技术：
在我国水稻是最主要的粮食作物之一，有60%以上的人口以稻米为主食，因此对稻米的需求量较大。然而，由于人口众多与随之而来的城市化和工业化进程，可用耕地面积正在逐步的减少，因此在水稻育种中高产与超高产仍然是永恒的主题。在众多的水稻表型中叶片性状是影响水稻生产的重要因素。绿色植物物质积累中只有5%-10%的物质来自根部吸收的营养物质，而90%-95%的物质则来自作物叶片的光合作用，叶片是绿色植物物质积累的重要器官。叶片是光合作用、蒸腾作用以及抗逆性能等生理功能的主要器官，因此叶片形态对整个植株的生命活动有着重要的影响。因此，叶片性状成为水稻高产育种及株型改良过程中关注的焦点。目前的高产及超高产水稻品种，包括杂交稻，在叶片形态上往往表现出叶片较长较宽，叶面积较大，但是面积大的叶片往往因叶脉支持力不足导致叶片披垂，上部叶片的披垂会影响整个植株以至群体的透光情况，最终会导致光合效率降低，从而影响最终产量。在理想株型中，叶面积较大而又卷曲直立，卷叶在一定程度上有助于保持叶片挺直，从而有助于减少叶片披垂。通过研究卷叶对叶片光合作用，群体生理效应以及经济效益的影响，结果表明叶片卷曲的最直接影响是对叶片的直化作用，卷叶可以使叶片挺直，卷曲度越高的叶片其挺直度越高，叶片的角度越小，消光系数越小。因此卷叶被认为是解决较大叶面积与叶片披垂之间矛盾的最有效的方式。叶片适度卷曲可以使中高密度群体中后期的受光条件和通风状况条件得到改善，群体光合速率提高，从而有利于干物质的积累。此外非卷叶品种在正常生理条件下，自然界中的逆境刺激包括干旱等会直接导致叶片的卷曲，这种卷曲是一种避害机制，往往是由于叶片内部细胞膨压降低所至，是内部水势和渗透压调节的结果，因此叶片卷曲度也是衡量水稻品 种抗旱性的形态指标之一。研究认为叶片上表皮的泡状细胞收缩直接导致了叶片卷曲。这是一种脱水避旱的机制，叶片发生卷曲可以降低电导率和有效叶面积，减少受到的辐射量，从而降低蒸腾作用，以减少水分的丧失。在水稻高产与超高产育种中，叶片的适度卷曲是重要的形态指标并且得到了广泛的应用。国际水稻研究所IR8 ;韩国密阳22、密阳23 ;我国杂交稻恢复系C57、KC57及其配制的杂交种黎优57、盐优57，泗优422 ;两优培九与培矮64s/E32 ;不育系中浙A，保持系C堡；恢复系9308等都为卷叶类型。在不同遗传背景的条件下，水稻卷叶性状一般受一对或几对隐性基因控制，但也有研究表明该性状是由半显性单基因或多基因控制。通过经典遗传学方法在水稻经典遗传图谱上已经定位了 6个控制卷叶的基因，这些基因均为隐性基因，它们是RL1、RL2、RL3、RL4、RL5 和 RL6，分别位于 1、4、12、1、3 和 7 染色体上(http://www. gramene. org/)。其中RLU RL2、RL3纯合体的叶片表现为筒状卷曲，RL4、RL5和RL6纯合体的叶片表现半卷。此外借助分子标记的方法又相继定位了 10个卷叶基因第10染色体的显性基因RL12(t)，第2染色体的不完全显性基因RL (t)以及隐性基因RL7、RL8、RL9(t)、RLlO (t)、URLl (t)、W32、NAL3 (t)、RLll (t)。研究还发现还有许多由多基因或半显性基因控制的卷叶突变体。一部分卷叶基因已被克隆，其功能也有初步研究。R0LLEDLEAF9(RL9)定位于Chr9，主要在根、叶、花等器官中表达，定位于细胞核，该基因编码与拟南芥KANADIs基因家族同源的MYB转录因子，主要通过控制叶片的背腹极性引起卷曲；RL9的等位基因SLL1，该基因功能缺失会抑制远轴特征的发育，从而引起SLLl突变体叶片的高度内卷；突变体ADL1，该突变体叶片背腹的表皮细胞形态改变，形态类似泡状细胞，导致叶片支持力减小，造成了叶片的背腹卷曲。ADLl基因编码一个类钙调素半胱氨酸蛋白酶；0sAG07，该突变为功能获得性突变，造成其卷叶性状的原因是由于T-DNA插入到0sAG07基因的5’UTR区，从而使其过量表达，该基因编码ARGONAUTE (AGO)家族成员，突变体叶片表现为内卷，系统发育分析表明他与拟南芥中ZIPPY(ZIP/AG07)是直系的同源基因，共同包括PAZ PIffI区域；ABAXIALLY⑶RLED LEAFl (ACLl)与他的同系物ACL2的过量表达可以使泡状细胞变大，数目增多，导致叶片外卷。此外，少量的突变体同时表现出细卷叶特性NARROW ANDROLLED LEAFl (nrll)，该基因定位于Chrl2，编码纤维素合酶相似蛋白(oscsLcM)，该基因在抽穗期所有的器官中表达，nrll基因编码的蛋白在叶形态与营养发展中起重要的作用；NAL3，该突变体植株矮化、生育期延迟、结实率降低、叶片变短变细、此外还表现出内卷的特性；NARR0W LEAF7该基因定位于Chr3，是控制叶宽的主效基因，突变体叶片细卷，该基因编码YUCCA家族的单加氧酶，主要与生长素生物的合成有关，突变体叶片中IAA浓度显著降低。NARROW LEAF7与T-DNA插入突变体C0NSTITUTIVELYWILTED1 (COffl)等位，该突变体表型除叶片细卷外，根部还有所变短。
发明内容
为进一步研究控制水稻叶`形的分子机理，本发明的目的是提供水稻NWLl基因及其编码蛋白与应用。本发明提供一种水稻NWLl基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。NWLl基因共有10个外显子和9个内含子，基因组全长12099bp，⑶S区的核苷酸序列如SEQ IDNo. 3 所示，共 6780bp。本发明提供由上述水稻NWLl基因编码的蛋白，其为I)由SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或2)在SEQID No. 2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白质。水稻NWLl基因编码的蛋白由2259个氨基酸残基组成，主要由6个功能域组成，从N端开始分别是 PHD、2 个 Chromo、SNF2_N、Helicase C、DNA-binging。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如，将非活性区段的第507位K氨酸替换为E氨酸，得到蛋白的突变体序列，且不影响其活性。因此，本发明的水稻NWLl基因编码的蛋白质还包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有同等活性的水稻NWLl基因编码的蛋白质衍生得到的蛋白质。本发明水稻NWLl基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明还提供含有水稻NWLl基因核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体。本发明还提供含有所述载体的宿主细胞。本发明还提供含有水稻NWLl基因核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。本发明进一步提供水稻NWLl基因在调控水稻叶形中的应用。本发明的有益效果在于(I)本发明提供了水稻NWLl基因及其编码的蛋白，为进一步研究水稻叶形调控的分子机理提供依据。(2) NWLl基因具有控制水稻叶形的功能，有望以此对水稻叶片的形成进行调控进而对株型定向设计，以提高水稻生产力。
图1为实施例1中NWLl突变体Gsor22与野生型Indica9的表型。图2为实施例1中NWLl突变体S2-16、S1-88与野生型Japonica的表型。图3为实施例2中 NWLl基因定位与结构图。图4为实施例3中NWLl基因在植物各组织中半定量与定量PCR结果。图5为实施例3中⑶S载体pCAMBIA1305.1结构示意图。图6为实施例3中水稻GUS-NWLl基因转化水稻植物的植株染色结果。图7为实施例4中载体pCAMBIA1390结构示意图。图8为水稻RNA1-NWLl基因转化后水稻植株及叶宽、其半定量与定量PCR结果图。其中，LO为转化空载体；L1、L3与L4转化3-CDS RNAi载体；L2、L5转化5-CDSRNAi载体。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。实施例中所涉植物材料如下以下实施例中使用的水稻(Orya sativa)品种Indica9、Shiokari为标准品种(弓丨自 Dale Bumpers National Rice Research Center),籼稻 9311、粳稻日本晴和 02428 (引自山东水稻研究所)，水稻细卷叶突变体Gsor22、Sl-88、S2-16来自中国农业科学院作物科学研究所李学勇课题组。实施例1突变体的获得与表型分析突变体Gsor22是经EMS诱变籼稻品种Indica9得到，表型上它与野生型Indica9相比有着多方面的改变。Gsor22苗期主要表现为植株相对变矮，叶片细卷，并且叶片上表面发白。成熟期的突变体株高与分蘖明显减少，叶片显著的变细并内卷。在籽粒方面，Gsor22只有略微的变小。我们对抽穗期的突变体与野生型在不同的地点进行了田间数据统计，结果表明不同地点种植的突变体株高都不同程度的减小，分蘖数都减少60%以上，在叶片形态上突变体与野生型叶宽之间差异显著，突变体只有野生型的40%左右，此外叶长也有相对的减小。实验中我们另外发现了与Gsor22表型相似的两个突变体S2-16与S1-88，这两个突变体是由标准粳稻品种日本晴经EMS诱变得来，与Gsor22遗传背景不同。这两个突变体性状与Gosr22类似。田间数据表明这两个突变体株高与分蘖数都有不同程度的减少，叶宽减少最为显著。实施例2本发明水稻NWLl基因的获得本发明的NWLl基因是采用图位克隆法通过突变体Gsor22克隆得到的。经EMS诱变得到的突变体Gsor22经过多代自交种植确认该突变具有稳定遗传的特性。纯合突变体Gsor22与正常表型的籼稻9311、粳稻日本晴、02428分别进行杂交，所有杂交F1中个体均无细卷叶表型。在F2种植群体中出现了明显分离，通过调查分析，发现在3个不同群体中野生型与突变体的分离比列符合3:1遗传分离比例(Χ2〈Χ2α(15=3. 84)。由此我们可以推测，该水稻细卷叶突变体的突变性状是由一对隐性基因控制。为了定位控制该细卷叶突变体基因的位置，我们利用突变体Gsor22和02428构建的F2分离群体作为定位的群体， 以BSA法选取10株F2突变单株构建DNA混池，利用能较均匀覆盖全基因组的200对Indel标记对两个亲本与基因池进行多态性筛选，结果发现在第7染色体上的标记hal、hal0表现出连锁性，对10株F2突变株进行连锁分析，证明两个标记均与目标性状连锁。用这两标记扩增100株F2群体单株，hal和halo分别筛选出3个和2个交换单株，且两标记的重组个体互不相同，说明目的基因位于两标记之间。由于交换个体较少，且范围太大，为了能将基因定位在更小的范围内，在hal和halO之间设计更多新的Indel标记,具体序列参见表I。表I Indel标记引物序列
权利要求
1.一种水稻NWLl基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述水稻NWLl基因编码的蛋白，其为 1)由SEQID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或 2)在SEQID No. 2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白质。
3.含权利要求1所述基因核苷酸序列或其片段的载体。
4.含有权利要求3所述载体的宿主。
5.含有权利要求1所述基因或其特异片段的转化植物细胞或转基因植物。
6.权利要求1基因在调控水稻叶形中的应用。
全文摘要
本发明提供一种水稻NWL1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供所述水稻NWL1基因编码的蛋白。本发明同时提供了水稻NWL1基因在调控水稻叶形中的应用。
文档编号C12N5/10GK103045613SQ20121058995
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者李学勇, 王道峰, 赵金凤, 袁守江, 尹亮 申请人:中国农业科学院作物科学研究所