专利名称：一种干扰植物内源cle家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种干扰植物内源CLE家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽。
背景技术：
从上世纪90年代初高等植物第一个多肽激素一系统素的发现开始，已有来自包括拟南芥、水稻、大豆等不同植物的20余种小分子多肽激素被报道，参与包括免疫防御反应、根瘤形成、细胞分裂、干细胞维持与分化、气孔发生、花药绒毡层发育、花粉-柱头识别、花粉管导向及花瓣脱落等诸多重要生物学过程。从目前研究结果看，小分子多肽激素主要在近距离信号转导中起作用，通过与周边细胞膜表面的LRR-RLK家族的受体激酶相互作用，启动下游信号通路，参与植物发育过程中起重要作用的位置信号的建立和逆境应答等。植物多肽激素通常由几个到几十个氨基酸组成，一般是由一个较大的原初蛋白经过分泌和剪切加工产生。随着生物信息学技术的发展，越来越多的植物多肽激素被预测出来，人们也迫切希望对其功能有所了解。而利用目前现有的方法对植物多肽激素进行功能研究还存在许多问题。例如，1:由于编码多肽激素的基因通常较小，目前的基因突变方法如EMS诱变及T-DNA插入的方法很难突变到它们；2:由于多肽激素在植物体内是作为信号分子发挥作用，含量通常很低，目前的技术手段很难从植物体内分离并检测到这些多肽激素；3:由于编码植物多肽激素的基因通常属于某个基因家族，其编码的前体蛋白包含有保守的多肽编码区，功能存在冗余，即使突变掉其中某个成员也很难看到植物有所异常，因此也无从对其功能进行研究。CLV3/ESR(CLE)多肽激素 家族成员含有一个保守的包括12-14个氨基酸的CLE结构域，在拟南芥、水稻、玉米、大豆、油菜、烟草和包囊线虫等多个物种中都发现有CLE多肽激素的存在。拟南芥CLE家族有32个成员，CLV3是其中之一，主要参与茎尖分生组织维持，已有报道CLV3突变后茎尖分生组织干细胞数目增多，相应的营养分生组织和花序及花分生组织变大，花器官如萼片、花瓣、雄蕊及心皮数目均变多。结构域缺失实验表明，只保留CLV3的信号肽和CLE结构域足以行使CLV3的功能。体外合成对应CLV3CLE结构域12个氨基酸(N-RTVPSGPDPLHH-C)的CLV3多肽能够行使CLV3的功能，互补clv3突变体的表型，说明该12个氨基酸的CLE结构域是CLV3多肽激素的功能域。拟南芥CLE家族其他多个成员突变后没有可见表型，过量表达该家族成员表现出植株变矮、丛生及根分生组织分化等类似表型，暗示该家族成员间存在功能冗余。
发明内容
本发明的目的是建立一个有效产生小分子多肽激素的拮抗多肽的方法，通过转基因对特定多肽进行功能干扰，阻断其下游信号转导，进而对其进行功能研究，并挖掘其在模式植物拟南芥及作物上的潜在应用价值。
本发明的目的是提供一种干扰植物内源CLE家族多肽激素的方法及可能的应用。本发明的再一目的是提供小分子多肽激素CLV3的拮抗多肽。本发明的再一目的是提供小分子多肽激素CLEl的拮抗多肽。本发明的再一目的是提供小分子多肽激素CLE8的拮抗多肽。本发明的再一目的是提供小分子多肽激素CLE27的拮抗多肽。根据本发明的干扰植物内源CLE家族多肽激素的方法，其中，所述方法包括以下步骤:(I)获得多肽突变体突变小分子多肽激素CLV3的多肽编码区CLE结构域，将其多肽编码区CLE结构域(N-RTVPSGPDPLHH-C)第六位的甘氨酸(G)分别置换为丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)后产生有效拮抗多肽；或者突变小分子多肽激素CLEl (N-RLSPGGPDPRHH-C)的多肽编码区CLE结构域，将其多肽编码区CLE结构域第六位的甘氨酸(G)置换为苏氨酸(T);或者突变小分子多肽激素CLE8 (N-RRVPTGPNPLHH-C)的多肽编码区CLE结构域，将其多肽编码区CLE结构域第六位的甘氨酸(G)置换为苏氨酸(T);或者突变小分子多肽激素CLE`27 (N-RIVPSCPDPLHN-C)的多肽编码区CLE结构域，将其多肽编码区CLE结构域第六位的半胱氨酸(C)置换为苏氨酸(T)，(2)将步骤(I)中获得的多肽突变体的编码基因转入植物中表达。根据本发明的干扰植物内源CLE家族多肽激素的方法，将CLV3多肽第六位的甘氨酸分别替换为亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和赖氨酸后在转基因植物中产生明显的拮抗效应；将CLV3多肽激素第六位的甘氨酸替换为苏氨酸后在转基因植物中产生更强的拮抗效应。上述方法对于植物生长点的遗传操作有效，可以产生生长点变大的表型，从而导致花器官数目增加及果实变大，种子数目增加等。基于对CLV3多肽激素的研究表明CLE多肽中的第六位氨基酸是产生显性负突变的目标位点，即是产生拮抗效应的目标位点。进一步，将该突变技术应用到小分子多肽激素CLEl(N-RLSPGGPDPRHH-C)Jf CLEl第六位的甘氨酸替换为苏氨酸，对于植物花序分生组织遗传操作有效，能够增大植物花序分生组织，从而导致植物花数目变多，相应的果实数目变多等；应用到小分子多肽激素CLE8 (N-RRVPTGPNPLHH-C)Jf CLE8第六位的甘氨酸替换为苏氨酸，对于植物胚胎的遗传操作有效，能够改变植物胚胎发育过程中的细胞分裂模式，导致植物胚胎败育；应用到小分子多肽激素CLE27 (N-RlVPSCPDPLHN-C)Jf CLE27第六位的半胱氨酸替换为苏氨酸，对于植物花瓣大小的遗传操作有效，能够使植物产生小花瓣。根据本发明的具体实施方式
，将CLV3多肽激素的这些拮抗多肽通过转基因的方法转化到野生型植物中，实现增大营养分生组织和花序分生组织大小及增多花器官数目等目的。因此，将CLV3多肽激素的这些拮抗多肽通过转基因的方法转化到作物中具有潜在的增大营养分生组织和花序分生组织大小及花器官数目等应用价值。对于小分子多肽激素CLEl (N-RLSPGGPDPRHH-C)，将其多肽编码区CLE结构域的甘氨酸(G)置换为苏氨酸(T)，通过转基因的方法转化到野生型植物中，实现增大花序分生组织的目的。对于小分子多肽激素CLE8 (N-RRVPTGPNPLHH-C)，将其多肽编码区CLE结构域的甘氨酸(G)置换为苏氨酸(T)，通过转基因的方法转化到野生型植物中，可以导致胚胎败育。对于小分子多肽激素CLE27(N-RIVPSCPDPLHN-C)，将其多肽编码区CLE结构域的半胱氨酸(C)置换为苏氨酸(T)，通过转基因的方法转化到野生型植物中，能够导致花瓣细胞变小，最终导致花瓣变小。
因此，根据本发明的CLV3的拮抗多肽，通过将置换其多肽编码区CLE结构域(N-RTVPSGPDPLHH-C)第六位的甘氨酸(G)而获得，其中，CLE结构域的甘氨酸(G)可以分别置换为丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H)、天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)。通过二维氨基酸置换结合转基因的方法转化野生型植物，寻找特定小分子多肽激素的有效拮抗多肽的方法。利用该方法对小分子多肽激素进行研究和应用。根据本发明的具体实施方式
，以拟南芥小分子多肽激素CLV3为基础，通过二维氨基酸置换的方法得到一系列氨基酸置换后的有效拮抗多肽。这些CLV3拮抗多肽(CLV3e6A，CLV3G6L, CLV3G6I, CLV3G6V, CLV3G6F, CLV3G6ff, CLV3G6P, CLV3G6M, CLV3G6C, CLV3G6S, CLV3G6T, CLV3G6Y, CLV3G6N, CLV3G6Q, CLV3G6K, CLV3G6E, CLV3G6H, CLV3G6D和CLV3e6E)在野生型拟南芥植物中能够阻断正常CLV3多肽激素的功能及下游信号转导，导致茎尖分生组织变大、花器官数目变多等类似突变体的表型。因此，根据本发明的方法，CLEl拮抗多肽(CLE1t)能够导致野生型拟南芥植物花分生组织变大，CLE8拮抗多肽(CLE8e6T)能够导致野生型拟南芥植物胚胎败育，CLE27拮抗多肽(CLE27e6T)导致野生型拟南芥植物花瓣变小。据此方法可以针对某个特定多肽，将其第六位氨基酸替换为其他氨基酸，转化野生型植物产生其拮抗多肽，对其进行功能研究和实际应用。本发明实现了对小分子多肽激素的定向改造，能够针对某个特定多肽激素抑制其功能，进而达到对该多肽激素进行研究和应用的目的。
图1:CLV3多肽的二维氨基酸置换示意图，其中，CLV3多肽12个氨基酸被丙氨酸(Alanine, A)逐一替换，然后第六位的甘氨酸(Glycine，G)被18种其他氨基酸逐一替换。图2:CLV3多肽第六位甘氨酸的氨基酸置换结果，CLV3多肽第六位甘氨酸(G)依次被其它18种氨基酸替换后转化野生型植物，转基因植物表现不同比例的显性负突变(dominant-negative, D-N)类似clv3突变体表型(b)，其中苏氨酸替换(CLV3e6T)的转基因植物表现出最高达70%的类似clv3突变体表型(a)。图3:CLV3G6T转基因植物表型，a野生型植物的2心皮果荚横切图；bCLV3e6T转基因植物的4心皮果荚横切图；c野生型植物的茎尖分生组织(Shoot Apical Meristem, SAM)；dCLV3G6T转基因植物类似clv3突变体的增大的SAM ;e WUS在CLV3e6T转基因植物花序分生组织(Inflorescences meristem, IM)和花分生组织(Floral Meristem, FM)中表达；fWUS 在clv3-2突变体花序分生组织和花分生组织中的表达情况。图4: CLE8G6T转基因植物胚胎败育，CLE8G6T转基因植物表现出胚胎败育表型。(a )CLESg6t转基因植物果荚中有部分败育胚珠，如箭头所示；(b)野生型植物果荚中正常的胚珠；((3)野生型植物心形期胚胎；((1，64^)0^8(^转基因植物的败育胚胎，显示细胞分裂模式的异常。图5 =CLEIg6t转基因植物花序分生组织变大。CLEIkst转基因植物表现出花序分生组织变大的表型。(a)野生型植物花序；(b) CLEIkst转基因植物花序；(c)扫描电镜显示野生型植物花序分生组织；(d)扫描电镜显示CLE1t转基因植物花序分生组织。图(a)和(b)中箭头指示正在开放的花；图((3)和(d)中阴影标示花序分生组织。图a和b中箭头指示开放的花；图c和d中阴影指示花序分生组织。图6:CLE27C6T转基因植物花瓣变小，与Col-O野生型植物相比，CLE27C6T转基因植物表现出部分花瓣变小的表型。
具体实施例方式实施例11、CLV3多肽激素12个氨基酸的一维丙氨酸扫描通过设计引物及PCR的方法将点突变引入到CLV3基因的多肽激素编码区CLE结构域(序列为:N-RTVPSGPDPLHH-C)，完成该多肽区域12个氨基酸的逐一丙氨酸(Alanine，A)替换，将PCR产物(包括5’端起始密码子ATG前1857bp和3’端终止密码子TGA后1518bp调控序列及基因组序列559bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:ATGGATTCGAAGAGTTTTCTGCTACTACTACTACTCTTCTGCTTCTTGTTCCTTCATGATGCTTCTGGTCTCACTCTCTCTTTCACTCCTCTATATGTCTATAACTCATGTAAATGGATTCTTATAAGTCTCAACATAACTTTTTTTTGTTATTTACTATTTCACCAGATCTCACTCAAGCTCATGCTCACGTTCAAGGACTTTCCAACCGCAAGGTTATCTTCAACTTGTACTCATTAAGGCCTCTCAATATTCATGTGTTATGTTCATGTAGATGTCCGGTCCAGTTCAACAACTGTTTCATTGCTTTAGTTGTCACGAGAAATATTTGTATATATTATTATGGTGTGCAAAACATAGTAAAATGTTGTTCAATTGGCAGATGATGATGATGAAAATGGAAAGTGAATGGGTTGGAGCAAATGGAGAAGCAGAGAAGGCAAAGACGAAGGGTTTAGGACTACATGAAGAGTTAAGGACTGTTCCTTCGGGACCTGACCCGTTGCACCATCATGTGAACCCACCAAGACAGCCAAGAAACAACTTTCAGCTCCCTTGA)克隆到pD0NR221载 体，再亚克隆到pBGWFS7目的载体，得到构建依次命名为CLV3K1A，CLV3T2A，CLV3V3A, CLV3p4A, CLV3S5A, CLV3G6A, CLV3P7A, CLV3舰，CLV3P9A, CV33L10A, CLV3H11A 和 CLV3H12A (图1)。利用农杆菌转化结合花序浸泡的方法将这些构建转化到野生型拟南芥中，通过抗性筛选得到阳性转基因苗Tl代植株，并对其进行心皮数目统计。其中转CLV3e6A—株植物表现出多心皮类似clv3突变体的表型，进一步与野生型回交分析证明这一株CLV3e6AR基因植物是显性表型，且可以稳定遗传。将CLV3e6A这种能够在野生型植物中产生类似突变体表型的多肽称为拮抗多肽(antagonistic peptide)。2、CLV3多肽激素第六位甘氨酸的二维氨基酸扫描由于拮抗多肽CLV3e6A产生显性负突变效果的效率很低，为得到更高效率的拮抗多肽，我们将CLV3基因的多肽编码区CLE结构域的甘氨酸(Glycine，G)逐一替换为其他18种氨基酸，即亮氨酸(Leucine, L)、异亮氨酸(Isoleucine, I)、纟颜氨酸(Valine, V)、苯丙氨酸(Phenylalanine, F)、色氨酸(Tryptophan, W)、脯氨酸(Proline, P)、甲硫氨酸(Methionine, Μ)、半胱氨酸(Cysteine, C)、丝氨酸(Serine, S)、苏氨酸(Threonine, T)、酪氨酸(Tyrosine, Y)、天冬酰胺(Asparagine, N)、谷氨酰胺(Glutamine, Q)、赖氨酸(Lysine,K)、精氨酸(Arginine, R)、组氨酸(Histidine, H)、天冬氨酸(Aspartic acid, D)和谷氨酸(Glutamic acid, E)，依次命名为 CLV3G6L，CLV3G6I, CLV2G6V, CLV3G6F, CLV3G6ff, CLV3G6P, CLV3G6M,CLV3G6C, CLV3G6S, CLV3G6T, CLV3G6Y, CLV3G6N, CLV3G6Q, CLV3G6K, CLV3G6E, CLV3G6H, CLV3G6D 和 CLV3G6E，然后依照步骤一的方法分别克隆到PBGWFS7载体并转化拟南芥野生型植物，筛选Tl代阳性转基因苗，并统计心皮数目。结果显示这18种氨基酸替换产生clv3突变体表型的效率各不相同(图2)，其中拮抗多肽CLV3e6T的拮抗效率最高，达70%的转基因植物表现出显性负突变(dominant-negative, D-N)表型，即类似clv3突变体的表型(图2)。进一步的实验证据证明CLV3e6T转基因植物的表型与clv3突变体一致，表现出心皮数目增多、茎尖分生组织变大及WUS表达区域变大等(图3)，且这种表型可以稳定遗传。3、拮抗多肽方法在CLEl多肽激素中的应用
为验证对CLV3多肽行之有效的拮抗多肽方法对其他多肽是否有效，通过设计引物和PCR的方法，将拟南芥CLEl多肽(N-RLSPGGPDPRHH-C)第六位的甘氨酸突变为苏氨酸(命名为CLEle6T)，将PCR产物(包括5’端1829bp、3’端1105bp调控序列和基因组序列225bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示:ATGGCTAACTTGAAATTCTTGCTGTGCTTGTTCTTGATCTGCGTTTCCTTATCGCGTTCATCAGCGTCTCGACCGATGTTCCCAAACGCAGACGGGATTAAACGAGGGCG TATGATGATAGAAGCAGAGGAAGTGTTGAAAGCGAGTATGGAGAAGCTAATGGAGAGAGGTTTTAATGAGTCCATGAGACTCAGTCCTGGAGGTCCCGATCCTCGCCATCACTAA)克隆到pBGWFS7载体，然后转化野生型植物。结果显示5%转基因植物表现出花序分生组织变大表型(图4)。4、拮抗多肽方法在CLE8多肽激素中的应用通过设计引物和PCR的方法，将CLE家族成员之一的CLE8多肽(N-RRVPTGPNPLHH-C)第六位的甘氨酸突变为苏氨酸(命名为CLE8e6T)，将PCR产物(包括5’端1881bp、3，端1455bp调控序列和基因组序列261bp，如SEQ ID N0.3所不:ATGAAAGTGTTGAAGAGAGATTCGATGTTGTTACTCATAACACTCTATTTCTTGTTGACAACATCAATGGCTCGTCAAGATCCTTTTCTGGTTGGAGTCGAGAAAGACGTTGTCCCAGCTGGAACCGATCTAAAACAGAACAAGGCGAAACCTCATCTTCCTAATTTGTTTCGAACTATGAGAAGAGTTCCTACCGGTCCTAATCCATTACATCACATTTCTCCTCCTCAGCCTGGAAGTCTAAACTATGCTAGGAACTGA)克隆到 pBGWFS7 载体，然后转化野生型植物。结果显示10%转基因植物表现出胚胎败育表型(图5)。5、拮抗多肽方法在CLE27多肽激素中的应用通过设计引物和PCR的方法，将CLE家族成员之一的CLE27多肽(N-RlVPSCPDPLHN-C)第六位的半胱氨酸突变为苏氨酸(命名为CLE27e6T)，将PCR产物(包括5，端1606bp和3，端1201bp调控序列和基因组序列276bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示:ATGACTCATGCTCGAGAATGGAGAAGCTCTTTGACTACTACACTTCTAATGGTGATCTTGCTTTCTTATATGCTCCATCTCTTCTGTGTATATTCACGGGTAGGGGCAATTCGGATATTTCCAGAAACTCCGGCTTCGGGTAAGAGACAAGAAGAAGATCTAATGAAGAAGTACTTCGGCGCCGGGAAATTTCCACCGGTGGATTCTTTTGTCGGTAAAGGGATCAGTGAGAGTAAAAGAATAGTACCAAGTTGTCCGGATCCTTTGCATAACTAG)克隆到 pBGWFS7 载体，然后转化野生型植物。结果显示10%转基因植物表现出花瓣变小的表型(图6)。以上例子包括对CLV3、CLE1、CLE8和CLE27多肽激素的研究均证明该拮抗多肽方法能够针对某个特定多肽，干扰其功能，从而实现对特定小分子多肽激素的研究和应用。
权利要求
1.扰植物内源多肽激素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: (1)将CLV3多肽激素的第六位的甘氨酸分别置换为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，所述CLV3多肽激素的序列为N-RTVPSGPDPLHH-C, 突变小分子多肽激素CLEl:N-RLSPGGPDPRHH-C的多肽编码区CLE结构域，将其多肽编码区CLE结构域的甘氨酸置换为苏氨酸；或者 突变小分子多肽激素CLE27:N-RIVPSCPDPLHN-C的多肽编码区CLE结构域，将其多肽编码区CLE结构域的半胱氨酸置换为苏氨酸， (2)通过转基因方法将步骤(I)中获得的多肽突变体通过转基因方法在植物中表达。
2.分子多肽激素CLV3的拮抗多肽，其特征在于，通过将置换其多肽编码区CLE结构域:N-RTVPSGPDPLHH-C第六位的甘氨酸为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸而获得。
3.分子多肽激素CLEl的拮抗多肽，其特征在于，通过将小分子多肽激素CLEl的多肽编码区CLE结构域:N-RLSPGGPDPRHH-C第六位的甘氨酸置换为苏氨酸而获得。
4.分子多肽激素CLE8的拮抗多肽，其特征在于，通过将小分子多肽激素CLE8的多肽编码区CLE结构域的:N-RRVP TGPNPLHH-C第六位的甘氨酸置换为苏氨酸而获得。
5.分子多肽激素CLE27的拮抗多肽，其特征在于，通过将小分子多肽激素CLE27的多肽编码区CLE结构域:N-RIVPSCPDPLHN-C第六位的半胱氨酸置换为苏氨酸而获得。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种干扰植物内源CLE家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽。根据本发明的方法，通过氨基酸置换获得小分子多肽激素CLV3、CLE1、CLE8、CLE27的有效拮抗多肽，并通过转基因的方法在植物中表达，实现对特定多肽进行功能干扰，阻断其下游信号转导，进而对其进行功能研究，并挖掘其在模式植物拟南芥及作物上的潜在应用价值。
文档编号C12N15/82GK103088054SQ20121059019
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月29日 优先权日2012年12月29日
发明者刘春明, 宋秀芬, 国鹏, 任仕超, 徐婷婷 申请人:中国科学院植物研究所