专利名称：基于DNA hairpin和RCA的核酸检测方法
技术领域：
本发明属于生物分子检测领域，具体涉及一种基于DNA hairpin和滚环扩增(RCA)实现核酸分子快速、高灵敏检测的方法。
背景技术：
滚环扩增(rolling circle amplification, RCA)是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物(与部分环状模板互补)，在特殊的DNA聚合酶(phi 29 DNA聚合酶)催化下将dNTPs转变成单链DNA。其线性扩增倍数为105，指数化扩增能力大于109，实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。比如Juan Hu等人(Juan Hu, Chun-yangZhang ；Sensitive detection of nucleicacids with rolling circle amplification and surface-enhanced raman scatteringspectroscopy ;Anal. Chem. 2010，82，8991-8997)利用RCA实现了高灵敏度的核酸检测，但是其中设计过多分子探针设计，存在两步酶促反应，增加了检测的复杂性和检测成本。DNA hairpin是指一段单链DNA分子末端局部互补配对形成的一种特定分子结构，分为莖部(hairpin)和环部(loop)两个部分。DNA hairpin的莖-环结构在某些特殊的情况下可以打开，比如当另一段单链DNA与环部互补配对结合后，其茎-环结构就会打开。基于这种特性，多种核酸检测方法被提出。比如Gwo-bin Lee等人(Y1-chih Su, et al ；Multiple pathogen detection for poultry byultilizing integrated microfluidicsystem ;MiciOTAS’ 2012)利用在DNA hairpin的5’端和3’端分别修饰上荧光分子和荧光猝灭分子的方法来检测病原体DNA。但是荧光分子和荧光猝灭分子修饰价格昂贵，作为分子检测的成本过高，不利于检测方法推广使用。
发明内容
本发明的目的在于利用DNA hairpin的环部与特定单链DNA或RNA互补配对结合后其茎部会打开，以及目标核酸分子的量不同，打开的茎-环结构就不同的特性，将DNAhairpin的茎部碱基序列设计为滚环扩增的引物，以简化滚环扩增用于核酸检测的步骤，以实现简单，低成本，高灵敏度的核酸检测。为实现上述目的，本发明采用以下步骤I)将DNA hairpin修饰到固体载体上；2)加入环状DNA、酶、BSA、扩增原料；3)加入待测目标核酸分子，进行滚环扩增；4)扩增后对目标核酸分子进行定量检测。步骤I)中，所述固体载体包括纳米颗粒。步骤I)中,所述DNA hairpin,包括5’端连接分子修饰,环部,莖部。进一步地，所述5’端连接分子为生物素(biotin)，通过与固体载体表面链霉亲和素(streptavidin)结合,将DNA hairpin修饰固定到载体表面；进一步地，所述环部碱基设计成能与目标核酸分子互补配对的碱基；进一步地，所述茎部的3’端碱基设计成能与滚环扩增的环状DNA互补配对的碱基，作为滚环扩增的引物；步骤2)中，所述环状DNA为单链环状DNA，为滚环扩增的模板。步骤2)中，所述酶为恒温酶，包括phi 29 DNA聚合酶，RNA聚合酶。步骤2)中，当检测的目标分子是单链DNA时，扩增原料为四种脱氧核糖核苷酸，当检测的目标分子是RNA时，扩增的原料为四种核糖核苷酸。步骤3)中，所述目标核酸分子包括单链DNA或RNA。本发明的核酸检测方法利用了 DNA hairpin结构的可逆性和RCA的快速，简易性，提供了一种简易、高灵敏度的核酸分子检测方法，其优点和积极效果如下a)利用DNA hairpin作为RCA的检测探针,简化了用RCA检测分子的流程,减少了酶等生物试剂的使用，降低了检测成本；b)利用了 DNA hairpin结构的可逆性，同时保留了 RCA用于核酸检测高灵敏度等的优点；c)各种检测原料包括DNA hairpin,环状DNA,酶,扩增原料等均可在市场上买到，适于广泛推广使用。
图1为滚环扩增过程示意图；图2为DNA hairpin通过与目标分子结合引起结构改变示意图；图3为结合DNA hairpin和滚环扩增用于核酸检测的原理示意图。附图标记说明1.环状DNA ；2.滚环扩增引物；3.滚环扩增的长链DNA ；4. DNA hairpin的环部；5. DNAhairpin的茎部；6.目标核酸片段；7.氢键；8.连接分子；9.固体载体。
具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述利用DNA hairpin和RCA进行核算定量检测如方法。1. DNA hairpin的设计与合成
权利要求
1.一种基于DNA hairpin和RCA的核酸检测方法，其特征在于，包括以下步骤1)将DNAhairpin修饰到固体载体上；2)加入环状DNA、BSA、酶、扩增原料；3)加入待测目标核酸分子，进行滚环扩增；4)扩增后对目标核酸分子进行定量检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中，所述固体载体包括纳米颗粒。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中，所述DNAhairpin包括5’端连接分子、环部和莖部。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述环状DNA为单链环状DNA。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述酶为恒温酶，包括phi29 DNA聚合酶或RNA聚合酶。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，当检测的目标核酸分子是单链 DNA时，扩增原料为四种脱氧核糖核苷酸，当检测的目标核酸分子是RNA时，扩增原料为四种核糖核苷酸。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述目标核酸分子包括单链DNA 或 RNA。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNAhairpin的5’端连接分子为生物素，通过与固体载体表面链霉亲和素结合，将DNA hairpin修饰固定到载体表面。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述DNAhairpin的环部包括能与目标核酸分子碱基互补配对的碱基。
10.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述DNAhairpin的莖部的3’端包括能与环状DNA分子互补配对的碱基。
全文摘要
本发明提供了一种基于DNA hairpin和RCA的核酸检测方法。该检测方法通过将环部与目标DNA互补，茎部与环状DNA部分互补的DNA hairpin修饰到固体载体上；再加入环状DNA、酶、扩增原料等；当检测体系中加入目标核酸分子时，目标核酸分子与DNA hairpin的环部互补配对，茎-环结构打开，茎部的碱基与环状DNA杂交结合，RCA发生，目标核酸分子的量不同，打开的茎-环结构就不同，进而利用光学或电学的方法实现目标核酸分子定量。该方法以DNAhairpin作为RCA的检测探针，简化了用RCA检测分子的流程，降低了检测成本，同时保留了RCA用于核酸检测高灵敏度等优点，适于推广使用。
文档编号C12Q1/68GK103014168SQ201210591068
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者桑建明, 王玮 申请人:北京大学