专利名称：用于快速检测水体中产土臭素蓝藻的引物及方法
技术领域：
本发明涉及水质检测技术领域，具体涉及一种用于快速检测水体中产土臭素(geosmin)蓝藻的引物及PCR方法,用于快速准确地对水体中具有产geosmin能力的蓝藻进行定性检测。
背景技术：
土臭素(geosmin)，中文名二甲萘烷醇，淡黄色油状物，分子式C12H22O,化学结构式为反 _1，10- 二甲基 _ 反-9-萘烧醇(trans-1, 10-dimethyl-trans-9-decalol),饱和的环叔醇类物质，结构非常稳定，难以自然降解。geosmin具土霉味，气味阈值极低(水体中4-20 ng/L、鱼体中0.6 μ g/kg)，水体和鱼体中只要含有微量的该物质即可被人的嗅觉所觉察，不仅危及饮用水安全、降低水产品质量，而且增加供水和水产养殖生产成本，对社会、经济的负面影响较大。在水生态系统中，部分蓝藻和放线菌等原核生物是产生上述土霉味化合物的主要生物源，绝大多数源水异味与之相关。水体异味问题是水环境问题之一，其种类多样，包含土霉味、氯味、草木味、沼气味、芳香味、鱼腥味、药水味及化学药品味等8种嗅觉异味，但“土霉异味”是世界范围内备受关注的环境问题。目前，国内外对土霉味化合物的检测方法可分为两类，即嗅觉鉴定法和仪器分析法。嗅觉鉴定法存在精密度较差、无法测定低于嗅觉阈值浓度等缺点。仪器分析法一般先采用不同的前处理方法对其进行富集，再结合GC-MS来分析，分析方法的灵敏度主要取决于前处理方法的富集效率，且价格相对昂贵、耗时耗力。PCR是一种准 确、高效、应用最广的技术，但应用于水体中产geosmin蓝藻的检测方面，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种用于快速检测水体中产土臭素蓝藻的引物及PCR方法，采用PCR技术对水体中产geosmin蓝藻进行检测，这样即使水样中产geosmin蓝藻现存量很低或不高的情况下也可以扩增出应有的产物，是一种很有应用前景的水体异味早期监测技术，可为水体异味突发事件的预警预报、监控管理提供有力的技术保障。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是用于快速检测水体中产土臭素蓝藻的引物，其核苷酸序列为GEOl :5’ -GCYTTRCTTTGYTCKTATAC-3’，如 SEQ ID NO.1 所示；GE02 :5’ -YTTGTTCATRTARCGGCT-3’，如 SEQ ID No. 2 所示。该方法是以提取的待测藻样基因组总DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，最后电泳鉴定。详述如下一、引物的设计和合成
根据NCBI数据库中发布的geosmin合成酶基因序列设计引物，引物序列为正向引物(GEOl):5，-GCYTTRCTTTGYTCKTATAC-3’，如 SEQ ID NO.1 所示；反向引物(GE02):5，-YTTGTTCATRTARCGGCT-3’，如 SEQ ID No. 2 所示。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。二、待测藻样基因组总DNA的提取采集藻类样品，置于100 mL聚乙烯水样瓶中，摇匀待测藻样，吸取5-10 mL于10000 rpm离心3min，去除上清液，所收集的待测藻细胞采用CTAB法提取基因组总DNA。三、PCR过程以上述得到的待测藻样基因组总DNA为模板，用设计的上述引物进行PCR扩增。PCR 的反应体系为基因组总 DNA 1μ I (含 DNA1-1OOng), 2. 5U/y ITaq 酶I μ 1，IOX 含 Mg2+ 的 PCR 反应缓冲液 5 μ 1，lOmmol/LdNTPs 混合液 I μ 1,10Mmol/L GEOI/GE02引物各I μ 1，灭菌超纯水补足至25 μ I。PCR的反应程序为94°C初始变性5 min，然后进行35个循环(94°C 30s, 52°C30s, 72 °C 60s)，最后 72°C 延伸 3 min 结束，4°C 保存。四、PCR产物的检测 取PCR扩增产物8μ 1，加入2μ I 6 X Loading buffer，在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳(EB染色)，凝胶成像系统拍照保存。结果显示，产geosmin蓝藻基因组DNA能扩增出大小为825bp的单一目的条带。从而，根据825bp目的片段的有无，可以判断待测水体样本中是否存在产geosmin 蓝藻。本发明检测方法特异性强，对非产geosmin蓝藻基因组总DNA无扩增产物，而对产geosmin蓝藻基因组DNA能扩增出大小为825 bp的单一目的条带。本发明检测方法快速，从待测藻样基因组总DNA的提取、PCR扩增、电泳检测，一般5h可完成检测，且同时可做多个水样样本。适用于水体异味早期监测和水体异味突发事件的预警预报等。
图1是本发明实施例的PCR特异性扩增检测电泳结果。图中，各泳道分别表示M DNA Marker II ；1 :存在产geosmin蓝藻水样样本；2_4 不存在产geosmin蓝藻水样样本。
具体实施例方式实施例12012年9月分别采集存在产geosmin蓝藻水样(采自湖南农业大学水产养殖基地池塘)和不存在产geosmin蓝藻水样样本(采自湖南省益阳市大通湖、浏阳市株树桥水库和长沙市年嘉湖)4个，采用CTAB法分别提取各样本待测藻样基因组总DNA，用本发明的引物对4个样本进行PCR检测，电泳结果见图1，结果表明存在产geosmin蓝藻水样和不存在产geosmin蓝藻水样样本PCR检测结果，仅有I呈阳性，可见本发明的检测方法具有很好的特异性。
序列表
<110〉湖侖农业大学
<120>用于快速检测水体中产土臭素蓝藻的引物及方法
<130>PHW13029
<160>2
<170〉PatentIn version 3. 3
<210〉I
<211〉20
<212>DNA<213〉人工序列
<400〉 I
gcyttrcttt gytcktatac20
<210〉2
<211〉18
<212〉DNA<213>人工序列
<400> 2
yxtgttcatr tarcggct18
权利要求
1.用于快速检测水体中产土臭素蓝藻的引物，其核苷酸序列为GEOl :5’ -GCYTTRCTTTGYTCKTATAC-3’ ；GE02 :5’ -YTTGTTCATRTARCGGCT-3’。
2.如权利要求1所述的用于快速检测水体中产土臭素蓝藻的引物，其特征在于所述引物是根据NCBI数据库中发布的土臭素合成酶基因序列设计的。
3.一种快速检测水体中产土臭素蓝藻的方法，其特征在于该方法是以提取的待测藻样基因组总DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增，最后电泳鉴定。
4.如权利要求3所述的快速检测水体中产土臭素蓝藻的方法，其特征在于所述PCR产物大小为825bp。
5.如权利要求3所述的快速检测水体中产土臭素蓝藻的方法，其特征在于所述PCR的反应体系为含DNA1-1OOng的基因组总DNA 1μ1、2·5 U/μ I Taq酶1μ1、10Χ含Mg2+的 PCR 反应缓冲液 5μ l、10mmol/LdNTPs 混合液 I μ1、10Mmol/L GE01/GE02 引物各 I μ1、及灭菌超纯水补足至25 μ I。
6.如权利要求3所述的快速检测水体中产土臭素蓝藻的方法，其特征在于所述PCR的反应程序为94°C初始变性5 min ;然后35个循环94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 60s ;最后72°C 延伸 3min，4°C 保存。
全文摘要
本发明涉及水质检测技术领域，具体涉及用于快速检测水体中产土臭素蓝藻的引物及方法，可用于快速准确地对水体中具有产土臭素(geosmin)能力的蓝藻进行定性检测。该方法是从采集水样中离心收集待测藻样，提取待测藻样基因组总DNA，使用特异性引物对待测藻样基因组总DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。采用本发明方法可以快速准确地判断水体中产geosmin蓝藻的存在状况，且可同时检测多个水体样本，具有检测速度快、成本低的优点。
文档编号C12N15/11GK103045749SQ20131001146
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月11日 优先权日2013年1月11日
发明者张婷, 李德亮, 肖调义 申请人:湖南农业大学