专利名称：一种同步检测十八种发热伴出疹病原体的试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及发热伴出疹病原体的检测试剂盒及其检测方法，尤其是涉及一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测十八种发热伴出疹病原体的试剂盒及其检测方法。
背景技术：
发热伴出疹性疾病是以发热、出症为主要临床表现的疾病，包括麻疹、风疹和其它RFIs，常以暴发形式发生。现有的发热伴出疹性疾病发病率高，尤对婴幼儿人群危害更大，给人类健康与社会发展造成巨大威胁。该类疾病临床症状一般表现较温和，但严重的并发症及其组织学相似性，使准确诊断病原体并进行辩证治疗变得至关重要。目前对发热伴出疹性疾病诊断如病原培养、血清学诊断和分子诊断等手段多数不够准确高效，延误治疗甚至造成严重后果。因此亟需建立发热伴出疹病原体快速高效的诊断方法。目前，我国发热伴出疹病原体的传统检测方法主要包括以下几种:(I)病原体检查:即直接做影像及活组织检查，或病原体分离培养，之后在显微镜、电镜下观察，做出诊断。优点:成本低；对实验室硬件要求低。缺点:1)耗时长:一般需3-5天或更长；2)诊断效率低:只能单菌纯培养；对一些表型特征变异的病原体，用形态学经验很难辨别；此外，由于抗生素的滥用，细菌在检测过程中生长受到抑制，导致假阴性的结果；3)工作量巨大:由于对每个抽检样品的每种菌都必须进行检测，工作量非常巨大，特别是部分对培养环境要求较为苛刻的菌，更加大了检测的工作量和难度。(2)免疫学检查:应用最广泛的是酶联免疫技术(ELISA): 一般先用一抗与抗原发生特异性结合，然后用通用的酶标记的二抗与一抗发生特异性结合，再将酶显色，之后观察结果。优点:1)样品通量较高:利用96孔酶标板，一块平板可完成多个样品的检测；2)较敏感:利用酶联的特性，可将原来的抗原信号放大；3)快捷:在时间上，比传统的培养基微生物培养检查法要缩短很多。但存在如下缺点:1)易出现假阳性:由于洗涤和抗原包被的操作，或由于抗原表面决定簇类似而发生交叉反应，故易出现假阳性；2)耗时耗力:制作抗体是非常耗时耗力的工作；3)灵敏度不确定:实验的灵敏度取决于抗体的好坏，而每个抗体的好坏不一，质量难以控制；4)无法检测多变异的病毒:变异性较快的病毒，如甲流病毒，存在多种亚型，并且经常变异，变异导致抗体失效，无法检测抗原。(3)分子生物学——PCR检测方法:目前经常应用的有实时荧光定量PCR、免疫PCR、反转录PCR等，都是针对病原体的特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法最为成熟。荧光定量PCR技术的优点:灵敏性高，并可精确定量，在对李氏杆菌、沙门氏菌、肉毒杆菌、大肠杆菌等的检测中都取得了良好效果。2004年，中国发布了实施荧光定量PCR检测禽流感H7亚型的国家标准。2009 年，美国FDA批准了用荧光定量PCR检测猪流感HlNl亚型的试剂盒。但也存在如下缺点:1)通量低:一次只能检测一个病原成分，如需要检测多种病原菌，就需要多台PCR仪同时工作，效率低，周期长，对大批量的多种病原污染的样品更是无从下手；2)成本相对较高:因一次只能检测一个病原体，当一个样品同时需要检测多种病原菌时，必须一个一个检测，成本相对增高。(4)分子生物学一基因芯片法:基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。优点:1)高通量并行检测:当一个样品同时需要检测多种病原菌时，一次实验即可得出全部结果；2)操作简便快速:整个检测只需4-8小时基本可以出结果；但也存在如下缺点:1)技术成本昂贵、复杂:每个样品需要一个芯片，成本大于YlOOO/样品，不利于大规模推广；2)探针的合成与固定比较复杂，特别是制作高密度的探针阵列，是主要的限速步骤；3)不能精确定量，重复性差；4)灵敏度较低:芯片法需核酸量较大，一般须先做多重PCR扩增，由于引物较多，容易自身产生二聚体，发夹结构，或由于Tm值不同，而导致扩增目的片段效率不同，进而影响检测的灵敏度；5)由于芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准。Gen0meLabTMGeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了 96孔板的排列特性，降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重PCR方法，通过Beckman Coulter染色标记,在同一个EP管中同时分析多个基因的表达,能快速有效地检测基因的表达状况，克服了上述发热伴出疹病原体的传统检测方法存在的缺陷，具有以下优点:1、高通量:本系统采用双(96孔)板、自动加样和样品追踪技术，实现单个反应检测30-40个位点，可同时做192个反应(如192个患者样品，每个样品检测30种腹泻病毒，30个位点)，一天出结果 ；对于交叉感染患者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。2、准确性强:GeXP采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；3、敏感性高，结果重复性好:GeXP系统克服了传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性，采用激光诱导荧光-PMT，具有超闻灵敏度；4、方法简便，使用经济=GeXP提供从试剂、多重PCR引物设计、结果及定量表达谱分析等全套实验方案；每个样品的检测成本少于￥50，利于大规模推广；5、精确定量、灵活性强:可精确定量病原体基因拷贝数，可随时根据需求调整检测的靶基因。6、易于实现自动化:就样品制备而言，Biomek系列自动液体处理仪可以与GeXP分析仪和Ampligrid扩增仪完全匹配，集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报
生口 ο目前，国内外还没有关于基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测十八种发热伴出疹病原体的试剂盒及其检测方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果的基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的同步检测十八种发热伴出疹病原体的试剂盒及其检测方法。本发明解决上述技 术问题所采用的技术方案为:一种同步检测十八种发热伴出疹病原体的试剂盒，包括DEPC水、5 X RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、X溶液、10 XPCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，所述的反转录引物包括以下表I中五种发热伴出疹病原体的R T扩增引物及人RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括表I中余下十三种发热伴出疹病原体的正反向PCR扩增引物、单纯疱疹病毒1，2通用型的正反向PCR扩增引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述五种发热伴出疹病原体的PCR扩增引物与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表I所示:
权利要求
1.一种同步检测十八种发热伴出疹病原体的试剂盒，包括DEPC水、5 X RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、X溶液、IOXPCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，所述的反转录引物包括以下表中五种发热伴出疹病原体的RT扩增引物及人RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR弓丨物包括表中余下十三种发热伴出疹病原体的正反向PCR扩增引物、单纯疱疹病毒1，2通用型的正反向PCR扩增引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增弓I物以及上述五种发热伴出疹病原体的PCR扩增引物与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如下表所示:
2.根据权利要求1所述的一种同步检测十八种发热伴出疹病原体的试剂盒，其特征在于:所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA ；反向扩增弓丨物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用弓I物正向扩增引物带荧光标记。
3.根据权利要求1所述的一种同步检测十八种发热伴出疹病原体的试剂盒，其特征在于:所述的阳性对照品连接有设计上述十八种发热伴出疹病原体、单纯疱疹病毒1，2通用型、RNA内参、DNA内参和反应内参的引物的基因保守序列的pMD18-T的克隆载体。
4.一种利用权利要求1-3中任一项所述的同步检测十八种发热伴出疹病原体的试剂盒的检测发热伴出疹病原体的方法，其特征在于具体包括以下步骤: (1)采集样本并提取核酸采集发热伴出疹患者的鼻咽拭子、痰液、疱疹液或血液的分离培养物，从分离培养物中提取核酸； (2)以患者核酸为模板进行RT反应 取5-20ng/ul的核酸样品RNA5 μ L，DEPC水8 μ L，5 X RT缓冲液4 μ L，RT引物溶液2 μ L，RT酶IyL混匀后加入到96孔样品板上进行反转录，反应条件:48° Cl分钟；42° C60分钟；95° C5分钟；4° C直至收取RT产物，其中反转录引物溶液中各RT引物浓度均为500nM，RT引物包括五种发热伴出疹病原体的RT扩增引物及人RNA内参的RT扩增引物，基因序列如SEQ ID N0.1 N0.6所示； (3)以反转录产物为模板进行PCR反应 取RT产物8.6 μ L，10 X PCR缓冲液2 μ L，25mM的氯化镁4 μ L，PCR引物溶液2 μ L，DNA聚合酶1.4 μ L，X溶液2 μ L混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应，反应条件:95° ClO分钟；94° C30秒钟，55° C30秒钟，70° Cl分钟，循环35次；70° Cl分钟；4° C直至收取PCR产物；其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA ;反向扩增引物序列为GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记，PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM，PCR引物包括余下十三种发热伴出疹病原体的正反向PCR扩增引物、单纯疱疹病毒1，2通用型的正反向PCR扩增引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述五种发热伴出疹病原体的PCR扩增引物与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如 SEQ ID N0.7 N0.44 所示； (4)GeXP遗传分析仪毛细电泳分离样品 取PCR产物I μ L，GeXP遗传分析仪配套的上样缓冲液38.75 μ L，DNA Marker0.5 μ L，矿物油一滴混合均匀后加入到96孔分离液板上进行毛细电泳分离样品，将GeXP遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比，判断发热伴出疹病原体的种类。
全文摘要
本发明公开了一种同步检测十八种发热伴出疹病原体的试剂盒及其检测方法，该试剂盒包括DEPC水、5×RT缓冲液、反转录引物、反转录酶、X溶液、10×PCR缓冲液、PCR引物、25mM氯化镁溶液、DNA聚合酶和阳性对照品，特点是反转录引物包括五种发热伴出疹病原体及人RNA内参的RT引物，序列如SEQ ID NO.1～NO.6所示，PCR引物包括余下十三种发热伴出疹病原体、单纯疱疹病毒1,2通用型、人DNA内参、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述五种发热伴出疹病原体与人RNA内参的PCR扩增引物，基因序列如SEQ ID NO.7～NO.44所示，优点是特异性强、灵敏度高、通量高、可靠性强、成本低、无假阴性结果。
文档编号C12R1/01GK103146841SQ20131003331
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者吴勇, 陈燕芬, 南丽, 黄迎彬 申请人:海尔施生物医药股份有限公司