专利名称：猪Kobu病毒套式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种猪Kobu病毒的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
猪Kobu病毒(porcine kobuvirus, PKV)属于小RNA病毒科,崎病毒属，最先由Reuter G等于2007年2月从匈牙利某猪场健康猪群中采集的60份粪便样品中检测到。已有研究结果表明临床上无腹泻症状的猪群中，PKV的感染率很高；PKV不只局限于肠道感染，还可以造成病毒血症。最近研究表明，PKV与猪腹泻有关，在韩国表现腹泻症状的猪群中普遍存在PKV感染。Khamrin P等于2009年从日本28个猪场的健康猪群采集了 293份粪便样品进行RT-PCR检测，PKV阳性率为45. 4%，其中124份阳性样品采集于6月龄以下猪群，9份阳性样品来自6月龄以上猪群。结果表明，日本6月龄以下健康猪群普遍存在PKV的感染。BarryAF等对巴西不同年龄段猪群(哺乳仔猪、保育猪和生产母猪)的115份粪便样品进行了 PKV感染率调查，结果阳性率为53% ;而荷兰保育猪PKV的阳性率为6. 7%。同时，对巴西不同日龄(3d、21d、36d、60d、75d、180d)的猪采集30份血清进行PKV检测，结果检出23份阳性，总阳性率达76. 7%。An DJ等发现，无论猪群临床上表现正常或表现腹泻，PKV感染在韩国具有普遍性，其中3周龄以下仔猪群感染率最高。所有研究表明，PKV感染率随着猪年龄的增加而降低。和所有的传染性疾病一样，确诊猪Kobu病毒病只能通过实验室诊断。由于猪Kobu病毒在BS-C-1、Vero, HeLa, HEL、RD细胞及乳鼠上均不能成功增殖，不能进行病毒分离，目前所有已知的检测猪Kobu病毒 的文献中基本都采用普通RT-PCR方法。因此，基于对我国猪群中PKV的流行情况还不清楚的现状，建立一种快速、灵敏、特异性强的检测方法，并使其成为掌握PKV流行病学资料的一个重要手段显得尤其必要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服目前对猪Kobu病毒的检测基本都采用普通RT-PCR方法的缺陷，而提供一种猪Kobu病毒套式RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，该方法特异性强、灵敏度高，对样品中含微量猪Kobu病毒基因组的检测效果良好，可用于猪Kobu病毒的实验室检测和分子流行病学调查。本发明提供的技术方案之一是一种用于检测猪Kobu病毒的套式RT-PCR引物，其包括如下引物(I)外向引物Pl和P2，其序列分别如序列表中SEQ ID NO.1和SEQ IDN0. 2所示；(2)内向引物P3和P4，其序列分别如序列表中SEQ ID NO. 3和SEQ IDN0. 4所示。本发明提供的技术方案之二是一种用于检测猪Kobu病毒的试剂盒，其包括如前所述的套式RT-PCR引物。
本发明中，所述的试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录(RT)试剂、猪Kobu病毒阳性对照和阴性对照中的一种或多种。本发明中，所述的RNA提取试剂可以是本领域常规的提取动物病毒总RNA的试剂，较佳地，所述的RNA提取试剂包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H2O中的一种或多种；所述的样品裂解液优选Trizol，所述的DEPC-乙醇优选质量百分数为75%的DEPC-乙醇。本发明中，所述的反转录试剂可以是本领域常规的反转录试剂，较佳地，所述的反转录试剂包括反转录缓冲液、MgCl2、dNTP、RNA酶抑制剂(RNasin)、随机引物、AMV、反转录酶和DEPC-H2O中的一种或多种；所述的反转录缓冲液优选IOX反转录缓冲液。本发明中，所述的猪Kobu病毒阳性对照优选猪Kobu病毒阳性样本的cDNA ;所述的阴性对照优选H2O,更优选DEPC-H2O15本发明中，较佳地，所述的试剂盒包括如前所述的引物、RNA提取试剂、反转录试齐U、阳性对照和阴性对照。本发明的一较佳实例为一种用于检测猪Kobu病毒的试剂盒,其包括(I) RNA提取试剂，包括样品裂解液管Trizol750 μ L ;氯仿管氯仿200 μ L ；75%乙醇管75%DEPC_乙醇800 μ L ;异丙醇管异丙醇600 μ L ；DEPC-H2O管11 μ L ;以上为适合提取I个样本的总RNA的试剂用量；所述的RNA提取试剂需要4°C保存；
(2)反转录(RT)试剂，包括RT 预混液管10X 反转录缓冲液 2μ L ；25mM MgCl24 μ L ；10mM dNTP2 μ L ；40U/μ L RNA酶抑制剂O. 5 μ L ;0· 5 μ g/ μ L的随机引物2 μ L ；25U/ μ LAMV反转录酶1. 5 μ L ;DEPC-H203 μ L ;合计15 μ L，以上为单次反应的试剂用量；所述的反转录试剂需要_20°C保存；(3 )套式PCR试剂，包括外套PCR反应液管(MIX I ):已添加过Mg2+的10 X PCR缓冲液5μ L，2. 5mM dNTPMixture4y L,5U/y L Taq酶 I μ L，20pmol/μ L如前所述的外向引物各 I μ L，ddH2035 μ L，合计47 μ L ;内套PCR反应液管(MIX II):已添加过Mg2+的10XPCR缓冲液5 μ L，2. 5mM dNTPMixture4 μ L, 5U/ μ LTaq 酶 I μ L，20pmol/ μ L 如前所述的内向引物各 I μ L, ddH2037 μ L，合计49 μ L ;以上为单次反应的试剂用量；所述的套式PCR试剂需要_20°C保存；PCR阳性对照管猪Kobu病毒阳性样本4ng/ μ L cDNA3 μ L ;和PCR 阴性对照管DEPC-H203 μ L。上述较佳实例中，所述的已添加过Mg2+的10XPCR缓冲液、2. 5mM dNTPMixture和Taq酶也可以使用本领域常规的试剂盒产品，如可以使用PremixTaq替代上述几种试剂,优选 TaKaRa 公司产品 Premix Taq Version2. O (Loading dye mix)。本发明提供的技术方案之三是一种用于检测猪Kobu病毒的方法，其是一种采用套式RT-PCR检测猪Kobu病毒的方法，其包括如下步骤(I)提取样品的总RNA ；(2 )以步骤(I)提取的总RNA为模板，经RT反应获得cDNA ；(3)以步骤(2)所得的cDNA为模板，经套式PCR反应后，检测反应产物；
其中，步骤(3)所述的套式PCR反应包括外套PCR反应，所述外套PCR反应的引物为如前所述的外向引物，所述外套PCR反应的条件为①94 95°C，3 5min，②93 94°C，35 45s，③58 60°C，3(T40s，④70 73°C，35 45s，步骤②至④共30 36个循环，⑤70 73°C，7 IOmin ；内套PCR反应,所述内套PCR反应的引物为如前所述的内向引物,所述内套PCR反应的条件为① 94 95°C，3 5min，② 93 94°C，30 40s，③ 58 60°C，30 40s，④ 72°C，30 40s，步骤②至④共25 35循环，⑤70 73°C，7 IOmin。本发明中，步骤(I)所述的提取样品的总RNA的方法为本领域常规，较佳地为采用Trizol法提取样品的总RNA。本发明中，步骤(2)所述的RT反应所使用的反转录试剂为本领域常规，较佳地为前述反转录试剂；所述的RT反应的反应条件为本领域常规。更佳地，步骤(2)所述的RT反应的反应体系为体积比为1: 5 1 3的RNA与前述反转录试剂的混合物；所述的RT反应的反应条件为所述的混合物先于15 25°C放置5 15min后，再于37 45°C，放置6(T90min。本发明中，步骤(3)所述的套式PCR反应所用的试剂较佳地为前述套式PCR试剂，即包括外套PCR反应液管(MIX I ):已添加过Mg2+的10 X PCR缓冲液5μ L，2. 5mM dNTPMixture4y L,5U/y L Taq酶 I μ L，20pmol/μ L如前所述的外向引物各 I μ L，ddH2035 μ L，合计47 μ L ;内套PCR反应液管(MIX II):已添加过Mg2+的10XPCR缓冲液5 μ L，2. 5mM dNTPMixture4 μ L, 5U/ μ LTaq 酶 I μ L，20pmol/ μ L 如前所述的内向引物各 I μ L, ddH2037 μ L，合计49 μ L ;以上为单次反应的试剂用量；所述的套式PCR试剂需要_20°C保存；PCR阳性对照管猪Kobu病毒阳性样本4ng/ μ L cDNA3 μ L ;和
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PCR 阴性对照管DEPC-H203 μ L。本发明中，步骤(3)所述的检测反应产物的操作过程为本领域常规，较佳地，所述的检测反应产物的操作过程包括对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳后紫外拍照成像，根据成像进行结果判定；当阳性对照呈扩增阳性，阴性对照呈扩增阴性时，判定检测反应成立；若检测样品在与阳性扩增带分子量大小一致的位置(即243bp)出现特异性扩增条带，则判定为检测阳性，否则判定为阴性。本发明的一较佳实例为一种用于检测猪Kobu病毒的方法，其是一种采用套式RT-PCR检测猪Kobu病毒的方法，其包括如下步骤(I)样品总RNA的提取于750 μ L Trizol裂解液中加入待测样品200 μ L，混匀，15 25 °C静置5min后，再加入200 μ L氯仿，振荡混匀，于4°C >12000r/min离心15min ;取水相上清，加入600 μ L于-20°C预冷的异丙醇，混勻后，12000r/min离心IOmin ;弃上清后，加入800 μ L75%DEPC-乙醇，12000r/min离心IOmin后弃上清并于15 25°C干燥后加入
11μ LDEPC水溶解，备用。(2) RT反应获得cDNA :取提取的总RNA5 μ L加入20 μ L的RT预混体系，先经15 25°C放置IOmin后，再于42°C放置lh，直接PCR或_20°C保存备用。(3)套式PCR获得特异性扩增产物取3 μ L RT产物，加入47 μ L外套PCR反应液管(MIX I )中；同样条件下，以I μ L外套产物加入49μ L内套PCR反应液管(MIX II)中；将猪Kobu病毒的总RNA反转录产物作为PCR阳性对照样品，DEPC-H2O作为阴性对照样品，与待检样品cDNA同时进行套式PCR操作，并做标记。其中，MIXI PCR 的扩增条件是①95°C，3min，②94°C，40s，③ 59°C，30s，④ 72°C，40s，步骤②至④共35个循环，⑤72 0C,8min ；MIX II PCR扩增的条件为①95°C，3min，
②94°C，30s，③ 59°C，30s，④ 72°C，35s,步骤②至④共 30 循环，⑤ 72°C，8min。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于本发明提供的检测猪Kobu病毒的方法具有特异性好，灵敏度高，操作简单等优点，本发明提供的试剂盒具有成本低、检测速度快、不易污染、结果易于判定等优点，适用于猪Kobu病毒感染的诊断。运用本发明方法和试剂盒对检测所得的特异扩增序列进行测序，所获得的生物信息学数据可直接用于猪Kobu病毒分子流行病学的研究。因此，本发明的检测方法和试剂盒具有很好的应用前景。
图1为本发明套式PCR的特异性试验结果，其中，M为DL2000Marker ;PKV为猪Kobu病毒；SIV为猪流感病毒；PTV为猪捷申病毒JEV为猪乙型脑炎病毒；PRV为猪伪狂犬病毒；N为阴性对照。图2为本发明套式PCR的敏感性试验电泳结果，其中，M为DL2000Marker ;1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 泳道分别为 4X 105pg、4X 104pg、4X 103pg、4X 102pg、40pg、4pg、0. 4pg、4 X 10_2pg、4X 10_3pg、4X 10_4pg。图3为套式PCR检 测电泳图，其中，M为DL2000Marker ；PKV为阳性对照；N为阴性对照；Sf S8为8份猪肠道样品套式PCR产物。
具体实施例方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实施例中所用引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。部分试剂和仪器来源如下IOX 反转录缓冲液，25mM MgCl2, IOmM dNTP,40U/y L RNasin, O. 5 μ g/μ L 的随机引物，25U/yL AMV 反转录酶均购自 Promega 公司；10XPCRBuffer (Mg2+plus), 2. 5mM dNTPMixture, 5U/ μ L Taq 酶，Premix Taq Κ Version2. O (Loading dye mix)均购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR仪、电泳槽及水平电泳仪为美国BioRad公司产品；GENE GENIUS全自动凝胶成像分析系统为英国Syngene公司产品。实施例1特异性引物的设计针对猪Kobu病毒S-1-HUN株基因(GenBank登录号为EU787450)的保守序列设计特异性引物，如下表所示，按照以下序列，合成特异性套式PCR引物。以DEPC-H20稀释引物至20pmol/L，_20°C保存备用。
权利要求
1.一种用于检测猪KobU病毒的套式RT-PCR引物，其特征在于，其包括如下引物 (1)外向引物Pl和P2，其序列分别如序列表中SEQID NO.1和SEQ ID NO. 2所示； (2)内向引物P3和P4，其序列分别如序列表中SEQID NO. 3和SEQ ID N0.4所示。
2.一种用于检测猪Kobu病毒的试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的套式RT-PCR 引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括RNA提取试剂、反转录试剂、猪Kobu病毒阳性对照和阴性对照中的一种或多种。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的RNA提取试剂包括样品裂解液、氯仿、DEPC-乙醇、异丙醇和DEPC-H2O中的一种或多种；所述的反转录试剂包括反转录缓冲液、MgCl2、dNTP、RNA酶抑制剂、随机引物、AMV、反转录酶和DEPC-H2O中的一种或多种；所述的猪Kobu病毒阳性对照为猪Kobu病毒阳性样本的cDNA ;所述的阴性对照为H20。
5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，其包括 (1)RNA提取试剂，包括 样品裂解液管、氯仿管、75%乙醇管、异丙醇管和DEPC-H2O管； (2)反转录试剂,包括 RT预混液管包括反转录缓冲液、MgCl2, dNTP、RNA酶抑制剂、随机引物、AMV反转录酶和 DEPC-H2O ； (3)套式PCR试剂，包括 外套PCR反应液管包括PCR缓冲液、dNTP Mixture,Taq酶、如权利要求1所述的外向引物和ddH20 ;内套PCR反应液管包括PCR缓冲液、dNTP Mixture、Taq酶、如权利要求1所述的内向引物和ddH20 ； PCR阳性对照管猪Kobu病毒阳性样本cDNA ;和 PCR阴性对照管DEPC-H2O15
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的套式PCR试剂包括外套PCR反应液管:包括已添加过 Mg2+ 的 IOXPCR 缓冲液 5 μ L，2. 5mMdNTP Mixture4 μ L, 5U/ μ L Taq 酶Iμ L，20pmol/ μ L如权利要求1所述的外向引物各I μ L，ddH2035 μ L，合计47 μ L ;内套PCR反应液管包括已添加过Mg2+的IOXPCR缓冲液5 μ L，2. 5mM dNTP Mixture4 μ L, 5U/μ LTaq酶I μ L，20pmol/ μ L如权利要求1所述的内向引物各I μ L, ddH2037 μ L，合计49 μ L ; PCR阳性对照管猪Kobu病毒阳性样本4ng/ μ L cDNA3 μ L ;和 PCR 阴性对照管=DEPC-H2O 3 μ L。
7.一种用于检测猪Kobu病毒的方法，其特征在于，其是一种采用套式RT-PCR检测猪Kobu病毒的方法，其包括如下步骤 (1)提取样品的总RNA； (2)以步骤(I)提取的总RNA为模板，经RT反应获得cDNA； (3)以步骤(2)所得的cDNA为模板，经套式PCR反应后，检测反应产物； 其中，步骤(3)所述的套式PCR反应包括 外套PCR反应，所述外套PCR反应的引物为如权利要求1所述的外向引物，所述外套PCR反应的条件为①94 95°C，3 5min，②93 94 °C，35 45s，③58 60。。，30 40s，④70 73°C，35 45s，步骤②至④共30 36个循环，⑤70 73°C，7 IOmin ；内套PCR反应，所述内套PCR反应的引物为如权利要求1所述的内向引物，所述内套PCR 反应的条件为 ① 94 95°C，3 5min，② 93 94°C，30 40s，③ 58 60°C，3(T40s，④ 72°C，30 40s，步骤②至④共25 35循环，⑤70 73°C，7 lOmin。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述的提取样品的总RNA的方法为采用Trizol法提取样品的总RNA。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的套式PCR反应所用的试剂为如权利要求6所述的套式PCR试剂。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测反应产物的操作过程包括对反应产物进行琼脂糖凝胶电泳后紫外拍照成像，根据成像进行结果判定。
全文摘要
本发明公开了一用于检测猪Kobu病毒的套式RT-PCR引物、一包含该引物的试剂盒及其检测方法。该套式RT-PCR引物包括(1)外向引物P1和P2，其序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；(2)内向引物P3和P4，其序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。该检测方法包括步骤(1)提取样品的总RNA；(2)以(1)提取的总RNA为模板经RT获得cDNA；(3)以该cDNA为模板经套式PCR反应后检测。本发明的检测方法特异性好，灵敏度高，操作简单；该试剂盒成本低、检测速度快、不易污染、结果易于判定，适用于猪Kobu病毒感染的诊断，具有很好的应用前景。
文档编号C12N15/11GK103060477SQ201310034430
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者杨德全, 刘佩红, 周锦萍, 葛菲菲, 鞠厚斌, 刘健, 王建, 张维谊, 邓波, 葛杰 申请人:上海市动物疫病预防控制中心