专利名称：邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱法测定那曲肝素钙的溶液浓度的制作方法
技术领域：
本发明属于那曲肝素钙药物的生产领域，特别是涉及一种应用邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱法快速定量测定那曲肝素钙溶液浓度的方法。
背景技术：
肝素(Heparin)是由D-葡糖胺、L-艾杜糖醛酸、N-乙酰葡糖胺及葡糖醛酸交替组成的粘多糖硫酸酯，分子量从5至30kDa，其中硫酸根约占40%。通常，肝素类药物最初来源于猪、牛肠粘膜和肺脏。在当今医学上，肝素主要作为抗凝血剂，于1953年正式应用于临床治疗，被认为是最有效和临床用量最大的抗凝血药物。最初使用的是普通肝素，即Unfractionated Heparin。到了上世纪末，通过化学裂解或者生物酶解等方法,将普通肝素制备成了平均分子量分布为3500飞500的肝素衍生物，即低分子肝素(Low MolecularWeight Heparin)，其药效明显得到了增强，成为被广泛应用的新型肝素类药物。据统计，目前全球约有三分之一的肝素原料药用于制成标准肝素钠制剂，其余约三分之二作为原料用于生产低分子肝素钙(低分子肝素钠)原料药。进一步的数据表明，在2008年，全球肝素原料药销售额约为8亿美元，同时全球肝素类药物销售额则接近60亿美元；预计2012年，全球肝素类药物的销售额将超过90亿美元。低分子肝素类药物的通用生产流程图如图1所
/Jn ο其中，那曲肝素I丐(Nadroparin Calcium)是采用亚硝酸裂解法制备得到的低分子肝素药物，其主要特征包括:平均分子量范围为3600-5000Da;分子结构的还原末端为6-0-硫酸-2，5-脱水-D-甘露醇，非还原末端为2-0-硫酸-a -L-艾杜糖醛酸；抗Xa效价为95 130IU/mg，AXa/A II a数值为2.5 4.0。本公司生产的那曲肝素钙药物达到相应的质量指标，其简单的生产工艺流程如图2所示。在实际生产过程中，需要进行超滤、醇沉和干燥等工艺，我们发现了在超滤工艺以后得到的那曲肝素钙溶液，需要进行迅速的准确的浓度检测，并依据所得测试结果对其进行适当的浓度调控，这样十分有利于后续工艺的控制，尤其是醇沉工艺。但是在实际的生产过程中，超滤工艺以后得到的那曲肝素钙溶液很难借助溶液称重法或者高效液相色谱法等分析方法，快速地完成这个检测任务。另一方面，目前国内外肝素类药物的最初来源主要都是猪小肠粘膜等动物原料，存在地域性差异，在氮含量、硫含量以及糖基序列等方面具有较大的变化范围。同时，那曲肝素钙药物其实也只是一个规定了分子量范围、并具有其它主要性质的高分子混合物，因此针对那曲肝素钙的检测方法必需具备较强的抗干扰能力，否则在实际样品的检测过程中，会产生较大的分析误差，所得测试结果将不能应用于工艺中控和指导后续工艺。
发明内容
本发明的目的在于针对现有那曲肝素钙实际生产中的上述不足，提供一种邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱法测定那曲肝素钙的溶液浓度。为了达到上述目的，本发明采用了如下技术方案:
邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱法测定那曲肝素钙的溶液浓度，在缓冲溶液的环境下，通过测定Zn2+离子、邻菲罗啉和那曲肝素钙三者混合溶液的紫外吸光度来定量测定那曲肝素钙的浓度。具体地，在缓冲溶液的环境下，将Zn2+离子溶液、邻菲罗啉溶液和那曲肝素钙溶液混合，混合溶液中Zn2+离子的浓度范围在0.05、.3mM,邻菲罗啉的物质的量是Zn2+离子的物质的量的2倍以上，测定混合溶液的紫外吸光度；建立标准工作曲线时，加入混合溶液的为已知浓度的那曲肝素钙溶液，那曲肝素隹丐的质量相对于Zn2+离子的物质的量为11.84g/mmol 163.3g/mmol ；建立标准工作曲线后，加入混合溶液的为未知浓度的那曲肝素钙溶液，根据测定的吸光度及建立的标准工作曲线计算得出那曲肝素钙溶液的浓度，当加入的那曲肝素钙的质量相对于Zn2+离子的物质的量不在11.84g/mmol 163.3g/mmol的范围时,在不改变加入体积的情况下通过浓缩或稀释的方法改变加入混合溶液中那曲肝素钙溶液的浓度，测定其吸光度并利用标准工作曲线计算得出那曲肝素钙溶液的浓度，使那曲肝素钙的质量相对于Zn2+离子的物质的量在11.84g/mmol 163.3g/mmol的范围； 需要指出的是，那曲肝素钙的浓度是指那曲肝素钙的质量体积百分比。具体地，混合溶液的溶剂是水、乙醇、甲醇、异丙醇、正丙醇和正丁醇中的至少一种。具体地，缓冲溶液包括乙酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠和硫酸氢钠中的至少一种物质的水溶液。优选地，缓冲溶液为乙酸钠溶液，乙酸钠在混合溶液中的浓度为0.05、.6M。优选地，乙酸钠在混合溶液中的浓度为0.3M。具体地，Zn2+离子来自硫酸锌，Zn2+离子的浓度为0.2mM。优选地，邻菲罗啉的物质的量是Zn2+离子的物质的量的4倍。优选地，测定混合溶液的吸光度时紫外波长为302± lnm。优选地，配制混合溶液时，硫酸锌水溶液为1.0mL,2.0mM,邻菲罗啉的乙醇溶液为1.0mL,8.0mM,乙酸钠水溶液为3.0mL, 1.0M,充分混合后，加入2.0mL那曲肝素钙溶液和
3.0mL注射用水，充分混合并静置后，测定混合溶液在302 ± Inm的吸光度。本发明公开了邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱法测定那曲肝素钙的溶液浓度，该测定方法应用邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱测试体系，实现了对那曲肝素钙溶液浓度的快速定量检测，其分析方法的线性范围为1.184% 16.33% ;同时，该方法对钙离子、钠离子和硫酸根离子有很好的抗干扰能力，可以应用于那曲肝素钙药物的实际生产过程中，对中间产品溶液或者成品溶液进行浓度检测。
图1为低分子肝素类药物通用生产流程图；图2为那曲肝素钙药物的生产工艺流程图；图3为不同批次那曲肝素钙样品在邻菲罗啉-硫酸锌溶液中的紫外光谱检测图；图4为不同浓度钙离子对检测溶液的影响检测图；图5为不同乙酸钠溶液用量对检测溶液的影响检测图6为不同邻菲罗啉溶液用量对检测溶液的影响检测图；图7为不同亚硝酸钠溶液用量对检测溶液的影响检测图；图8为不同浓度那曲肝素钙样品在邻菲罗啉-硫酸锌溶液中的检测图。
具体实施例方式下面将结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步清楚、完整地说明。首先需要说明的是，本发明中生产工艺源头所用的肝素钠样品来自河北常山生化药业股份有限公司；那曲肝素钙样品，来自深圳赛保尔生物药业有限公司。同时，本发明中所使用的主要化学试剂包括:无水乙酸钠(CH3COONa,分析纯，CAS127-09-3);邻菲罗啉(C12H8N2.H2O,分析纯，CAS5144-89-8使用时，配制成乙醇溶液)；七水硫酸锌(ZnSO4.7H20，分析纯，CAS7446-20-0);氯化钙(CaCl2，药用级，CAS10043-52-4)。实施例中那曲肝素钙溶液的浓度是指那曲肝素钙的质量体积百分比。实施例实施例公开了邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱法测定那曲肝素钙的溶液浓度，首先通过实验一至实验五依次检验邻菲罗啉-硫酸锌体系的适用性、对钙离子的抗干扰性、乙酸钠溶液用量的影响、邻菲罗啉用量的影响和亚硝酸钠溶液用量的影响，以说明该检测体系的适用性、可变化范围及检测原理；而后通过实验六建立吸光度与那曲肝素钙溶液浓度的标准工作曲线，实验七通过实验验证该方法及该标准工作曲线的可靠性。实验一、邻菲罗啉-硫酸锌体系的适用性取6支15mL离心管，其中5支为样品测试体系，I支为空白对照体系(不加那曲肝素钙样品)。首先，往所有离心管中，分别加入1.0mL2.0mM硫酸锌溶液、1.0mL8.0mM邻菲罗啉溶液和3.0mLl.0M乙酸钠溶液，充分混合。接着,往样品测试体系中，分别加入2.0mL不同批号的那曲肝素钙样品溶液，以及3.0mL注射用水，摇匀；往空白对照体系中，加入5.0mL注射用水，充分混合。静置15分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在20(T400nm范围内，分别扫描5个样品测试体系的紫外光谱。所得测试结果如图3所示。从图3可以发现，在邻菲罗啉-硫酸锌体系中，5个不同批次的那曲肝素钙样品溶液，在302± Inm处都具有明显的最大紫外吸收峰。这表明，邻菲罗啉-硫酸锌体系对于不同批次那曲肝素钙样品溶液的紫外光谱检测，有很好的系统适用性。实验二、邻菲罗啉-硫酸锌体系对钙离子的抗干扰性取7支15mL离心管，其中6支为样品测试体系，I支为空白对照体系(不加那曲肝素钙样品)。首先，往所有离心管中，分别加入1.0mL2.0mM硫酸锌溶液、1.0mL8.0mM邻菲罗啉溶液和3.0mLl.0M乙酸钠溶液，充分混合.接着,往6支样品测试体系中，全部加入
2.00mL10%那曲肝素钙样品溶液，摇匀。然后，往6支样品测试体系中，分别加入0.00,0.05、0.10,0.15,0.20,0.25mL 的 5.0M 氯化钙溶液，以及 3.00,2.95,2.90,2.85,2.80,2.75mL 的注射用水；往空白对照体系中，加入5.0mL注射用水，充分混合。静置15分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在20(T400nm范围内，分别扫描6个样品测试体系的紫外光谱。所得测试结果如图4所示。从图4可以发现，浓度范围为2.5%-12.5%的外加钙离子，对邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱体系的测试结果没有明显的影响。这表明，邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱体系，对那曲肝素钙样品测试溶液中的钙离子浓度有很强的抗干扰作用。实验三、乙酸钠溶液用量对邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱测试体系的影响取7支15mL离心管，其中6支为样品测试体系，I支为空白对照体系(不加那曲肝素钙样品)。首先，往所有离心管中，分别加入1.0mL2.0mM硫酸锌溶液和1.0mL8.0mM邻菲罗啉溶液，充分混合。接着，往6支样品测试体系中，全部加入2.00mL10%那曲肝素钙样品溶液，摇匀。然后，往6支样品测试体系中，分别加入1.0、1.5,2.0,3.0,3.5,4.0mL的1.0M乙酸钠溶液，以及5.0,4.5,4.0,3.0,2.5,2.0mL的注射用水；往空白对照体系中，加入3.0mL乙酸钠溶液和5.0mL注射用水，充分混合。静置15分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在20(T400nm范围内，分别扫描6个样品测试体系的紫外光谱。所得测试结果如图5所示。从图5可以发现，不同的乙酸钠溶液用量，对邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱体系的测试结果，只会产生比较轻微的改变。这表明，乙酸钠溶液用量对邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱测试体系的影响很小。不过，为了增强邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱体系，对测试样品溶液酸度和盐含量的抗干扰性，在试验方案中，保持乙酸钠溶液的添加量为3.0mL。实验四、邻菲罗啉溶液用量对邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱测试体系的影响取7支15mL离心管，其中6支为样品测试体系，I支为空白对照体系(不加那曲肝素钙样品)。首先，往所有离心管中，分别加入1.0mL2.0mM硫酸锌溶液和3.0mL乙酸钠溶液，充分混合。接着，往6支样品测试体系中，全部加入2.00mL10%那曲肝素钙样品溶液，摇匀。然后，往1-6号样品测试体系中，分别加入0、0.5,0.8、1.0、1.2、1.5mL的8.0mM邻菲罗啉溶液，以及4.0,3.5,3.2,3.0,2.8,2.5mL的注射用水；往空白对照体系中，加入1.0mL8.0mM邻菲罗啉溶液和5.0mL注射用水，充分混合。静置15分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在20(T400nm范围内，分别扫描6个样品测试体系的紫外光谱。所得结果如图6所示。从图6可以发现，不同的邻菲罗啉溶液用量，对邻菲罗啉-硫酸锌紫外测试体系有非常显著的影响。当邻菲罗啉溶液的用量小于空白对照体系中的邻菲罗啉溶液用量时，所得紫外光谱落在吸光度的负区；而当邻菲罗啉溶液的用量等于或大于空白对照体系中的邻菲罗啉溶液用量时，所得紫外光谱的吸光度在正区，且成倍数增加。这说明了，那曲肝素钙测试样品在302nm处的最大紫外吸收峰，来源于邻菲罗啉与那曲肝素钙分子、锌离子的同时结合，而不只是锌离子与那曲肝素钙分子的结合.
实验五、亚硝酸钠溶液用量对邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱测试体系的影响取7支15mL离心管，其中6支为样品测试体系，I支为空白对照体系(不加那曲肝素钙样品)。首先，往所有离心管中，分别加入1.0mL2.0mM硫酸锌溶液、1.0mL8.0mM邻菲罗啉溶液和3.0mLl.0M乙酸钠溶液，充分混合。接着,往6支样品测试体系中，全部加入2.00mL10%那曲肝素钙样品溶液，摇匀。然后，往1-6号样品测试体系中，分别加入0.00、
0.05,0.10,0.15,0.20,0.25mL 的 2.0M 亚硝酸钠溶液，以及 3.00,2.95,2.90,2.85,2.80、
2.75mL的注射用水；往空白对照体系中，加入5.0mL注射用水，充分混合.静置15分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在20(T400nm范围内，分别扫描6个样品测试体系的紫外光谱。所得测试结果如图7所示.
从图7可以发现，随着亚硝酸钠溶液用量的增加，所得紫外光谱在302nm处的最大吸收峰逐渐消失，同时在354nm处出现一个新的最大吸收峰。这说明了，亚硝酸钠溶液对邻菲罗啉-硫酸锌紫外测试体系的影响很大，可以令其最大吸收峰产生显著的红移现象。根据那曲肝素钙的化学结构特征，其原因很可能是在测试体系中，外加的大量亚硝酸根离子具有氧化作用，将那曲肝素钙分子中的羟基转变为醛基或者羧基，从而增大了显色基团的共轭效应，进而令其最大紫外吸收峰产生了红移现象。同时，这也说明了，那曲肝素钙分子中的羟基参与了整个显色体系的形成。通过上述实验一至实验五，可以证明邻菲罗啉-硫酸锌体系可以被用作测定那曲肝素钙溶液的浓度。下面的两组实验将首先建立邻菲罗啉-硫酸锌体系紫外光谱测定那曲肝素钙溶液浓度的标准工作曲线，然后通过实验来证实该工作曲线的可靠性。实验六、邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱测试体系对那曲肝素钙的标准工作曲线取7支15mL离心管，其中6支为样品测试体系，I支为空白对照体系(不加那曲肝素钙样品)。首先，往所有离心管中，分别加入1.0mL2.0mM硫酸锌溶液、1.0mL8.0mM邻菲罗啉溶液和3.0mLl.0M乙酸钠溶液，充分混合(在其它实施例中Zn2+离子的浓度范围，在加入那曲肝素钙和注射用水后的整个混合体系中，为0.05、.3mM ;在其它实施例中，邻菲罗啉的物质的量是Zn2+离子的物质的量的2倍以上)。接着，往样品测试体系中，分别加入2.0mL不同浓度的那曲肝素钙样品溶液，浓度依次5.69%,7.86%,9.61%、11.84%、14.14%、16.33%，以及3.0mL注射用水，摇匀；往空白对照体系中，加入5.0mL注射用水，充分混合。静置15分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在20(T400nm范围内，分别扫描6个样品测试体系的紫外光谱。所得测试结果如图8所示，图8中从下到上所示曲线的加入的那曲肝素钙溶液的浓度依次为:5.69%,7.86%,9.61%、11.84%、14.14% 和 16.33%。从图8可以发现，邻菲罗啉-硫酸锌紫外测试体系对那曲肝素钙样品，在浓度范围5.699Γ16.33%之内，呈现良好的线性关系，即那曲肝素钙的质量相对于Zn2+离子的物质的量在56.9g/mmofl63.3g/mmol的范围时,可以准确地进行定量检测，计算得到的标准工作曲线方程为:y=2.6362x+0.0644，R2=0.9987，其中y代表302nm处的吸光度，x代表加入的那曲肝素钙的浓度。依照该方法进一步的研究结果表明，邻菲罗啉-硫酸锌紫外测试体系对那曲肝素钙样品浓度总的线性范围为:1.1849Γ16.33%，即当那曲肝素钙的质量相对于Zn2+离子的物质的量在11.84g/mmofl63.3g/mmol的范围时,适用于生产过程中那曲肝素钙实际样品的检测。实验七、邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱测试体系对那曲肝素钙实际样品的检测在实验六的基础上，另取3支15mL离心管，作为实际样品测试体系，即重复测试三次，然后取平均值。首先，往所有离心管中，分别加入1.0mL2.0mM硫酸锌溶液、1.0mL8.0mM邻菲罗啉溶液和3.0mLl.0M乙酸钠溶液，充分混合。接着，往实际样品测试体系中，分别加入2.0mL在实际生产过程中产生的经过2倍稀释的那曲肝素钙溶液(如图2所示，这里的实际产品为超滤工艺与醇沉工艺之间的中间产品溶液)，以及3.0mL注射用水，摇匀。静置15分钟后，以空白对照体系作为空白对照溶液，在20(T400nm范围内，扫描其紫外光谱，记录302nm处的吸光度。将所得吸光度值代入在实验六中的标准工作曲线方程，计算其浓度，测试结果列于表I。表I邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱 测试体系对那曲肝素钙实际样品的检测
权利要求
1.邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱法测定那曲肝素钙的溶液浓度，其特征在于:在缓冲溶液的环境下，通过测定Zn2+离子、邻菲罗啉和那曲肝素钙三者混合溶液的紫外吸光度来定量测定那曲肝素钙的浓度。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于:在缓冲溶液的环境下，将Zn2+离子溶液、邻菲罗啉溶液和那曲肝素钙溶液混合，混合溶液中所述Zn2+离子的浓度范围在.0.05、.3mM，所述邻菲罗啉的物质的量是Zn2+离子的物质的量的2倍以上，测定所述混合溶液的紫外吸光度； 建立标准工作曲线时，加入混合溶液的为已知浓度的那曲肝素钙溶液，且所述那曲肝素隹丐的质量相对于所述Zn2+离子的物质的量为11.84g/mmofl63.3g/mmol ； 建立标准工作曲线后，加入混合溶液的为未知浓度的那曲肝素钙溶液，根据测定的吸光度及建立的标准工作曲线计算得出所述那曲肝素钙溶液的浓度，当加入的那曲肝素钙的质量相对于所述Zn2+离子的物质的量不在11.84g/mmofl63.3g/mmol的范围时,在不改变加入体积的情况下通过浓缩或稀释的方法改变加入混合溶液中那曲肝素钙溶液的浓度，测定其吸光度并利用标准工作曲线计算得出所述那曲肝素钙溶液的浓度，使那曲肝素钙的质量相对于所述Zn2+离子的物质的量在11.84g/mmol 163.3g/mmol的范围； 所述那曲肝素钙的浓度是指那曲肝素钙的质量体积百分比。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于:所述混合溶液的溶剂是水、乙醇、甲醇、异丙醇、正丙醇和正丁醇中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于:所述缓冲溶液包括乙酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠和硫酸氢钠中的至少一种物质的水溶液。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于:所述缓冲溶液为乙酸钠溶液，乙酸钠在所述混合溶液中的浓度为0.05、.6M。
6.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于:所述乙酸钠在所述混合溶液中的浓度为0.3M。
7.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于:所述Zn2+离子来自硫酸锌，所述Zn2+离子的浓度为0.2mM。
8.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于:所述邻菲罗啉的物质的量是所述Zn2+离子的物质的量的4倍。
9.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于:测定所述混合溶液的吸光度时紫外波长为302±lnm。
10.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于:配制混合溶液时，所述硫酸锌水溶液为1.0mL,2.0mM，所述邻菲罗啉的乙醇溶液为1.0mL,8.0mM，所述乙酸钠水溶液为3.0mL,.1.0M，充分混合后，加入2.0mL那曲肝素钙溶液和3.0mL注射用水，充分混合并静置后，测定所述混合溶液在302 ± Inm的吸光度。
全文摘要
本发明公开了邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱法测定那曲肝素钙的溶液浓度。在缓冲溶液的环境下，通过测定Zn2+离子、邻菲罗啉和那曲肝素钙三者混合溶液的紫外吸光度来定量测定那曲肝素钙的浓度。该方法应用邻菲罗啉-硫酸锌紫外光谱测试体系，实现了对那曲肝素钙溶液浓度的快速定量检测，其分析方法的线性范围为1.184%～16.33%；同时，该方法对钙离子、钠离子和硫酸根离子有很好的抗干扰能力，可以应用于那曲肝素钙药物的实际生产过程中，对中间产品溶液或者成品溶液进行浓度检测。
文档编号G01N21/33GK103149170SQ201310036199
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者陈贤光, 郑华淦, 张涤平, 吴园园, 曲和之, 盛光阳 申请人:深圳赛保尔生物药业有限公司