专利名称：一种秸秆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法
技术领域：
本发明属于农业(微生物)技术领域，具体涉及一种作物秸杆低温降解复合菌系的筛选和驯化技术。
背景技术：
作物秸杆是丰富的自然资源，我国是农业大国，每年产秸杆6亿吨以上，其中只有一小部分被利用。秸杆原位还田是提升土壤有机质、合理利用资源、解决环境污染的有效手段，但秸杆进入土壤后，腐解缓慢，对耕作与农艺操作产生诸多不利影响，限制了其推广。特别是在我国北方，由于冬季时间长，气温偏低，作物秸杆降解慢、腐解效果差已成为限制秸杆还田利用的瓶颈。利用微生物技术处理秸杆是提高秸杆利用率的有效途径，前人有大量的研究，并筛选驯化出在28-50°C下降解秸杆的单菌株，而在低温(20 15°C)条件下具有高效降解能力的菌系还未见报道。通过建立规范而有效的筛选和驯化秸杆低温降解菌系的方法，为筛选出低温条件下具有较高降解效率的作物秸杆降解菌系提供技术支撑，促进秸杆的快速腐解，对于促进我国北方地区秸杆资源充分利用、农田地力培肥和农业可持续发展具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种作物秸杆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法，特别是针对我国北方地区播种面积最大的作物——玉米，筛选其秸杆降解菌系对促进北方地区秸杆资源的还田利用意义重大。为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案:一种秸杆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法，包括以下步骤:I)富集培养:采集年平均气温在-0.6°C 8°C的高寒地区的富含纤维素的自然物样品，对样品进行纤维素降解菌系的富集培养，获得富集培养物；2)初筛:将富集培养物接种到滤纸条培养基中，以28°C为初始培养温度，培养多代后选择滤纸崩溃时间短、溃烂程度高，PH接近中性(pH6.5 7.5)的培养物，按每转接一次培养温度降低1-2°C的梯度进行继代培养,至培养温度降低至15°C 20°C的某一温度时，在该温度下连续继代培养，至每代滤纸条断裂时间一致时停止继代培养，挑选出纤维素降解能力保持较好的菌系；3)复筛:对初筛菌系进行CMC酶相对活性和纤维素酶活的检测，选出酶活性高的复合菌系；4)驯化:将复筛得到的复合菌系在15°C 20°C的某一温度下，以秸杆和滤纸分别为唯一碳源进行交替继代培养，转接培养到多代次以后，选择秸杆分解能力强，培养物PH近中性(pH6.5 7.5)的菌系，为低温降解菌系。上述方法中，步骤1)可采用滤纸平铺法、滤纸崩解法、天然作物秸杆粉摇床培养等方法富集培养，选择滤纸溃烂程度高、滤纸断裂时间短、降解秸杆效果好的样品。
步骤1)中所述富含纤维素的自然物样品包括但不限于:年平均气温在-0.6°c 8°C的高寒地区的腐烂秸杆、腐烂落叶、朽木、烂草、动物粪便、堆肥、锯末、食用菌栽培下脚料、麦田土、树林土、多年秸杆还田土壤、菜园土、草原土等材料。优选的，上述步骤2)从初始培养温度28°C开始，培养4代，选择滤纸崩溃时间短、溃烂程度高、PH接近中性(pH6.5 7.5)的培养物继续传代，每传一代降低1_2°C的梯度进行培养，直至培养温度降低至15 20°C的某一温度，在该温度条件下连续培养，直至每代滤纸条断裂时间一致时停止继代培养。上述步骤3)将初筛的菌系接到纤维素刚果红培养基上，在15 20°C的某一温度下培养，通过刚果红水解圈和菌落大小计算CMC酶相对活性，同时在该温度下将初筛菌系于液体发酵培养基中培养后并检测过滤液的纤维素酶活，选出酶活性高的复合菌系。其中所述纤维素酶活包括Cx酶活、FPA酶活和Cl酶活，综合CMC酶相对活性、Cx酶活、FPA酶活和Cl酶活四项指标。上述步骤4)是进行多代限制性碳源继代培养驯化，将复筛得到的菌系以秸杆和滤纸分别为唯一碳源进行交替培养驯化，培养温度优选为15°C，转接培养到4 6代以后，选择分解能力强，PH近中性(pH6.5 7.5)的菌系。本发明中所述作物秸杆尤其指玉米秸杆，培养基中作为碳源的玉米秸杆通过下述方法得到:将成熟收获后的玉米秸杆晾干后剪成小块，再烘干，灭菌备用。本发明的优点及有益效果是:本发明针对北方地区冬季时间长，气温偏低，作物秸杆降解慢、腐解效果差这些限制因素，从年平均气温-0.6°C -8°c的高寒地区富含纤维素的锯末、烂草、羊粪、草原土等作为菌源采集菌种，通过限制性继代培养和低温梯度诱导驯化方法，高效构建低温玉米秸杆降解复合菌系。筛选出的低温秸杆降解菌系能够在低温(15°C )条件下高效降解玉米秸杆。需要说明的是，本发明方法并不是针对某种特定微生物的筛选方法，而是筛选和驯化能够在低温下降解秸杆的复合菌系。在高寒地区富含纤维素的自然物中普遍存在纤维素降解菌，本领域技术人员通过本发明的方法能够筛选和驯化出合适的复合菌系，以用于天然作物秸杆的微生物降解处理。
图1显示了实施例1的驯化系在液体发酵情况下的玉米秸杆降解率。图2A显示了将实施例1得到的菌系接种到秸杆上，15°C条件下培养3-4d的各菌系生长情况。图2B显示了将实施例1得到的菌系接种到秸杆上，15°C培养15d后各菌系降解秸杆的效果。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明做进一步详述，但实施例所叙述的技术内容是说明性的，而不是限定性的，不应依此来局限本发明的保护范围。实施例1低温降解玉米秸杆的复合菌系筛选试验于2011-2012年在内蒙古农业大学萨拉齐试验基地微生物实验室进行。1.材料及菌种来源
采集年平均气温-0.6_8°C的高寒地区的富含纤维素的锯末、烂草、腐烂秸杆、牛羊鸡鸭鸽兔粪、草甸土、森林土、木菇、多年秸杆还田土壤等100份材料。2.富集培养本试验采用滤纸平铺法、滤纸崩解法、天然玉米秸杆粉摇床富集培养。滤纸平铺法:将采集的材料混合富集静止培养，腐烂玉米秸杆、腐烂麦杆、腐烂水稻杆、腐烂落叶、朽木、牛羊兔鸡鸭鸽子粪、堆肥、腐烂纸盒、锯末、食用菌栽培下脚料、腐烂柳树木质部等16种材料各50g与5种土壤(麦田土、树林土、多年玉米秸杆还田土壤、菜园土、草原土)各500g分别混合均匀，得到16X5共80个混合样品，每个样品加入10% g/mL的硫酸铵IOOml ;取适量混合样品在灭菌的培养皿内平铺成约0.5_厚薄层，上面覆盖一层灭菌滤纸，置入28+l°C培养15d，富集培养4代。每天观察平皿内滤纸变化情况，传代时从滤纸溃烂处吸取具有明显滤纸崩解效果的培养液部分转接到相同成分新鲜培养基中富集培养。根据滤纸的溃烂程度，定性判定样品的纤维素降解能力。筛选出滤纸溃烂程度高的10份样品。滤纸崩解法:采集的样品单独富集静止培养，采集的100份材料分别取5.0g接种至IJ盛有150mL滤纸条培养基(或灭菌蒸馏水)的500mL三角瓶中，28°C恒温震荡培养30min混匀，并将上清液做KT1-KT9稀释，各取ImL稀释液接种在滤纸为唯一碳源的滤纸条培养基(奥梅梁斯基培养基)里，28°C静止富集培养4代。筛选出滤纸断裂时间短、溃烂程度高的33份材料。天然玉米秸杆粉摇床培养:称取菌种来源样品5g加入以天然玉米秸杆粉为唯一碳源的IOOmL玉米秸杆粉培养基(将奥梅梁斯基培养基中滤纸用玉米秸杆粉替代中，28°C恒温震荡培养15d吸取5mL培养液转入新的玉米秸杆粉富集培养基，富集培养4代。筛选出玉米秸杆粉降解程度高的9份材料。经过上述的富集培养后，从100份材料中共筛选出了 45份材料。3.低温降解纤维素复合菌系的初筛及驯化采用滤纸崩解法，上述富集培养物接种到滤纸条培养基中驯化低温纤维素分解菌系。初始培养温度为28°C，在该温度下继代培养4代，选择滤纸溃烂程度高的、断裂时间短，PH接近中性的培养物继续传代。每继代培养一次培养温度降低2°C，直至培养温度降低至15°C,目测生长情况，通过滤纸的断裂情况判断培养物的纤维素分解能力，边传代边挑选出降解能力保持较好的培养物，在驯化过程中，在15°C温度条件下连续培养6代，滤纸条断裂时间一致时停止低温驯化。经过初步的低温驯化，结果在15°C条件下，编号为1、4、6、8、11、12、15、16、17、20
的菌系生长良好，说明其能够在低温条件正常生长。因此选择以上10个低温降解菌系进行复筛。实验结果例于表I。
表115°C培养条件下纤维素分解菌生长情况
权利要求
1.一种秸杆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法，包括以下步骤: 1)采集年平均气温在-0.6V 8°C的高寒地区富含纤维素的自然物样品进行纤维素降解菌系的富集培养，获得富集培养物； 2)将富集培养物接种到滤纸条培养基中，以28°C为初始培养温度，培养多代后选择滤纸崩溃时间短、溃烂程度高，PH6.5 7.5的培养物，按每转接一次培养温度降低1_2°C的梯度进行继代培养，至培养温度降低至15°C 20°C的某一温度时，在该温度下连续继代培养，直至每代滤纸条断裂时间一致时停止继代培养，初筛出纤维素降解能力保持好的菌系; 3)对初筛菌系进行CMC酶相对活性和纤维素酶活的检测，选出酶活性高的复合菌系； 4)将复合菌系在15°C 20°C的某一温度下，以秸杆和滤纸分别为唯一碳源进行交替继代培养，转接培养到多代次以后，选择秸杆分解能力强、培养物PH6.5 7.5的菌系为秸杆低温降解复合菌系。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤I)采用滤纸平铺法、滤纸崩解法、天然作物秸杆粉摇床培养法中的一种或多种进行富集培养，在滤纸平铺法和滤纸崩解法中选择滤纸溃烂程度高、滤纸断裂时间短的样品，在天然作物秸杆粉摇床培养法中选择降解秸杆效果好的样品。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中所述样品选自下列材料中的多种:腐烂秸杆、腐烂落叶、朽木、烂草、动物粪便、堆肥、锯末、食用菌栽培下脚料、麦田土、树林土、多年秸杆还田土壤、菜园土、草原土。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)在初始培养温度28°C培养4代，然后再梯度降低温度进行继代培养。
5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中CMC酶相对活性的检测方法是:将初筛菌系接到纤维素刚果红培养基上，在15 20°C的某一温度下培养，通过刚果红水解圈直径/菌落直径计算CMC酶相对活性。
6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述纤维素酶活包括Cx酶活、FPA酶活和Cl酶活。
7.按权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)在15 20°C的某一温度下，以秸杆和滤纸分别为唯一碳源对复合菌系进行交替继代培养，转接培养4 6代以后选择秸杆分解能力强、培养物ρΗ6.5 7.5的菌系。
8.按权利要求1 7任一所述的方法，其特征在于，所述秸杆为玉米秸杆。
全文摘要
本发明公开了一种秸秆低温降解复合菌系的筛选和驯化方法。采集年平均气温在-0.6～8℃的高寒地区的富含纤维素的自然物样品，先进行纤维素降解菌系的富集培养，然后经过限制性继代培养初筛、低温梯度诱导驯化和纤维素酶活复筛，再进行低温多代限制性碳源继代培养驯化，得到秸秆低温降解复合菌系。通过本发明方法筛选和驯化出低温下高效降解玉米秸秆的复合菌系，对促进北方地区秸秆资源的还田利用意义重大。
文档编号C12N1/02GK103087973SQ20131004006
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者高聚林, 萨如拉, 于晓芳, 胡树平, 孙继颖, 王志刚, 苏治军, 谢岷, 闹干朝鲁, 青格尔 申请人:内蒙古农业大学