专利名称：基于分子标记技术的刀鲚林氏异钩铗虫的检测及驱除方法
技术领域：
本发明涉及一种林氏异钩铗虫的快速检测及其驱除方法，具体来说，是基于分子标记技术的刀鲚林氏异钩铗虫的检测及驱除方法，属于鱼类养殖技术领域。
背景技术：
林氏异钩铗虫(Heteromazocraes Iingmueni),是寄生在长江刀鲂觸丝上的一种优势寄生虫，其利用后吸器张开并吸铗鳃丝上鳃小片，破坏鳃丝的上皮细胞，引起其他病原菌的入侵，造成炎症，弓I发烂鳃病症。刀鲚寄生林氏异钩铗虫较多，感染率高达74%，致死率可达100%。此寄生虫的准确鉴定及采取相应的措施驱除成为了刀鲚养殖中的关键环节。以往都是采用形态判别的方法进行鉴定，而由于寄生虫形态特征的有限性，以及固定方法造成的差异，或者只有虫卵或者形态特征不可辨别的幼虫，从形态特征上鉴定可能会存在一定的失误率，最终导致错失最佳治疗时机。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，从而提供一种基于分子标记技术的刀 鲚林氏异钩铗虫的检测及驱除方法，在准确鉴定的基础上，提供一种治疗的方法，保障养殖成活率95%以上。本发明实施例是这样实现的，一种基于分子标记技术的刀鲚林氏异钩铗虫的检测及驱除方法，该方法利用普通光学显微镜与分子遗传相结合方法，对寄生刀鲚的异钩铗虫进行种属鉴定；首先，镜检显示:虫卵阶段卵两端具有较长的极丝；虫体阶段含有四对不对称的后吸器，具短柄，其中一侧的前2个开放几丁质吸铗明显大于其余6个封闭的吸铗，虫体尾部带有二对尖锐的弯钩；然后分子遗传扩增28S rRNA基因5'端部分序列，测定林氏异钩铗虫28s序列，经比对分析，即可准确鉴定此寄生虫为林氏异钩铗虫；鉴定完毕后，用lmg/L浓度的甲苯咪唑全池泼洒，72小时后，虫体可脱落、死亡；同时，还要及时换水50% -60%，排出脱落的虫卵，防止以后复发。进一步，该检测方法的具体步骤为: 采集样品宿主刀鲚，随机抽查30条刀鲚，平均体长12厘米，体重5克，在显微镜下观察鳃部寄生虫并统计其数量,部分虫体清水冲洗干净至95%的酒精保存；进行形态结构观察，肉眼观察，将带有寄生虫刀鲚取出鱼鳃并置载玻片上，解剖镜下观察并将有虫体的鳃丝挑出，放入离心管清水清洗数次后再置显微镜下观察拍照；进行分子鉴定，首先制备模板DNA，进行per扩增及扩增片段克隆，DNA序列拼接后,登录NCBI进行blast比对分析，并下载相似性较高的序列；ClustalX多序列比对后采用MEGA软件中邻接法构建了 28S rDNA分子进化树。进一步，采集样品宿主刀鲚，随机抽查30条刀鲚，平均体长12厘米，体重5克，在显微镜下观察鳃部寄生虫并统计其数量，部分虫体清水冲洗干净至95%的酒精保存。进一步，肉眼观察，将带有寄生虫刀鲚取出鱼鳃并置载玻片上，解剖镜下观察并将有虫体的鳃丝挑出，放入离心管清水清洗数次后再置Olympus0.5X显微镜下观察拍照。进一步，模板DNA的制备方法为:从-20°C的95%的酒精保存液取出取出中体，置于2ml无菌离心管中，无菌水清洗并放置4°C冰箱置换过夜；再次清洗并QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit试剂盒进行DNA的提取，最后定容置25ul无菌水中，-20°C保存。进一步，per扩增及扩增片段克隆方法为:以CDl:(GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT)和CD2- (TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT)为引物扩增林氏异钩铗虫28S序列引物；以4ul寄生虫DNA为模板，NC5和NC2为引物扩增ITS片段；反应体系为50 μ L，反应条件为95°C预变性5min ;94°C变性30s，53°C退火30s，72。。延伸60s，循环35次；同样以4ul寄生虫DNA为模板，CDl和CD2为引物扩增28S片段；反应体系为50 μ L，反应条件为95°C预变性5min ;94°C变性30s，56 °C退火30s，72°C延伸60s，循环35次；扩增产物经I %浓度琼脂糖凝胶电泳检测分析；将剩余PCR产物跑回收胶并用DNA凝胶回收试剂盒纯化，以纯化产物为模版，对28S片段大量扩增，与pMDlS-Τ载体相连进行TA克隆，筛选阳性克隆子提质粒进行测序。本发明与已有其他类似技术相比具有以下优点:1、不受季节、环境限 制，直接以DNA的形式在寄生虫的各个组织和发育时期均可检测到。2、检测技术方法简便，成本低廉；驱除方法简便易掌握。
图1是本发明实施例提供的林氏异钩铗虫PCR产物的电泳结果；Μ1: λ DNA/HindIII Marker ；M2:DL1000 ；1:林氏林氏异钩铗虫；图2是本发明实施例提供的林氏异钩铗虫及Genbank下载虫种28S rDNA序列NJ树，图中数字代表Bootstrap值；图3是本发明实施例提供的林氏异钩铗虫的光学显微镜具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图1、2、3及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明用光学显微镜和分子遗传相结合方法，对长江流域刀鲚寄生的异钩铗虫进行种属鉴定和形态学研究。形态结果显示:虫体含有四对不对称的后吸器，具短柄，其中一侧的前2个开放几丁质吸铗明显大于其余6个封闭的吸铗，虫体尾部带有二对尖锐的弯钩，卵两端具有较长的极丝。经鉴定分析，此寄生虫为林氏异钩铗虫。分子遗传扩增28S rRNA基因5'端部分序列，并采用MEGA软件中邻接法构建了 28S rDNA分子进化树。结果显示:林氏异钩铗虫与六棘异钩铗虫处在同一分支并相似度为100%，从而进一步明确了林氏异钩铗虫的分类地位，并首次测定了林氏异钩铗虫28s序列。1.材料及方法1.1样本采集样品宿主刀鲚捕自长江流域江苏靖江段，采集时间2012年9月。随机抽查30条刀鲚，平均体长，体重，在显微镜下观察鳃部寄生虫并统计其数量，部分虫体清水冲洗干净至95%的酒精保存。1.2形态结构观察肉眼观察，将带有寄生虫刀鲚取出鱼鳃并置载玻片上，解剖镜下观察并将有虫体的鳃丝挑出，放入离心管清水清洗数次后再置olympus0.5X显微镜下观察拍照。1.3分子鉴定
1.3.1模板DNA的制备从-20°C的95%的酒精保存液中取出二十条左右虫体，置于2ml无菌离心管中，无菌水清洗并放置4°C冰箱置换过夜，再次清洗并QIAGEN QIAamp DNAMini Kit试剂盒进行DNA的提取，最后定容置25ul无菌水中，-20°C保存。1.3.2pcr扩增及扩增片段克隆
以 CDl: (GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT)和 CD2- (TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT)为引物扩增林氏异钩铗虫28S序列引物，由上海杰瑞有限公司合成。以4ul寄生虫DNA为模板，NC5和NC2为引物扩增ITS片段。反应体系为50 μ L，反应条件为95°C预变性5min ;94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸60s，循环35次。同样以4ul寄生虫DNA为模板，CDl和CD2为引物扩增28S片段。反应体系为50 μ L，反应条件为95°C预变性5min ;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，循环35次。扩增产物经I %浓度琼脂糖凝胶电泳检测分析。将剩余PCR产物跑回收胶并用DNA凝胶回收试剂盒纯化，以纯化产物为模版，对28S与ITS序列片段大量扩增，PCR产物纯化后一部分直接测序，一部分连接到pMD18-T载体上进行TA克隆，筛选阳性克隆子提质粒送上海杰瑞测序。1.3.3序列分析DNA序列拼接后，登录NCBI进行blast比对分析，并下载相似性较高的序列。Clustal X多序列比对后采用MEGA软件中邻接法构建了 28S rDNA分子进化树，2.结果2.1形态描述在长江流域捕获野生刀鲚中，发现其鳃部寄生蠕虫，经形态观察鉴定，此寄生虫为林氏异钩铗虫(Heteromazocraes lingmueni)。虫体较大,近纺锥形，肉眼可见，体表角质层较厚并有细密的环纹。林氏异钩铗虫雌雄同体，具有7个睾丸，身体两侧具有发达的盲肠，卵黄腺发达，布满肠两侧。虫体前端钝圆，较窄，向后逐渐增宽。体前端具向前凸口吸盘，口吸盘正下方为一椭圆形生殖孔，咽呈长筒型。虫体腹面后端具高度分化的后吸器，后吸器与体前区分不明显。后吸器不对称，具有四对，两侧边缘各自平行排列，其中一侧2个为特大的开放几丁质吸铗，余者6个小的封闭型吸铗。虫体尾部带有二对尖锐的弯钩，其中边缘一对小钩较中间大。林氏异钩铗虫背、腹面体表均有明显的横向皱褶，皱褶中发现有结节，结节表面含有分部较均匀小孔，具有感觉和物质代谢交换的功能。此寄生虫只发现于刀鲚鳃丝上，后吸器张开并吸铗鳃丝上鳃小片，吸附后不移动，只是虫体前端向前伸缩。破坏鳃丝的上皮细胞，引起其他病原菌的入侵，造成炎症，引发烂鳃病症。九月份，刀鲚寄生林氏异钩铗虫较多，感染率高达74%，刀鲚最高时寄生7条。喜栖息于氧气充足的淡水或低盐度水环境中，在合适的温度，低盐度水域中可促使其产卵并孵化。卵两端具有较长的极丝，易于漂浮和传播。2.1分子系统学分析本发明以林氏异钩铗虫DNA为模板，PCR扩增28S rDNA5/端序列，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增基因片段大小与预期一致(如图1)。后经TA克隆测序得出，序列总长度为949bp，G+C = 53.32%。曹姗妹在南海鱼类钩铗虫科单殖吸虫研究中测定了六棘异钩铗虫28s序列，总长度890bp，G+C = 53.03%，寄生于七丝鲚鳃丝上。从28s分子进化树可以看出参与比对16种单殖吸虫在整体上被分成了两支，林氏异钩铗虫与六棘异钩铗虫处在同一分支并Bootstrap值100 (如图2),同时两者之间Kimura2_parameter distance距离为0.002,并与其他微杯虫科、鲅铗虫科等虫体遗传距离较大，结果显示:林氏异钩铗虫与六棘异钩铗虫亲缘关系最近 ，进一步明确了林氏异钩铗虫的分类地位。钩铗虫科具有11个属，根据检索表中异钩铗虫属吸器一侧的前2个吸铗特别大，本发明虫体含有四对不对称的后吸器，具短柄，其中一侧的前2个开放几丁质吸铗明显大于其余6个封闭的吸铗，虫体尾部带有二对尖锐的弯钩，符合异钩铗虫属的特征。卵两端具有较长的极丝，与六棘异钩铗虫无极丝的谷壳状卵不同。本实验通过测定28S rRNA，序列比对分析得出:林氏异钩铗虫与六棘异钩铗虫亲缘关系最近，相似度为100%，进一步明确了林氏异钩铗虫的分类地位。目前，ITS序列也是寄生虫系统与进化研究中重要的分子标记，进化速率较快，长度较为保守。3.本发明检测效果的证明有人对江海洄游型、淡水洄游型和淡水定居型刀鲚中寄生蠕虫的群落结构进行了系统研究，在刀鲚的鳃和消化道上发现了 10种寄生蠕虫，其中在三种生态型刀鲚中都有发现林氏异钩铗虫，洄游型安庆段感染率高达78%，和本发明靖江段发现的林氏异钩铗虫感染率74%相似，有人研究了刀鲚洄游路径中寄生虫季节变化规律，得出崇明岛区林氏异钩铗虫平均感染率为42.82 %，十二月份感染率也高达百分之七十多，本实验长江刀鱼采自九月份靖江段，向崇明岛区海口迁移的洄游类群，与实验结果相吻合。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种基于分子标记技术的刀鲚林氏异钩铗虫的检测及驱除方法，其特征在于，该方法利用普通光学显微镜与分子遗传相结合方法，对寄生刀鲚的异钩铗虫进行种属鉴定； 首先，镜检显示:虫卵阶段卵两端具有较长的极丝； 虫体阶段含有四对不对称的后吸器，具短柄，其中一侧的前2个开放几丁质吸铗明显大于其余6个封闭的吸铗，虫体尾部带有二对尖锐的弯钩； 然后分子遗传扩增28S rRNA基因5'端部分序列，测定林氏异钩铗虫28s序列，经比对分析，即可准确鉴定此寄生虫为林氏异钩铗虫； 鉴定完毕后，用lmg/L浓度的甲苯咪唑全池泼洒，72小时后，虫体可脱落、死亡；同时，还要及时换水50% -60%，排出脱落的虫卵，防止以后复发。
2.如权利要求1所述的基于分子标记技术的刀鲚林氏异钩铗虫的检测及驱除方法，其特征在于，该检测方法的具体步骤为: 采集样品宿主刀鲚，随机抽查30条刀鲚，平均体长12厘米，体重5克，在显微镜下观察鳃部寄生虫并统计其数量,部分虫体清水冲洗干净至95%的酒精保存； 进行形态结构观察，肉眼观察，将带有寄生虫刀鲚取出鱼鳃并置载玻片上，解剖镜下观察并将有虫体的鳃丝挑出，放入离心管清水清洗数次后再置显微镜下观察拍照； 进行分子鉴定，首先制备模板DNA，进行per扩增及扩增片段克隆，DNA序列拼接后，登录NCBI进行blast比对分析，并下载相似性较高的序列；ClustalX多序列比对后采用MEGA软件中邻接法构建了 28S rDNA分子进化树。
3.如权利要求2所述的基于分子标记技术的刀鲚林氏异钩铗虫的检测及驱除方法，其特征在于，采集样品宿 主刀鲚，随机抽查30条刀鲚，平均体长12厘米，体重5克，在显微镜下观察鳃部寄生虫并统计其数量,部分虫体清水冲洗干净至95%的酒精保存。
4.如权利要求2所述的基于分子标记技术的刀鲚林氏异钩铗虫的检测及驱除方法，其特征在于，肉眼观察，将带有寄生虫刀鲚取出鱼鳃并置载玻片上，解剖镜下观察并将有虫体的鳃丝挑出，放入离心管清水清洗数次后再置Olympus0.5X显微镜下观察拍照。
5.如权利要求2所述的基于分子标记技术的刀鲚林氏异钩铗虫的检测及驱除方法，其特征在于，模板DNA的制备方法为: 从-20°C的95%的酒精保存液取出取出中体，置于2ml无菌离心管中，无菌水清洗并放置4°C冰箱置换过夜； 再次清洗并QIAGEN QIAamp DNA Mi ni Kit试剂盒进行DNA的提取，最后定容置25 μ L无菌水中，_20°C保存。
6.如权利要求2所述的基于分子标记技术的刀鲚林氏异钩铗虫的检测及驱除方法，其特征在于，per扩增及扩增片段克隆方法为: 以CDl:(GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT)和 CD2-(TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT) 为引物扩增林氏异钩铗虫28S序列引物；以4ul寄生虫DNA为模板，NC5和NC2为引物扩增ITS片段；反应体系为50 μ L，反应条件为95°C预变性5min ;94°C变性30s，53°C退火30s，72°C延伸60s，循环35次；同样以4μ L寄生虫DNA为模板，⑶I和⑶2为引物扩增28S片段；反应体系为50 μ L，反应条件为95°C预变性5min ;94°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，循环35次；扩增产物经I %浓度琼脂糖凝胶电泳检测分析； 将剩余PCR产物跑回收胶并用DNA凝胶回收试剂盒纯化，以纯化产物为模版，对28S片段大量扩增，与PMD18-T载 体相连进行TA克隆，筛选阳性克隆子提质粒进行测序。
全文摘要
本发明公开了一种基于分子标记技术的刀鲚林氏异钩铗虫的检测及其驱除方法，利用普通光学显微镜与分子遗传相结合方法，对寄生刀鲚的异钩铗虫进行种属鉴定，进而采取相应的驱除方法。首先，镜检显示，初步判定；然后分子遗传扩增28S rRNA基因5′端部分序列，测定林氏异钩铗虫28s序列，经比对分析，即可准确鉴定此寄生虫为林氏异钩铗虫。鉴定完毕后，用1mg/L浓度的甲苯咪唑全池泼洒，72小时后，虫体可脱落、死亡；同时，还要及时换水50％-60％，排出脱落的虫卵，防止以后复发。本发明提供的方法不受季节、环境限制，直接以DNA的形式在寄生虫的各个组织和发育时期均可检测到；检测技术方法简便，成本低廉；驱除方法简便易掌握。
文档编号C12Q1/68GK103224982SQ20131005177
公开日2013年7月31日 申请日期2013年2月2日 优先权日2013年2月2日
发明者徐钢春, 聂志娟, 顾若波, 徐跑 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心