一种融合基因真核表达构建体、基因工程疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种融合基因真核表达构建体，所述融合基因真核表达构建体包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片段与目的抗原基因相连的融合基因。本发明还提供一种融合基因基因工程疫苗及其制备方法。本发明的融合基因真核表达构建体能在真核生物细胞或真核生物体内表达目的融合基因抗原，可活化产生针对所述目的抗原的免疫应答。因此本发明能够提高针对所述目的抗原的免疫应答，尤其是细胞免疫应答，从而有助于提高疫苗的免疫效果。此外，本发明的真核表达构建体在体内还具有佐剂的效果，可显著性提高与之相连的目的抗原的免疫应答水平。
【专利说明】-种融合基因真核表达构建体、基因工程疫苗及其制备方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种真核表达构建体及其基因工程疫苗。
【背景技术】
[0002] 霍乱毒素 （Cholera toxin，CT)作为一种公认的粘膜免疫佐剂，已经广泛应用于疫 苗开发和应用研究。天然的CT分子是由一个A亚单位（CTA)和五个相同的形成环状的B亚 单位（CTB)结成的六聚体。A亚单位易被外源性蛋白水解酶切断其二硫键，产生由单一的二 硫键连结的A1和A2片段。A1片段具有ADP-核糖基化转移酶活性，能够催化某些哺乳动物 蛋白的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性ADP核糖基化，尤其是三聚体GTP结合蛋白Gs的调节 亚单位（调节腺苷酸环化酶的活性），此作用导致环腺苷酸（cAMP)的细胞内浓度增高和蛋 白激酶A的活化以及肠细胞内的主要氯化物通道的磷酸化和开放。A2片段是一种衔接分 子，其主要功能是与B亚单位相结合。B亚单位能与大多数哺乳动物小肠粘膜上皮细胞上 的GMI神经节苷脂受体结合，介导A亚单位进入细胞，而GM1几乎分布于体内所有细胞类 型中，如T细胞、B细胞、抗原呈递细胞以及上皮细胞等，因而也利于抗原进入细胞。
[0003] 多年来对CT免疫原性和佐剂活性的研究认为，作为一种黏膜免疫佐剂，CT是直接 作用于免疫系统，提高整体的反应强度，使针对于抗原的免疫反应增强。
[0004] 现有的关于CT佐剂的研究中，多是将其作为蛋白疫苗的佐剂经口途径投递，以刺 激活化肠黏膜免疫。这是由于一直以来的观点均认为CT佐剂活性主要依赖粘膜途径，是一 种有效的粘膜疫苗佐剂，一般以蛋白疫苗的形式进行投递，理论上难以将其直接通过系统 途径投递而产生佐剂效果。
[0005] 然而实际上CT发挥佐剂作用的机制有多种可能性，这是由它的分子特性决定的。 但虽然已经过多年的研究，CT佐剂活性的分子机理却一直没有被真正阐明，人们对有关的 信号传导途径知之甚少，从而妨碍了对它的应用。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明提供了一种融合基因表达构建体，提供了另一种实现CTA、 CTB佐剂效果的技术手段，拓宽了对于CT佐剂的应用。
[0007] 为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种融合基因真核表达构建体，所述融合 基因真核表达构建体包含CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片段 与目的抗原基因相连的融合基因。
[0008] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1 ;所述CTB编码基因 编码的氨基酸序列为SEQIDN0:2;所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDN0 :3;所述CTB 编码基因核酸序列为SEQ ID N0:4。
[0009] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有90%同源；所述 CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:2有90%同源。
[0010] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有95%同源；所述 CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:2有95%同源。
[0011] 优选的，所述目的抗原基因来源于病原微生物和/或动物细胞的抗原。所述目的 抗原基因可以来源于病毒、细菌等病原微生物，也可以来源于动物细胞，例如肿瘤抗原。所 述病原微生物包括但不限于HIV、HBV、流感病毒、肠道病毒等。
[0012] 优选的，所述真核表达构建体为质粒DNA载体、重组病毒载体、慢病毒载体。
[0013] 优选的，所述真核表达构建体为质粒DNA载体。所述质粒DNA载体包括可商购 的pVAXl (英杰（invitrogen))载体、pDRVISVl. 0载体(本文为叙述方便起见，以下简称为 pSVl.O)(参见中国国家发明专利200410028280. 3权利要求1)等。在本发明的一实施方 式中，所述质粒DNA载体是pSVl. 0载体。在本发明另一实施方式中，所述质粒DNA载体是 pVAXl〇
[0014] 优选的，所述真核表达构建体是包括TRIVN-CTA或TRIVN-CTB融合基因的真核表 达构建体。
[0015] 优选的，所述真核表达构建体是包括VP1-CTA或VP1-CTB融合基因的真核表达构 建体。
[0016] 优选的，所述真核表达构建体是包括HA-CTA或HA-CTB融合基因的真核表达构建 体。
[0017] 优选的，所述真核表达构建体是包括0VA-CTA融合基因的真核表达构建体。
[0018] 优选的，所述疫苗是目的抗原基因可以在受体内表达的任意疫苗形式，如可以是 DNA疫苗，重组病毒载体疫苗；优选DNA疫苗。
[0019] 优选的，所述的目的抗原基因是HIV病毒的抗原基因。
[0020] 优选地，所述的目的抗原基因是Tat、Rev、Int、Vif、Nef或其融合基因。
[0021 ] 优选的，所述目的抗原基因是肠道病毒抗原基因。
[0022] 优选的，所述目的抗原基因是源于肠道病毒71型（EV71)的衣壳蛋白编码基因 VP1。
[0023] 优选的，所述目的抗原基因是流感病毒抗原基因。
[0024] 优选的，所述目的抗原基因是流感病毒血凝素（HA)基因。
[0025] 本发明提供了一种含有融合基因的真核表达构建体载体，所述融合基因真核表达 构建体是由真核表达构建体与包含CTA和/或CTB编码基因，或CTA和/或CTB编码基因 核苷酸序列与目的抗原基因编码核苷酸序列相连的融合基因通过可操作连接而成，且所述 融合基因位于所述真核表达构建体的真核启动子元件与终止子元件之间，使得所述融合基 因真核表达构建体能在真核生物细胞或真核生物体内表达目的融合基因抗原，可活化产生 针对所述目的抗原的免疫应答。此外，所述融合基因真核表达构建体在体内还具有佐剂的 效果，可显著提高与之相连的目的抗原的免疫应答水平，因而，所述融合基因真核表达构建 体可以用于基因工程疫苗。
[0026] 所述融合基因的融合方式可以是目的抗原编码核苷酸序列在上游，CTA和/或CTB 编码核苷酸序列在下游，也可以是目的抗原编码核苷酸序列在下游，CTA和/或CTB编码核 苷酸序列在上游。目的抗原编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸序列之间可以有 几个氨基酸编码核苷酸序列组成的连接序列，比如经常用于融合基因的4个甘氨酸编码核 苷酸序列组成的连接序列。目的抗原编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸序列之 间也可以没有所述连接序列，而是直接首位相连。基因融合的方法均为本领域熟知，包括重 叠 PCR、IIS型限制性内切酶、重组酶重组等。
[0027] 本发明还提供一种融合蛋白，所述融合蛋白由包含CTA和/或CTB编码基因，或包 含CTA和/或CTB编码核苷酸序列与目的抗原编码核苷酸序列相连的融合基因的真核表达 构建体表达，该融合蛋白可活化产生针对所述目的抗原的免疫应答。
[0028] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ;所述CTB编码基因 编码的氨基酸序列为SEQIDN0:2;所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDN0 :3;所述CTB 编码基因核酸序列为SEQ ID N0:4。
[0029] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有90%同源；所述 CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:2有90%同源。
[0030] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有95%同源；所述 CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:2有95%同源。
[0031] 本发明还提供一种宿主细胞，含有所述包含CTA和/或CTB编码基因，或CTA和/ 或CTB编码核苷酸序列与目的抗原核苷酸序列相连的融合基因的真核表达构建体，且能表 达所述CTA和/或CTB与目的抗原相连的融合蛋白。
[0032] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1 ;所述CTB编码基因 编码的氨基酸序列为SEQIDN0:2;所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDN0 :3;所述CTB 编码基因核酸序列为SEQ ID N0:4。
[0033] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有90%同源；所述 CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:2有90%同源。
[0034] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有95%同源；所述 CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:2有95%同源。
[0035] 本发明还提供一种基因工程疫苗，所述基因工程疫苗包括含有CTA和/或CTB编 码基因，或CTA和/或CTB编码核苷酸序列与目的抗原编码核苷酸序列融合表达的真核表 达构建体。本发明提供的基因工程疫苗可单独施用，也可以与其它形式的疫苗组合施用。尽 管本发明没有记载所述基因工程疫苗与重组蛋白疫苗组合施用，但本领域技术人员可利用 本领域熟知的初免-加强的策略组合施用本发明的基因工程疫苗与重组蛋白疫苗，以提供 免疫应答效果。
[0036] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1 ;所述CTB编码基因 编码的氨基酸序列为SEQIDN0:2;所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDN0 :3;所述CTB 编码基因核酸序列为SEQ ID N0:4。
[0037] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有90%同源；所述 CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:2有90%同源。
[0038] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有95%同源；所述 CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:2有95%同源。
[0039] 优选的，所述基因工程疫苗是DNA疫苗，投递方式包括肌肉内接种、皮下接种、静 脉注射、鼻内接种、电穿孔、电转化、与载体共投递，优选肌肉内接种和皮下接种。本发明关 于DNA疫苗的投递方式还包括电穿孔，电转化，以及与载体的共投递，诸如壳聚糖、聚乙烯 亚胺（PEI)等。
[0040] 本发明还提供一种制备基因工程疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括将目的 抗原基因编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸相连成融合基因，并克隆至真核表 达构建体的步骤。
[0041] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ;所述CTB编码基因 编码的氨基酸序列为SEQIDN0:2;所述CTA编码基因核酸序列为SEQIDN0 :3;所述CTB 编码基因核酸序列为SEQ ID N0:4。
[0042] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有90%同源；所述 CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:2有90%同源。
[0043] 优选的，所述CTA编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1有95%同源；所述 CTB编码基因编码的氨基酸序列与SEQ ID N0:2有95%同源。
[0044] 本发明所称"融合基因"，是指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套 调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下构成的嵌合基因。融 合基因的表达产物为融合蛋白。
[0045] 本发明所称的"真核表达构建体"，是指将可在真核细胞或真核生物中表达目的基 因的载体，包括真核表达启动子，终止子或增强子等一系列真核表达调控原件。例如，真核 表达构建体可以是质粒DNA载体，重组病毒载体、慢病毒载体等。
[0046] 本发明所称的"基因工程疫苗"，是指使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合 成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞表达构建体或宿主中，使之充分表达， 经纯化后而制得的疫苗。例如重组DNA疫苗、重组病毒载体疫苗、亚单位疫苗。
[0047] 本发明所称的"佐剂效果"，是指提高目的抗原免疫应答的效果，包括提高体液免 疫应答(即抗体应答）或细胞免疫应答的效果。
[0048] 与现有技术相比，本发明的有益效果是能够提高针对所述目的抗原的免疫应答， 尤其是细胞免疫应答，从而有助于提高疫苗的免疫效果。此外，CT或其亚单位是细菌的表 达产物，尚未有关于其与目的抗原融合的真核表达构建体的研究报道，本发明填补了这一 方面的空白。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 图1是实施例1中的DNA疫苗或真核表达构建体pSVl. 0-TRIVN的表达验证结果。
[0050] 图2是实施例1中的DNA疫苗或真核表达构建体pSVl. 0-TRIVN-CTA、 pSVl. 0-TRIVN-CTB的表达验证结果。
[0051] 图3是实施例1中的ELISP0T技术评价细胞免疫原性的结果；其中图3A是总反应 强度，即将Tat，Rev，Int，Vif和Nef共五个肽库的斑点数叠加后的结果；图3B是针对各个 肽库的特异性T细胞应答分布情况。
[0052]
[0053]
[0054] 图4是实施例2中的细胞免疫原性评价的结果；其中图4A是总反应强度；图4B是 针对各个肽库的特异性T细胞应答分布情况。
[0055]
[0056]
[0057] 图5是实施例2中的多色流式细胞分析中的划门示意图。
[0058] 图6是实施例2中的多色流式细胞分析的结果；其中图6A是各免疫组小鼠的中心 记忆⑶8T细胞的细胞因子表达水平；图6B是各免疫组小鼠的效应记忆⑶8T细胞的细胞因 子表达水平。
[0059]
[0060]
[0061] 图7是实施例2中的对Nef的结合抗体检测结果。
[0062] 图8是实施例2中的在NIH 3T3细胞模型上的体外刺激活性检测结果。
[0063] 图9是实施例3中的DNA疫苗或真核表达构建体pVAXl-VPl、pVAXl-VPl-CTA、 pVAXl-VPl-CTB的表达验证结果。
[0064] 图10是实施例3的细胞免疫原性的检测结果。
[0065] 图11是实施例3中的对重组蛋白VP1的结合抗体检测结果。
[0066] 图12是实施例4中的细胞免疫原性的检测结果。
[0067] 图13是实施例4中的中和抗体检测结果。
[0068] 图14是实施例5中的特异性T细胞应答水平检测结果。
[0069] 图15是实施例6中的对疫苗免疫小鼠进行痘苗病毒攻击后的保护性结果。
【具体实施方式】
[0070] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附后权利要求书限定的范 围。
[0071] 实施例1，与目的基因 TRIVN的融合
[0072] -、TRIVN基因的获取及其DNA疫苗的构建
[0073] 从 Los Alamos HIV Database 中调取 AE 重组亚型 AE2F 毒株（Genbank 登录号 AY008714)的了&丨、1^11拉、￥丨€和他€蛋白的氨基酸序列，经过必要的突变修饰之后，将上 述基因按Tat-Rev-Int-Vif-Nef的顺序串联起来，在相邻的蛋白之间加入4个甘氨酸作为 柔性连接子。然后将其按哺乳动物细胞的密码子偏好逆向翻译成DNA序列，并送上海捷瑞 生物工程有限公司合成。合成后的融合基因命名为TRIVN (核酸序列SEQ ID:5)。用分子 生物学方法将所述融合基因分别克隆至PDRVISV1. 0载体的多克隆位点（以下简称pSVl. 0) 上，构建成含融合基因的DNA疫苗pSVl. Ο-TRIVN。构建完成后，经测序鉴定后入库备用。
[0074] 二、pSVl. Ο-TRIVN 的表达验证
[0075] 为了检测含融合基因 TRIVN质粒DNA疫苗pSVl.O-TRIVN在哺乳动物细胞中的 表达情况，我们将上述质粒和空载体pSVl. 0为阴性对照分别转染了 HEK 293T细胞，然后 分别收集转然后细胞裂解物，并制备蛋白样品进行免疫印迹杂交实验。图1是DNA疫苗 pSVl. Ο-TRIVN的表达验证。将所述DNA疫苗以及载体pSVl. 0转染293T细胞后，裂解转染细 胞制成样品，然后用免疫杂交印迹方法检测，一抗是抗HIV-1人血清。如图1所示，在90kD 位置，相对于Mock对照（即pSVl. 0载体转染对照)，所述DNA疫苗有特异性条带，与预期的 分子量位置吻合，而细胞对照及空载体转染对照的泳道上未见相应分子量位置的条带，表 明DNA疫苗在哺乳动物细胞中能正确表达目的抗原TRIVN。
[0076] 三、CTA、CTB基因的获取及其与TRIVN基因的融合构建
[0077] 根据基因文库所提供的霍乱弧菌0395的CTA、CTB基因序列，用JCAT在线优 化软件（http://www. jcat. de/)将其优化成哺乳动物密码子偏好的核酸序列CTA (SEQ ID:3)、CTB (SEQ ID:4)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。运用重叠 PCR技术分别将 CTA、CTB基因序列与上述目的基因 TRIVN基因序列融合形成融合基因基因序列TRIVN-CTA (SEQ ID:6)、TRIVN-CTB(SEQ ID:7)，并将所得的融合基因分别克隆至DNA疫苗载体pSVl.O 的多克隆位点，得到两种包含所述融合基因的DNA疫苗，分别命名为pSVl. 0-TRIVN-CTA、 pSVl. 0-TRIVN-CTB。构建完成后，经测序鉴定后入库备用。
[0078] 四、pSVl. 0-TRIVN-CTA、pSVl. 0-TRIVN-CTB 的表达验证
[0079] 为了检测分别含融合基因 TRIVN-CTA和TRIVN-CTB的质粒DNA疫苗 pSVl. Ο-TRIVN-CTA和pSVl. 0-TRIVN-CTB在哺乳动物细胞中的表达情况，我们将上述质 粒和空载体pSVl. 0为阴性对照分别转染了 HEK293T细胞，然后分别收集转染后的细胞 裂解物，并制备蛋白样品进行免疫印迹杂交实验。图2为DNA疫苗pSVl.O-TRIVN-CTA、 pSVl. 0-TRIVN-CTB的表达验证结果。方法同图1。如图2所示，在95KD的分子量左右有特 异性条带，与预期的分子量位置吻合，而细胞对照及空载体转染对照的泳道上未见相应分 子量位置的条带，表明DNA疫苗在哺乳动物细胞中能正确表达目的抗原。
[0080] 五、pSVl. 0-TRIVN-CTA、pSVl. Ο-TRIVN-CTB 的免疫原性评价
[0081] 用德国QIAGEN公司去内毒素质粒大提试剂盒制备上述质粒DNA疫苗 pSVl. 0-TRIVN，pSVl. 0-TRIVN-CTA，pSVl. 0-TRIVN-CTB 和载体质粒 pSVl. 0,所有操作按说 明书进行。将制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中（pH7. 2)，调整浓度为lmg/ mL〇
[0082] 体重为18-22g的SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/ c小鼠随机分为A、B、C三组，每组5只。其中，对照组A小鼠免疫pSVl. 0-TRIVN，实验组小 鼠分别接种pSVl. 〇-TRIVN-CTA、pSVl. Ο-TRIVN-CTB。分别于第0、2、4周在小鼠右侧胫前肌 注射100 μ g质粒DNA疫苗，在第7周时用含TRIVN的重组痘苗载体疫苗(上海市公共卫生 临床中心提供）加强，于第9周分离脾细胞进行免疫检测。免疫分组及规划如表1。
[0083] 表1.实施例1的动物免疫分组及免疫规划
[0084]
【权利要求】
1. 一种融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述融合基因真核表达构建体包含 CTA和/或CTB编码基因，或包含CTA和/或CTB编码基因片段与目的抗原基因相连的融合 基因。
2. 如权利要求1所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述CTA编码基因编码 的氨基酸序列为SEQ ID N0:1 ;所述CTB编码基因编码的氨基酸序列为SEQ ID N0:2 ;所述 CTA编码基因核酸序列为SEQ ID NO: 3;所述CTB编码基因核酸序列为SEQ ID NO:4。
3. 如权利要求1?2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述目的抗原 基因来源于病原微生物和/或动物细胞的抗原。
4. 如权利要求1?2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达 构建体为质粒DNA载体、重组病毒载体、慢病毒载体。
5. 如权利要求1?2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达 构建体是包括TRIVN-CTA和/或TRIVN-CTB融合基因的真核表达构建体。
6. 如权利要求1?2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达 构建体是包括VP1-CTA和/或VP1-CTB融合基因的真核表达构建体。
7. 如权利要求1?2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达 构建体是包括HA-CTA和/或HA-CTB融合基因的真核表达构建体。
8. 如权利要求1?2任一所述的融合基因真核表达构建体，其特征在于，所述真核表达 构建体是包括0VA-CTA融合基因的真核表达构建体。
9. 一种融合基因基因工程疫苗，其特征在于，所述基因工程疫苗包括权利要求1至8所 述的融合基因真核表达构建体。
10. -种制备融合基因基因工程疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括将目的抗原基 因编码核苷酸序列与CTA和/或CTB编码核苷酸相连成融合基因，并克隆至真核表达构建 体的步骤。
【文档编号】C12N15/66GK104059941SQ201310088674
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年3月19日 优先权日:2013年3月19日
【发明者】徐建青, 万延民 申请人:苏州工业园区唯可达生物科技有限公司