检测hiv-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变法及试剂盒的制作方法

专利名称：检测hiv-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测Hiv-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。
背景技术：
一、非核苷类逆转录酶抑制剂及其作用机制获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmune Deficiency Syndrome, AIDS),又称艾滋病，是世界十大致命疾病之一，其病原体为HIV-1病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)，HIV属于逆转录病毒，分为HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地区的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染。HIV-1极易产生基因变异，在药物选择压力下形成了大量突变株，使临床应用的抗HIV药物迅速丧失临床效价，对目前的抗HIV治疗构成了严重的威胁。最早获准上市的抗HIV药物是祀向逆转录酶(Reverse transcriptase, RT)的核苷类逆转录酶抑制剂(Nucleoside RT inhibitors, nRTIs),但是该类药物具有严重的毒副作用。之后上市的非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside RT inhibitors, NNRTIs)具有高效低毒的优点，是目前高效抗逆转录疗法(Highly active antiretroviral therapy, HAART)的重要组成部分。NNRTIs与核苷类化合物不同，其糖环部分为开链结构，因为缺少5’-位羟基，不能进行磷酰化，不参与DNA合成，它们和RT相互作用的机制不同于nRTIs，而是通过与HIV-1RT的非底物结合部位结合，间接影响非底物结合部位的构型，产生抑制活性。HIV-1 RT是由p66/p51亚基组成的异 二聚体酶，其中，p51亚基没有催化活性，仅具有构象调节作用。p66亚基由聚合酶活性域及RNase H活性域组成，聚合酶活性域由手指、手掌、拇指及链接4个亚结构域构成，其功能是以单链的病毒RNA为模板将三磷酸脱氧核苷(dNTP)有序地连接起来合成双链DNA。NNRTI是非竞争抑制剂，它与位于RT酶p66亚基手掌亚结构域上的结合位点(NNRTIs binding pocket,NNIBP)的结合引起的RT构象变化,破坏了 DNA聚合酶催化位点的精确结合构象，尤其是β2-β3片层上高度保守的Y183-M184-D185-D186基序。此夕卜，NNRTI的结合扭曲了组成“引物沟”结构元件的活性构象，干扰引物DNA链的精确定位，进而抑制DNA的聚合反应。近年来，为克服nRTIs临床长期应用而引发的毒副作用，非核苷类化合物在治疗HIV-1方面得到迅速发展，如奈维雷平、地拉韦定和依非韦仑。二、HIV-1病毒对非核苷类逆转录酶抑制剂的耐药类型及机制NNRTIs长期临床应用也会产生耐药性，极大地限制了其临床应用。进一步研究表明，不同结构类型的NNRTIs所致HIV变异株各不相同，如双杂芳环呱嗪类化合物表现为HIV-1 RT第100位氨基酸变异产生抗药性，TIBO类则使其103位氨基酸变异，TSAO类又表现为138位氨基酸变异产生抗药性，双吡啶类会引起第106位氨基酸发生变化，吡啶酮类抗药部位在181位。而HEPT类化合物的耐药株病毒主要表现在第100位的亮氨酸变异为异亮氨酸，103位的赖氨酸变异为天门冬氨酸，106位的缬氨酸变异为组氨酸。NNRTIs在临床使用时，NNIBP中单个氨基酸的突变直接影响药物的结合，经自然选择后，迅速出现耐药毒株。主要的NNRTI耐药突变有K103N/S、V106A/M、Y181C/L/V、Y188L/C/H 和 G190A/S/E ;次要的 NNRTI 耐药突变有 L1001、K101P、P225H、F227L、M230L和K238T，常常与I个主要NNRTI耐药突变联合出现。对第一代NNRTI耐药的变异株包括L1001、K103N、V106A、E138K、Y188I/C和Y188H,这些变异都位于NNIBP的内部或者周围。例如:(I)与NVP耐药性有关的Y181C、G190A和K103N突变;(2)与EFV耐药性有关的K103N突变；(3)与DLV突变有关的Y181C和K103N突变。此外，其他突变如T215Y/F、M41L、L210W、H208Y和Vl 181等也会使NNRTI产生耐药。其中，K103N、Y181C和G190A/S是最为严重的变异株，能使绝大多数NNRTI产生严重耐药。另外，NNRTI之间也普遍存在交叉耐药性。通过对大量RT/NNRTI复合物的X衍射晶体学研究，并结合临床及生物化学相关数据，发现HIV-1变异株对NNRTI产生耐药性的分子机制包括以下三种:(a)氨基酸突变使RT/NNRTI之间关键性疏水性作用缺失或改变；(b)氨基酸突变产生对RT/NNRTI结合不利的立体位阻；(c)氨基酸变异引起的结合位点电荷分布及氢键作用的改变。Y181或Y188突变成非芳香性的疏水氨基酸(通常为Y181C和Y188L)，降低NNRTIs结合所需要的芳香性作用，这种芳香作用在第一代NNRTI与RT的结合中占有重要地位，因此Y181C和Y188L变异株会使第一代中许多类型的NNRTIs产生耐药。其他变异如V106A、F227L和Y318F也会导致第二代NNRTIs疏水性作 用的缺失或改变，进而降低NNRTI与酶的亲和力。V106A变异通过改变周围氨基酸的位置及构象，从而间接影响NNRTIs的结合。NNIBP 中的 A98G、L1001、V1081、G190A/E、P225H、P236L 及 L234I 变异通过增加立体位阻直接或间接扰动周围的氨基酸来影响NNRTI与RT的结合。第三种耐药机制与K101E、K103N/T、E138K、V179D、E233V 及 K238T 变异有关。HAART的首要目标是最大限度地、持久地抑制病人体内病毒复制。但是，在实际临床治疗当中，部分病人达不到这样的效果，即使在初始治疗时能有效提升cd4+t细胞数量并显著降低血浆病毒载量的病人中，仍有相当一部分在持续治疗一段时间后血浆病毒载量出现反弹。这就意味着抗病毒治疗的失败。导致抗病毒治疗失败的原因是多方面的，其中HIV-1耐药性的产生是主要因素之一。目前，广泛应用于临床的几类抗病毒药物均有耐药株产生，HIV-1耐药株的传播已呈现上升的趋势，而且HIV病毒株常常会对同一类药当中的不同种药物产生交叉耐药性。耐药成为AIDS治疗面临的严峻挑战，同时耐药性检测逐渐成为帮助临床医生选择联合用药方案的重要工具。三、HIV-1病毒的耐药检测方法目前HIV-1病毒耐药性的检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的
病毒基因突变。基因型检测的方法有直接测序法、异源双链轨迹试验(HTA)、PCR连续酶测定试验、线性探针试验、限制性内切酶酶切试验、引物特异的PCR测定、RNA酶(RNase)A错配剪切试验等，其中部分技术已有商用系统。在进行基因测序后，将测序结果与标准病毒株比较后可坦福大学耐药数据库(http://hivdb.Stanford, edu/)及Los Alamos HIV耐药数据库。通过输入所测得的序列，数据库可自动提供病毒基因变异及耐药结果。目前已有基于测序技术的商品化的试剂盒:TRUEGENE HIV-1Genotyping Kit (Visible Genetics, Inc.Toronto, Canada)和 ViroSeq Kit (Applied Biosystems, Inc.Foster City, CA, USA)。两者都已获得美国FDA批准成为应用于临床常规检测的试剂盒。此外，基于线性探针技术(Line probe assay)的商品化的试剂盒 LiPA(Innogenetics,Ghent,Belgium)也已用于实验室研究。基因型检测的优点是可提供交叉耐药资料，可在样品收集后I 2周得到结果，技术步骤较少，一般情况下费用较便宜。但也存在明显缺点，即不直接提供药物的耐受程度，无法定量，部分变异位点与临床耐受的相关性无法完全确认，分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测通过病毒培养，再通过与无耐药性个体减少HIV复制50%或90%(50%or90%inhibitory concentration, IC50or IC90)所需的药物水平比较来分级耐药程度。表型分析的标准方法是首先从病人体内分离病毒，与待检药物共同培养，然后测定不同药物浓度下外周血单核细胞(PBMC)所产生的p24抗原量，据此得到IC5(I。该法步骤复杂，对操作技术要求高，整个过程至少需6周时间，病毒分离培养过程还有可能发生变异。重组表型方法将病人体内HIV-1的蛋白酶和逆转录酶基因序列进行RT-PCR扩增，扩增产物继而插入pol基因缺失型HIV-1载体以形成重组病毒，因此重组病毒保持了病人体内病毒对药物的敏感性，然后在不同药物，同一药物不同浓度下对重组病毒进行培养，即可测定出对药物的敏感性。表型耐药检测的结果与基因型检测结果通常相同，但有时亦有差异。当耐药HIV-1株水平较低时，表型检测可发现基因型检测所没有提示的耐药性变异。表型耐药是耐药检测的金标准，直接提供药物的耐受情况，可定量，但缺点也很明显，即技术要求高、费时、费用高昂，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。基因型和表型检测的进一步应用限制，包括缺乏对现有检测方法的质量保证；检测费用较高；对微小病毒标本不敏感；如果存在耐药病毒，而病毒量又低于20%，现有检测方法很可能检测不到。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、快速、成本低的检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针:包括以下8类特异性探针中的至少一类:检测逆转录酶基因LlOOI突变的特异性探针，为SEQ ID N0:1 6中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因K103N突变的特异性探针，为SEQ ID N0:7 12中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 13 21中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针，为SEQ ID NO:22 27中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因Y181C和Y181I突变的特异性探针，为SEQ ID N0:28 36中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因Y188L、Y188H和Y188C突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 37 50中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针，为SEQ ID NO:51 56中的任意一种或任意一种的互补序列；检测逆转录酶基因P225H突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 57 65中的任意一种或任意一种的互补序列。作为本发明的检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针的改进:检测逆转录酶基因L100I突变的特异性探针中，SEQ ID NO:1 3中的任意一种为针对第100位氨基酸残基为L (野 生型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID N0:4 6中的任意一种为针对第100位氨基酸残基为I (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因；所述检测逆转录酶基因K103N突变的特异性探针中，SEQ ID N0:7 9中的任意一种为针对第103位氨基酸残基为K (野生型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 10 12中的任意一种针对第103位氨基酸残基为N (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因；所述检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针中，SEQ ID N0:13 15中的任意一种为针对第106位氨基酸残基为V (野生型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ IDNO: 16 18中的任意一种为针对第106位氨基酸残基为A (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ IDN0:19 21中为针对第106位氨基酸残基为M (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因；所述检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针中，SEQ ID N0:22 24中的任意一种为针对第108位氨基酸残基为V (野生型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 25 27中的任意一种为针对第108位氨基酸残基为I (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。所述检测逆转录酶基因Y181C和Y181I突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 28 30中的任意一种为针对第181位氨基酸残基为Y (野生型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ IDNO:31 33中的任意一种为针对第181位氨基酸残基为C (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:34 36中的任意一种为针对第181位氨基酸残基为I (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因；所述检测逆转录酶基因Y188L、Y188H和Y188C突变的特异性探针中，SEQ IDNO: 37 39中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为Y(野生型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:40 42中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为L (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 43 45中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为H (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 46 50中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为C (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因；所述检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针中，SEQ ID NO:51 53中的任意一种为针对第190位氨基酸残基为G (野生型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 54 56中的任意一种为针对第190位氨基酸残基为A (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因；所述检测逆转录酶基因P225H突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 57 59中的任意一种为针对第225位氨基酸残基为P (野生型)的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID N0:60 65中的任意一种为针对第225位氨基酸残基为H (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。本发明还同时提供了利用上述检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针制成的HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变检测试剂盒:除了包括检测逆转录酶基因L100I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因K103N突变的特异性探针、检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针、检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Y181C和Y181I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Y188L、Y188H和Y188C突变的特异性探针、检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针以及检测逆转录酶基因P225H突变的特异性探针外，还包括HIV-1逆转录酶基因内标探针、表面化学质控探针、杂交阳性质控探针。作为本发明的HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变检测试剂盒的改进:所述HIV-1逆转录酶基因内标探针、表面化学质控探针和杂交阳性质控探针的长度均为15-35个核苷酸；所述探针的5’端均连接上10-40个寡聚dT。备注说明:检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针也满足上述特性，即，长度为15-35个核苷酸；探针的5’端均连接上10-40个寡聚dT。作为本发明的HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变检测试剂盒的改进:HIV-1逆转录酶基因内标探针为SEQ ID NO:66所述的核苷酸序列或其互补序列；表面化学质控探针PBQC-003 为 HEX-poly (T) 12-gcaagacaagtggaagtgtg_NH2 ；杂交阳性质 控探针PBQC-002 为 NH2_poly ⑴ 25 - GCAACCACCACCGGAGG。作为本发明的HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变检测试剂盒的改进:用于固定探针的载体为硅片、用各种功能基团衍生的膜，或用各种功能基团修饰的玻片。作为本发明的HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变检测试剂盒的改进:载体为表面带有醛基基团修饰的玻片。本发明还同时提供了一种检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法，包括以下步骤:I)利用试剂盒提供的方法扩增待测的人类免疫缺陷病毒基因组中的逆转录酶基因区段；2)将步骤I)得到的扩增产物与所述试剂盒中的HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变特异性探针进行杂交，确定待测人类免疫缺陷病毒所含的对非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变类型。作为本发明的检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法的改进:PCR扩增为套式不对称RT-PCR，其中用外套引物进行的PCR为RT-PCR，取其部分扩增产物作为内套引物扩增的模板，用内套引物进行的PCR扩增为不对称PCR。作为本发明的检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法的进一步改进:扩增HIV-1病毒逆转录酶基因区段的内套引物对，其下游引物的5’端标记有荧光分子，且其5’端序列包含一段与HIV-1基因组及人类基因组序列无关的序列，使上下游引物的Tm值相差8-15° C。本发明的检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒，包括扩增HIV-1病毒逆转录酶基因的方法，以及与上述扩增的PCR产物进行杂交，检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针；所述探针的碱基序列如SEQ ID NO:1 66 所示。在本发明中:待测人类免疫缺陷病毒耐药突变为NNRTIs耐药突变(即非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变)。耐药突变位于人类免疫缺陷病毒逆转录酶基因区段内。所述检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针、HIV-1逆转录酶基因内标探针的序列可以是如序列SEQ ID NO: 1-66所示，也可以是如序列SEQ IDNO: 1-66所示序列的互补序列。当采用的HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变检测探针和内标探针序列为SEQ ID NO: 1-66时，内套扩增引物的反向引物被荧光标记；当采用的HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变检测探针和内标探针序列为SEQ ID NO: 1-66所示序列的互补序列时，内套扩增引物的正向引物被荧光标记。本发明的试剂盒还包括进行PCR扩增和分子杂交反应的反应液，和50%的二甲亚砜(DMSO)作为点样和杂交反应的空白对照。用内套引物进行的不对称PCR扩增分为两个阶段，每个阶段的每个温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成，包括10-30个温度循环；其中第一阶段的退火温度为45-55° C ;第二阶段的退火温度为55-65° C。用内套引物进行的不对称PCR扩增，内套引物的上下游引物浓度比例为1:2至1:100之间。在本发明的检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法中，杂交包括以下步骤:I)将内套引物PCR扩增产物与杂交液，及杂交阳性对照探针的靶标混合，高温变性并速冷以使双链PCR产物解链为单链；2)上述变性后的杂交混合物与固定于载体上的探针在合适的温度下杂交一定时间；3)在洗液中清洗，去除未与载体上的探针杂交的PCR产物、盐离子等杂交液成分。检测HIV-1病毒对非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒，包括对HIV-1病毒基因组中与非核苷类逆转录酶抑制剂耐药相关的逆转录酶基因(ReverseTranscriptase, RT)区段进行套式不对称PCR扩增及荧光标记的扩增方法，以及与上述扩增的PCR产物进行杂交，检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针。所述HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变是指HIV-1病毒逆转录酶基因内某个(或多个)核苷酸的突变，进一步改变了该位点所对应的氨基酸残基类型，导致含有该突变的HIV-1病毒对非核苷类似物抑制剂产生耐药的突变。所述的HIV-1病毒基因组中与非核苷类逆转录酶抑制剂耐药相关的逆转录酶基因区段是指包含待检耐药突变的区段，具体的是指编码第I到第257个氨基酸的基因片段。所述的待检非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变是指针对HIV-1逆转录酶8个氨基酸位点的12种突变类型，具体是指以下突变类型:I) L100I (即逆转录酶基因的第100位氨基酸残基由L突变为I)； 2) K103N (即逆转录酶基因的第103位氨基酸残基由K突变为N)；
3) V106A (即逆转录酶基因的第106位氨基酸残基由V突变为A)、V106M (即逆转录酶基因的第106位氨基酸残基由V突变为M)；4) V108I (即逆转录酶基因的第108位氨基酸残基由V突变为I)；5)Y181C (即逆转录酶基因的第181位氨基酸残基由Y突变为C)、Y181I (即逆转录酶基因的第181位氨基酸残基由Y突变为I)；6) Y188C (即逆转录酶基因的第188位氨基酸残基由Y突变为C)、Y188L (即逆转录酶基因的第188位氨基酸残基由Y突变为L)、Y188H(即逆转录酶基因的第188位氨基酸残基由Y突变为H)；7) G190A (即逆转录酶基因的第190位氨基酸残基由G突变为A)；8) P225H (即逆转录酶基因的第225位氨基酸残基由P突变为H)。所述扩增HIV-1病毒基因组中逆转录酶基因区段的引物分为外套正向引物和外套反向引物，以及内套正向引物和内套反向引物，大小均为15-50个核苷酸，优选为15-45个核苷酸；所述的内套反向引物5’ -末端连接上加尾序列后，再被荧光标记。所述的外套引物可扩增HIV-1病毒基因组中长度为1300bps的片段，包含HIV-1蛋白酶基因上游的132bps片段、所述的蛋白酶基因编码第I到第99个氨基酸的基因片段和逆转录酶基因编码第I到第290个氨基酸的基因片段。所述的内套引物可扩增HIV-1病毒基因组中长度为858bp的片段，包含逆转录酶基因编码第I到第257个氨基酸的基因片段。所述试剂盒还包括检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针、内标探针、表面化学质控探针、杂交阳性探针以及所述杂交阳性探针的靶标。所述探针的大小均为12-24个核苷酸，优选为15-20个核苷酸；所述探针的5’-末端连接上10-40个寡聚dT，优选连接上20-30个寡聚dT。所述检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变特异性探针为单链DNA，包括序列表中序列I到序列66所示序列，以及序列表中序列I到序列66所示序列的互补序列，优选为序列表中序列I到序列66所示序列。当采用的HIV-1耐药突变检测探针为序列表中序列I到序列66所示序列时，内套扩增引物的反向引物5’ -末端连接上加尾序列后，再被荧光标记；当采用的HIV-1耐药突变检测探针为序列表中序列I到序列66所示序列的互补序列时，内套扩增引物的正向引物5’ -末端连接上加尾序列后，再被荧光标记。所述的检测逆转录酶基因L100I突变的特异性探针具有序列表中序列I到序列6的核苷酸序列，其中序列I到序列3是针对第100位氨基酸残基为L (野生型)的HIV-1逆转录酶基因，序列4到序列6是针对第100位氨基酸残基为I (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。所述的检测逆转录酶基因K103N突变的特异性探针具有序列表中序列7到序列12的核苷酸序列，其中序列7到序列9是针对第103位氨基酸残基为K (野生型)的HIV-1逆转录酶基因，序列10到序列12是针对第103位氨基酸残基为N (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。所述的检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针具有序列表中序列13到序列21的核苷酸序列，其中序列13到序列15是针对第106位氨基酸残基为V (野生型)的HIV-1逆转录酶基因，序列16到序列18是针对第106位氨基酸残基为A (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因，序列19到序列21是针对第106位氨基酸残基为M (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。所述的检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针具有序列表中序列22到序列27的核苷酸序列，其中序列22到序列24是针对第108位氨基酸残基为V(野生型)的HIV-1逆转录酶基因，序列25到序列27是针对第108位氨基酸残基为I (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。所述的检测逆转录酶基因Y181C和Y181I突变的特异性探针具有序列表中序列28到序列36的核苷酸序列，其中序列28到序列30是针对第181位氨基酸残基为Y (野生型)的HIV-1逆转录酶基因，序列31到序列33是针对第181位氨基酸残基为C (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因，序列34到序列36是针对第181位氨基酸残基为I (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。所述的检测逆转录酶基因Y188L、Y188H和Y188C突变的特异性探针具有序列表中序列37到序列50的核苷酸序列，其中序列37到序列39是针对第188位氨基酸残基为Y(野生型)的HIV-1逆转录酶基因，序列40到序列42是针对第188位氨基酸残基为L (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因，序列43到序列45是针对第188位氨基酸残基为H (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因，序列46到序列50是针对第188位氨基酸残基为C (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。所述的检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针具有序列表中序列51到序列56的核苷酸序列，其中序列51到序列53是针对第190位氨基酸残基为G(野生型)的HIV-1逆转录酶基因，序列54到序列56是针对第190位氨基酸残基为A (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。所述的检测逆转录酶基因P225H突变的特异性探针具有序列表中序列57到序列65的核苷酸序列，其中序 列57到序列59是针对第225位氨基酸残基为P(野生型)的HIV-1逆转录酶基因，序列60到序列65是针对第225位氨基酸残基为H (耐药突变型)的HIV-1逆转录酶基因。所述的内标探针具有序列表中序列66的核苷酸序列，是针对逆转录酶基因扩增片段内的保守序列，无论是野生型HIV-1病毒，还是包含上述任何耐药突变的HIV-1病毒均可与该探针杂交。所述的表面化学质控探针(PBQC-003)主要用于芯片制备过程中监控芯片表面化学性质，检测探针固定效率，其序列可以是与待检测序列无同源性的任何序列，长度介于20-70个寡核苷酸，其5’端被突光分子标记；所述的杂交阳性质控探针(PBQC-002)主要用于监控芯片杂交过程，其序列可以是与待检测序列无同源性的任何序列，长度介于20-70个寡核苷酸；所述的杂交阳性对照探针的靶标(PBQC-001)是与所述的杂交阳性质控探针(PBQC-002)序列完全互补的寡核苷酸，其5’端被突光分子标记。所述的杂交反应液中含有所述的杂交阳性对照探针的靶标。所述用外套引物进行的RT-PCR包含两个阶段:第一阶段为逆转录阶段，与常规逆转录方法相同。第二阶段为PCR扩增阶段，在灭活逆转录酶后，在外套引物存在的条件下进行PCR扩增。扩增温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成，包括10-40个温度循环，优选为30个循环。所述的第二阶段退火温度为45-55° C，优选为48° C。所述用内套引物进行的不对称PCR扩增包含两个阶段，每个阶段的每个温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成，包括10-30个温度循环，优选为20个温度循环。其中第一阶段的退火温度为45-50° C，优选为48° C ;第二阶段的退火温度为55-65° C，优选为58。Co所述的不对称PCR扩增是指通过调整内套引物中上游引物与下游引物的浓度比例，使上游引物的量低于下游引物，以及在扩增的第二阶段提高退火温度(如上文所述)，使得上游引物在该退火温度下无法与模板复性，而下游引物由于Tm值高于上游引物，在该退火温度下仍可正常与模板复性并进一步延伸，最终实现PCR扩增产物中两条链的产量不同的不对称扩增效果，其中能够与HIV-1耐药突变特异性探针杂交的单链数量高于该链的互补链。所述的内套引物中的上游引物与下游弓丨物的浓度比例可以是1:2至1: 100之间的任意比例，优选为1:5。所述的上游引物的Tm值高于下游引物，其差值可以是8-15° C之间的任意值，优选为10° C。所述的杂交包括以下步骤:I)将内套引物PCR扩增产物与杂交液，及杂交阳性对照探针的靶标混合，高温变性并速冷以使双链PCR产物解链为单链；2)上述变性后的杂交混合物与固定于载体上的探针在合适的温度下杂交一定时间；3)在洗液中 清洗，去除未与载体上的探针杂交的PCR产物、盐离子等杂交液成分。所述的杂交液包含杂交所需的盐溶液、表面活性剂，以及用于控制杂交严谨度的甲酰胺。所述的盐溶液可以是1-10XSSC，或1-10XSSPE，优选为3XSSC或3XSSPE。所述的用于控制杂交严谨度的甲酰胺浓度范围可以是5%-30%，优选为20%。所述的合适的杂交温度范围可以介于30° C_42° C，优选为32° C。所述的杂交时间可以介于15分钟至24小时之间，优选为2小时。本发明所述的检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒，具有集成化程度高、灵敏度高、特异性好，检测结果稳定可靠，成本低的特点，可广泛用于HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的发生、发展的流行病学监测，为合理用药，有效降低和延缓耐药得发生提供有效工具。


下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1是检测Hiv-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的探针点阵排布图；图2是检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂单位点耐药突变的杂交反应结果图；图3是检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶物抑制剂多位点耐药突变的杂交反应结果图；图4是检测全血、血浆以及核酸样品中HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的杂交反应结果图。
具体实施例方式实施例1、利用本发明检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂单位点耐药突变本实施例检测了本发明所涉及的所有HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变类型，以及不包含任何突变的野生型HIV-1病毒逆转录酶基因类型。1.寡核苷酸引物和探针的制备表I和表2显示了本发明检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶物抑制剂耐药突变所用的引物和探针的序列，均委托上海英骏生物技术有限公司合成。表1HIV-1病毒逆转录酶基因区段扩增引物
权利要求
1.检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，其特征是:包括以下8类特异性探针中的至少一类: 检测逆转录酶基因LlOOI突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 1 6中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因K103N突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 7 12中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 13 21中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针，为SEQ ID NO:22 27中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因Y181C和Y181I突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 28 36中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因Y188L、Y188H和Y188C突变的特异性探针，为SEQ ID NO:37 50中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 51 56中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测逆转录酶基因P225H突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 57 65中的任意一种或任意一种的互补序列。
2.根据权利要求1所述的检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，其特征是: 所述检测逆转录酶基因L100I突变的特异性探针中，SEQ ID NO:1 3中的任意一种为针对第100位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID ΝΟ:Γ6中的任意一种为针对第100位氨基酸残基为I的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因Κ103Ν突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 7、中的任意一种为针对第103位氨基酸残基为K的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 1(Γ 2中的任意一种针对第103位氨基酸残基为N的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 13 15中的任意一种为针对第106位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 16 18中的任意一种为针对第106位氨基酸残基为A的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO: 19 21中为针对第106位氨基酸残基为M的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针中，SEQ ID NO:22 24中的任意一种为针对第108位氨基酸残基为V的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:25 27中的任意一种为针对第108位氨基酸残基为I的HIV-1逆转录酶基因。
所述检测逆转录酶基因Y181C和Υ181Ι突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 28 30中的任意一种为针对第181位氨基酸残基为Y的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID ΝΟ:3Γ33中的任意一种为针对第181位氨基酸残基为C的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:34^36中的任意一种为针对第181位氨基酸残基为I的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因Y188L、Y188H和Y188C突变的特异性探针中，SEQ IDNO:37 39中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为Y的HIV-1逆转录酶基因，SEQ IDNO:40^42中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为L的HIV-1逆转录酶基因，SEQ IDNO:43^45中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为H的HIV-1逆转录酶基因，SEQ IDNO:46 50中的任意一种为针对第188位氨基酸残基为C的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 51 53中的任意一种为针对第190位氨基酸残基为G的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:54 56中的任意一种为针对第190位氨基酸残基为A的HIV-1逆转录酶基因； 所述检测逆转录酶基因P225H突变的特异 性探针中，SEQ ID NO: 57 59中的任意一种为针对第225位氨基酸残基为P的HIV-1逆转录酶基因，SEQ ID NO:60^65中的任意一种为针对第225位氨基酸残基为H的HIV-1逆转录酶基因。
3.利用如权利要求1所述的检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针制成的HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变检测试剂盒，其特征是: 除了包括检测逆转录酶基因L100I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因K103N突变的特异性探针、检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针、检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Y181C和Y181I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Y188L、Y188H和Y188C突变的特异性探针、检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针以及检测逆转录酶基因P225H突变的特异性探针外， 还包括HIV-1逆转录酶基因内标探针、表面化学质控探针、杂交阳性质控探针。
4.根据权利要求3所述的HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变检测试剂盒，其特征是:所述HIV-1逆转录酶基因内标探针、表面化学质控探针和杂交阳性质控探针的长度均为15-35个核苷酸；所述探针的5’端均连接上10-40个寡聚dT。
5.根据权利要求4所述的HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变检测试剂盒，其特征是: HIV-1逆转录酶基因内标探针为SEQ ID NO:66所述的核苷酸序列或其互补序列； 表面化学质控探针 PBQC-003 为 HEX- poly (T) 12-gcaagacaagtggaagtgtg-NH2 ； 杂交阳性质控探针 PBQC-002 为 NH2-Poly ⑴ 25 - GCAACCACCACCGGAGG。
6.根据权利要求5所述的HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变检测试剂盒，其特征是: 用于固定探针的载体为硅片、用各种功能基团衍生的膜，或用各种功能基团修饰的玻片。
7.根据权利要求6所述的HIV-1病毒非核苷类抑制剂耐药突变检测试剂盒，其特征是: 所述载体为表面带有醛基基团修饰的玻片。
8.检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法，其特征是包括以下步骤: 1)利用试剂盒提供的方法扩增待测的人类免疫缺陷病毒基因组中的逆转录酶基因区段； 2)将步骤I)得到的扩增产物与所述试剂盒中的HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变特异性探针进行杂交，确定待测人类免疫缺陷病毒所含的对非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变类型。
9.根据权利要求8所述的检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法，其特征是: PCR扩增为套式不对称RT-PCR，其中用外套引物进行的PCR为RT-PCR，取其部分扩增产物作为内套引物扩增的模板，用内套引物进行的PCR扩增为不对称PCR。
10.根据权利要求9所述的检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法，其特征是: 扩增HIV-1病毒逆转录酶基因区段的内套引物对，其下游引物的5’端标记有荧光分子，且其5’端序列包含一段与HIV-1基因组及人类基因组序列无关的序列，使上下游引物的Tm值相差8-15° C。 ·
全文摘要
本发明涉及检测HIV-1病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。本发明具体公开了检测人类免疫缺陷病毒非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变的特异性探针，包括以下8类特异性探针中的至少一类检测逆转录酶基因L100I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因K103N突变的特异性探针、检测逆转录酶基因V106A和V106M突变的特异性探针、检测逆转录酶基因V108I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Y181C和Y181I突变的特异性探针、检测逆转录酶基因Y188L 、Y188H和Y188C突变的特异性探针、检测逆转录酶基因G190A突变的特异性探针、检测逆转录酶基因P225H突变的特异性探针。
文档编号C12N15/11GK103215377SQ20131008872
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者张琼, 李兰娟, 项春生, 吴南屏 申请人:浙江大学