专利名称：Foxp3基因 TSDR位点甲基化检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基因位点甲基化检测方法。
背景技术：
SLE是一种由于自身免疫反应引起的慢性炎性疾病，以多个器官、组织受累和血清中有多种自身抗体为特征，但其发病机制尚未明了，大量资料证明是在遗传、环境、感染和性激素等因素的影响下出现的细胞免疫功能失调所致。SLE患者临床异质性大，病情迁延，反复波动。因此，在诊断SLE时，应进行包括其活动性与严重程度的病情判断，以利于选择治疗方案。但是对于SLE活动度的判定并非易事，活动性与重症度并非是平行关系，且SLE是多脏器受害的疾病，受侵犯脏器损害不同，对疾病活动性的评价也会发生变化。包括对感染性疾病在内的其他疾病进行鉴别，进一步加大了活动性判定的难度。现行的SLE活动性判定依据主要有:SLE病情活动指数(systemic lupuserythematosus disease activity index, SLEDAI)、狼疮活动测量标准(systemic lupusactivity measure, SLAM)、欧洲统一狼疮损伤指数(European consensus lupus damageindex，ECLAM)和大不列颠群岛狼疮评估组指数(British Isles lupus assessmentgroup, BILAG)，其中SLEDAI和BILAG是目前狼疮随机临床试验最常用的两个评估工具。但上述各种评分方法仍不完美，各有优缺点。单独使用，有时并不能对活动性给出准确的评判。因此，需要一种更为有效、更为精准判定方法。CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)首次由日本学者Sakaguchi等于1995年所报道，这类T细胞介导的免疫调节作用是维持自身免疫耐受的关键，此发现引起了免疫学界的广泛关注。Treg的免疫抑制性是指经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制CD4+ CD25-T细胞的活化和增殖。大量研究表明，Treg不仅在自身耐受的获得和维持及自身免疫的防御中起重要作用，在肿瘤、移植耐受甚至是病原体感染等免疫反应调节中也扮演重要角色。虽然其机制至今还不是十分明确，但大量研究表明Treg细胞的发育、功能的发挥与一个蛋白质分子——Foxp3有着密切的联系。Foxp3是一种转录因子，它能通过调控特定基因的表达，从而控制Treg细胞的分化成熟。有研究发现与非活动性SLE患者和健康对照组相比,活动性SLE患者外周血⑶4+T细胞表面⑶69表达增多，而⑶25的表达明显减少，这一现象提示，活动性SLE患者中T细胞被大量激活，却没有诱导出免疫调节性Treg细胞。进一步研究显示SLE患者外周血Foxp3的表达也明显低于对照组，它的表达水平与⑶4+⑶25+调节性T细胞数量存在依赖关系。Treg细胞在发挥抑制作用机制中起着重要作用。因此，活动性SLE患者体内缺乏CD4+CD25+ T细胞可能会导致机体抑制自身免疫反应的功能减弱，并与SLE的发生发展密切相关。目前，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-High Resolution Melting CurveAnalyse，简称MS-HRM)是一种不需要PCR产物后续操作的，简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。该方法在甲基化修饰位点附近设计实时定量PCR引物，对来自经重亚硫酸盐修饰的DNA的相关区进行特异性PCR扩增。重亚硫酸盐修饰DNA，让非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5 -甲基胞嘧啶保持不变，随后使用含饱和DNA结合染料的PCR体系扩增，扩增后通过比较曲线的熔解温度和峰形进行分析。MS-HRM因其高敏感性，可以区分扩增产物中少至I个碱基变化的序列差异，从而通过尿嘧啶/胞嘧啶的差异判断扩增子来源的初始模板的甲基化修饰差异。但MS-HRM的数据一直没有一种公认的分析方法，目前结果分析大多采用标准曲线法，将甲基化和非甲基化对照DNA (经过重亚硫酸盐修饰)以不同比例混合，创建一系列甲基化梯度标准品。结合标准品的特征熔解曲线和温度，用专门软件进行计算分析，从而得出样本中的DNA甲基化比率。这种方法使得实验更加繁琐，增加了实验环节，在标准品在配置的过程中极易因操作原因，导致标准品配比不准确，使得实验准确性和重复性大打折扣。且加大了实验成本，延长了实验时间。因此限制了 MS-HRM技术在临床诊断的推广应用。发明内容
，本发明的目的在于基于并改进现有MS-HRM方法，提供一种更为简单的检测Foxp3基因TSDR位点甲基化水平的方法。
本发明提供的检测 Foxp3基因TSDR位点甲基化水平的方法依次包括下述步骤:(I)从样本全血中提取基因组DNA ;(2) DNA的亚硫酸氢盐处理；(3) MS-HRM PCR =MS-HRMPCR反应中，Foxp3基因TSDR位点的特异性扩增引物序列为:F:5/ -TTGGGGGTAGAGGAGGATTTAGAGGGTC-3/，R:5/ -CAACACCCATATCACCCCACCTAAA-3'；(4)经HRM-PCR检测，读取样本Tm值，根据样本Tm值判断Foxp3基因TSDR甲基化水平。
本发明改进了传统用于检测基因甲基化水平的MS-HRM方法，基于MS-HRM的高灵敏性，直接使用MS-HRM检测系统性红斑狼疮外周血基因组DNA中Foxp3基因TSDR的Tm值，以此为指标，反应活动性SLE患者Foxp3基因TSDR甲基化水平。因为直接使用Tm值进行统计学分析，不用标准曲线进行后续的甲基化百分比计算。这样我们省去了标准品制备和软件分析环节，大大节省了时间和成本，简化了实验步骤，使得实验操作更简单且减少了实验误差。特别是无需甲基化计算软件分析，使得很多没有配备甲基化分析软件的HRM实时定量PCR仪均能开展此实验。该方法相对于现有的MS-HRM方法，更加简单易行，有望成为评估Foxp3基因TSDR甲基化的精确、廉价、快速的工具，并为临床指导评价SLE活动性、疗效和预后提供帮助。
TSDR (Treg-specific demethylated region)是 Foxp3 基因中的一个高度保守的位点，其在自然Treg细胞中完全去甲基化，但在效应T细胞中是甲基化的。Foxp3基因TSDR的甲基化使得相关转录因子不能结合至其启动子区，导致Foxp3低表达。本发明研究得到:以慢性感染性疾病作为疾病对照，与非活动性SLE患者，慢性感染性疾病患者以及正常人群相比，活动性SLE患者。Foxp3的TSDR区甲基化水平明显升高，且与SLE活动性呈高度正相关。因此，通过检测Foxp3基因TSDR的甲基化水平，对评价SLE病人的活动性提供帮助。
图1:各组样本MS-HRM PCR检测Tm值示意图，其中HC:健康对照；CM1:慢性感染性疾病；In SLE::非活动性SLE ；Ac SLE:活动性SLE ；
图2: SLEDAI分值与Tm值间相关性 图3 =MS-HRM PCR反应条件；
图4 =HRM-PCR原理和特点。
具体实施例方式实施例1: Foxp3基因TSDR位点甲基化检测
1、从300ul全血中提取基因组DNA
(1)裂解1:取300ul全 血放入到1.5ml的离心管中，加入900ul裂解液I。上下颠倒混匀，涡旋混匀15秒后放入离心机中离心，离心速率为8000rpm，Imin0倒掉上层液，可见离
心管底部有血色沉淀。重复上述裂解步骤一次，最后去除上清，使离心管底部沉淀无残留裂解液I ;
(2)裂解2:在上步所得沉淀中加入Iml裂解液2。上下颠倒混匀，彻底重悬沉淀。涡旋混匀15秒后8000rpm，离心lmin。去上清，可见离心管底部有微量淡红色沉淀。重复此裂解步骤一次，最后彻底去除上清，离心管底部的灰白色沉淀无残留裂解液2 ；
(3)消化:吸取蛋白酶KIOul ( = 0.2mg )加入到上面的离心管中，使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后，加入320ul消化液，上下颠倒混匀，使沉淀充分重悬。58°C水浴消化15分钟，最后可见澄明的消化液体；
(4)纯化:在上面的消化液体中加入IlOul纯化液，上下颠倒混匀，15000rpm,离心lmin。吸取上清液放入到装有IOOOul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻柔上下翻转10次,可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到IOOul 70%乙醇中来回漂洗20次，钩出DNA，在空气中凉干后放入到IOOul溶解液中。4°C溶解过夜，提取完成。提取的DNA可于-20°C长期保存。如要立即用此DNA做PCR实验，把DNA溶解液放在58°C水浴中，保温30分钟，手指轻弹混匀离心管，使DNA充分溶解即可。2、DNA的亚硫酸氢盐处理
采用Qiagen公司的EpiTect Bisulf ite试剂盒处理全血基因组，DNA标本来自第一部分实验提取所得，操作步骤按试剂盒说明书进行:
(1)缓冲液BW中加入30ml无水乙醇
(2)缓冲液BD中加入30ml无水乙醇
(3)将310ul 无酶水加入 310ug carrier RNA 中，得到 lug/ul 的 carrier RNA 溶液
(4)按1:100体积往缓冲液BL中加入lug/ul的carrier RNA溶液,使缓冲液BL中carrier RNA 的浓度为 10ug/ml
(5)根据需要处理的样本多少溶解BisulfiteMix,每管Bisulfite Mix中加入800ul的无酶水，剧烈震荡5分钟至完全溶解
(6)在200ul的PCR管中依次加入表2-1中的各成分，充分震荡混匀；反应体系见表I。表1:DNA亚硫酸氢盐处理步骤(6)的反应体系成分__体积_
DMA 溶液35μΙ (约 lfjg)
无酶水__5|i_
Bisulfite Mix 溶液85μ!
「DHA保护緩冲液丨丨35μ!
「结体积[j 140μ1
(J)在PCR仪中按表2的条件进行亚硫酸氢钠转换；
表2: DNA亚硫酸氢盐处理反应条件
「变性H 99°C—|丨5分钟 Π
fjffWIf^O0C丨卩5分钟
「变性Ilsrc~Il 5分钟 Π
[Tff育Il cotI Ils 分钟
「变性||wtIh分钟
「■育11 MT11 Π5 分钟
保存Il 20°cIl
(8)反应结束后将PCR管简短离心，将所有的反应液体转至干净的1.5ml EP管中；
(9)加入560ul缓冲液BL(含IOug/mlcarrier RNA,见第4步),震荡混勻，简短离心；
(10)将上一步所得的所有液体全部转入带有收集管的EpiTectspin吸附柱中，13000rpm离心I分钟，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(11)往离心柱中加入500ul缓冲液BW，13000rpm离心I分钟，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(12)往离心柱中加入500ul缓冲液BD，室温孵育15分钟，13000rpm离心I分钟，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
(13)13000rpm离心I分钟，将吸附柱转入一个新的1.5ml的EP管中，加20ul缓冲液EB, 12000rpm离心I分钟洗脱DNA，所得的液体即为纯化了的亚硫酸氢钠处理后的DNA。3.MS-HRM检测样本Foxp3基因TSDR甲基化水平
使用 Rotor-Gene 6000 cycler (Corbett)实时定量 PCR 仪进行 MS-HRM PCR，根据EpiTect HRM-PCR kit (Qiagen)试剂盒说明书步骤进行。(I)反应体系的建立在200ul的PCR管中依次加入以下各组分，所有PCR均采用10μ1反应体系,具体见表3。表 3:MS-HRM PCR 反应体系
权利要求
1.Foxp3基因TSDR位点甲基化检测方法，其特征在于依次包括下述步骤: Cl)从样本全血中提取基因组DNA ； (2)DNA亚硫酸氢盐处理；(3)MS-HRM PCR ； (4)经HRM-PCR检测，读取样本Tm值，根据样本Tm值判断Foxp3基因TSDR甲基化水平。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(3)MS-HRM PCR反应时，Foxp3基因TSDR位点的PCR特异性扩增引物序列为:F:5/ -TTGGGGGTAGAGGAGGATTTAGAGGGTC-3/， R:5/ -CAACACCCATATCACCCCACCTAAA-3'。
3.根据权利要求1或2所述的化检测方法，其特征在于:在步骤(4)中，样本Tm均值达到或超过79.0O时 ，判断Foxp3基因TSDR位点甲基化水平高。
全文摘要
本发明公开了一种检测Foxp3基因TSDR位点甲基化水平的方法。该方法依次包括下述步骤(1)从全血中提取基因组DNA；(2)DNA的亚硫酸氢盐处理；(3)MS-HRMPCR；(4)经HRM-PCR检测，读取样本Tm值，根据样本Tm值判断Foxp3基因TSDR甲基化水平。该方法相对于现有的MS-HRM方法，更加简单易行，有望成为评估Foxp3基因TSDR位点甲基化的精确、廉价、快速的工具，并为临床指导评价SLE活动性、疗效和预后提供帮助。
文档编号C12Q1/68GK103173552SQ20131009160
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月21日 优先权日2013年3月21日
发明者陆前进, N·欧文, 梁功平, 赵明, 余鑫海 申请人:中南大学