一种调节细胞内huwe1表达水平的方法
【专利摘要】本发明涉及一种调节细胞内HUWE1的表达水平的方法，所述方法包括通过调节细胞内BARD1的表达水平来调节细胞内HUWE1的表达水平。具体而言，一方面，所述方法包括用含有编码BARD1的核苷酸的表达质粒转染所述细胞，从而使所述细胞中HUWE1的表达水平降低。另一方面，所述方法包括用BARD1的siRNA转染所述细胞，从而使所述细胞中HUWE1的表达水平提高。
【专利说明】-种调节细胞内HUWE1表达水平的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白质表达调控领域，具体而言，本发明涉及一种通过调节细胞内 BARD1的表达水平来调节细胞内HUWE1的表达水平的方法。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是一种常见恶性肿瘤，严重危害女性健康。在中国，乳腺癌的发病率逐年递 增，发病年龄提前，死亡率也不断攀升。大约5-10%的乳腺癌为遗传性乳腺癌，其发病具有 明显的家族聚集性和遗传倾向；其余大部分为散发性乳腺癌，目前对其发病原因并不明确。
[0003] 蛋白HUWE1 (人源蛋白，含有HECT、UBA和WWE结构域1，NCBI序列登录号为 NM_031407. 4)是一个包含4374个氨基酸残基的大分子，分子量约500kDa。其编码基因位 于染色体Xpll，但在乳腺癌中已检测到其编码基因延伸至染色体Xpll-13上（Xie D，Jauch A，Miller C W, et al. Discovery of over-expressed genes and genetic alterations in breast cancer cells using a combination of suppression subtractive hybridization, multiplex FISH and comparative genomic hybridization [J]. Int J Oncol. 2002,21 (3) :499-507)。其分子 C 端有一个 HECT 结构域（与 E6-AP 羧基 端同源，4036-4374aa)，约有350个氨基酸，这个模序最初发现于细胞内泛素 E3连接酶 E6-AP(E6-相关蛋白）蛋白质中，当E6-AP与致癌的人乳头瘤病毒E6蛋白结合后，这个 复合物具有E3泛素连接酶的活性，就能结合并泛素化降解抑癌基因 P53(SChefTner M， Huibregtse J M， Vierstra R D， et al.The HPV_16E6and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53[J]. Cell. 1993, 75(3) :495-505 ；Munger K, Howley P M. Human papillomavirus immortalization and transformation functions [J]· Virus Res. 2002,89 (2) :213-228)。HECT 结构域中含有半 胱氨酸残基，它能够与泛素分子形成硫酯键，对于含有HECT结构域的E3蛋白酶发挥酶活 性起到非常重要的作用（Pickart C M.Mechanismsunderlying ubiquitination[J].Annu Rev Biochem. 2001，70 :503-533 ;Huang L，Kinnucan E，Wang G，et al. Structure of an E6AP-UbcH7complex ：insights into ubiquitination by the E2-E3 enzyme cascade[J]. Science. 1999,286(5443) :1321-1326)。HECT结构域为酶催化反应区，此结构域内氨基酸 的突变如4341位的半胱氨酸（Cys，C)突变为丙氨酸（Ala，A)之后，可以破坏其E3连接 酶活性（Zhong Q，Gao W，Du F，et al.Mule/ARF-BPl，a BH3_only E3ubiquitin ligase， catalyzes the polyubiquitination of Mcl-land regulates apoptosis[J]. Cell. 2005, 121 (7) :1085-1095);此外，HUWE1 的 N-端具有以下结构域：ARLDl(104-304aa)和 ARLD2(424-815aa)结构域，作用还不是很清楚；一个泛素相关结构域（UBA，1318-1354aa)， 与蛋白质泛素化途径相关，如DNA损伤蛋白Rad23、Cbl中含有此结构（Hicke L，Dunn R. Regulation of membrane protein transport by ubiquitin and ubiquitin-binding proteins[J]. Annu Rev Cell Dev Biol. 2003,19 ：141-172 ；Buchberger A. From UBA to UBX ：new words in the ubiquitin vocabulary[J]. Trends Cell Biol.2002,12 (5)： 216-221) ;WWE结构域（1612-1692aa)，被认为是保守的蛋白质相互作用模序；BH3(Bcl-2同 源区域3,1972-1994aa)结构域，其序列与抗凋亡蛋白Bcl-2有高度同源性，可能与细胞凋 亡有关。
[0004] HUWE1的发现及命名经历了一系列变化。在1994年Gu等人发现了此蛋白的一个 小片段，命名为UREB1，其大小比全长蛋白少了约3000个氨基酸残基，它能够结合前脑啡肽 原基因的启动子区域（Gu J，Ren K，Dubner R，et al. Cloning of a DNA binding protein that is a tyrosine kinase substrate and recognizes an upstream initiator-like sequence in the promoter of the preprodynorphin gene[J]. Brain Res Mol Brain Res. 1994,24(1-4) :77-88),但其生物学功能还不是很清楚。1995年Gu等人又发现了在 细胞内UREB1的酪氨酸位点可以被磷酸化（Gu J，Dubner R，Fornace A J，et al.UREBl， a tyrosine phosphorylated nuclear protein, inhibits p53 transactivation[J]. Oncogene. 1995,11 (10) :2175-2178),酪氨酸磷酸化后能够抑制P53的转录激活作用，而酪 氨酸突变后其抑制作用明显减弱。HUWE1的结构与人乳头瘤病毒E6相关蛋白（E6-AP)有 高度同源性。之后也被称为ARF-BP1(ARF-结合蛋白1)，能够直接结合ARF蛋白（人类中 称为P14ARF，鼠中叫做pl9 AKF)，与P53依赖的或非依赖的细胞生长、凋亡途径有密切关系。 在P53阳性、阴性或突变的细胞中，降低或缺失ARF-BP1，能够导致细胞生长抑制、G2/M周 期阻滞、细胞凋亡等（Chen D，Brooks C L，Gu W.ARF-BP1 as a potential therapeutic target [J] · Br J Cancer. 2006,94 (11) :1555-1558)，同时其功能受抑癌基因 ARF 的调控； HUWE1 还被称为 Mule(Mcl-l 泛素连接酶 E3)(Zhong Q，Gao W，Du F，et al.Mule/ARF-BPl， a BH3-〇nly E3 ubiquitin ligase, catalyzes the polyubiquitination of Mcl_l and regulates apoptosis [J]· Cell. 2005,121 (7) :1085-1095)，能够使抗凋亡蛋白 Mcll 的多 聚泛素化，从而通过蛋白酶体途径降解，参与调控细胞凋亡；该蛋白还被称为E3s$e，能够 泛素化组蛋白，参与染色质凝聚、精子形成（LiuZ，0ughtred R，Wing S S. Characterization of E3Histone, a novel testis ubiquitin protein ligase which ubiquitinates histones [J]· Mol Cell Biol. 2005, 25 (7) :2819-2831);此外，还有 HectH9，LASUl 等名称。
[0005] 通过Northern印迹分析发现HUWE1在人的各种组织中均有表达，但其在乳腺癌、 结直肠癌等肿瘤中的表达水平较高，是一种癌基因。研究发现，HUWE1作为癌基因可以促进 乳腺癌细胞的生长，敲低细胞内HUWE1的表达水平，则乳腺癌细胞的生长明显受到抑制。
[0006] 由于HUWE1在癌症治疗研究中的重要性，需要更多与HUWE1水平调节相关的有效 方法来促进对癌症治疗的研究。已经发现了一些内源性或合成的调控HUWE1表达的蛋白因 子，比如细胞内的USP7S蛋白（即18位丝氨酸被磷酸化的USP7去泛素化酶）能通过抑制 HUWE1的自我泛素化降解而来稳定HUWE1蛋白，具体而言，在DNA损伤之后USP7S的蛋白水 平下调，进而导致HUWE1的自我泛素化增强而被降解，HUWE1的蛋白水平下降，接着HUWE1 的下游底物P53累积增多，进而产生一系列DNA损伤反应来应对细胞内的毒性事件。如果 DNA损伤之后HUWE1的蛋白水平不能有效下调，那么抑癌基因 P53蛋白就不能有效升高，就 会导致DNA损伤修复的缺陷，进而基因组不稳定，容易发生肿瘤（Khoronenkova S V，Dianov G L. USP7S-dependent inactivation of Mule regulates DNA damage signalling and r印air[J].Nucleic Acids Res. 2013,41 (3) :1750-1756)。此外，是否还有其它蛋白可调控 HUWE1的表达水平还未见报道。
[0007] BRCA1是迄今为止被公认的与乳腺癌发生最为密切的一个抑癌基因。1996年研究 人员发现了一种可以与BRCA1蛋白结合的蛋白，因为其具有和BRCA1相似的环指功能域， 所以命名为BARD1 (BRCA1相关环结构域蛋白1，NCBI序列登录号为NM_000465. 2)。BRCA1 通过其N端环结构与BARD1形成等价异二聚体，彼此可以相互稳定，这种异二聚体的形式 在细胞中约占70%。BRCA1与BARD1形成二聚体后可以介导DNA损伤反应、细胞周期的调 控、G2/M检查点调控或是DNA损伤修复过程，当BRCA1或BARD1的蛋白水平或功能发生改变 时，引起基因组的不稳定性，容易引起细胞恶性转化，与乳腺癌的发生密切相关，这是BARD1 与BRCA1形成异源二聚体时BARD1所参与的主要功能；另一方面研究发现，BARD1还可发 挥不依赖于BRCA1的功能。当BRCA1和BARD1的基因产物数量相称时，诱导细胞存活和 DNA的修复功能，如果BARD1蛋白产物超出BRCA1时诱导凋亡（Balmain A，Gray J，Ponder B. The genetics and genomics ofcancer[J]· Nat Genet. 2003,33Suppl :238_244)，其 可通过胞核输出到胞质的细胞信号转导，依赖有活性的P53通过线粒体途径介导细胞凋 亡（Irminger-Finger I, Leung ff C. BRCAl-dependent and independent functions of BARDl[J].Int J Biochem Cell Biol. 2002,34(6) :582-587)。到目前为止，还没有关于 BARD1与HUWE1在表达水平方面相关的报道，本发明的发明人首次发现BARD1表达水平的变 化对HUWE1的表达水平会产生影响，并基于该发现得到本发明。
【发明内容】
[0008] 本发明涉及一种调节细胞内HUWE1的表达水平的方法，所述方法包括通过调节细 胞内BARD1的表达水平来调节细胞内HUWE1的表达水平。
[0009] 一方面，所述调节细胞内BARD1的表达水平可通过用含有编码BARD1的核苷酸 的表达质粒转染所述细胞来实施，从而使所述细胞中的HUWE1的表达水平降低。所述 细胞可为 HCT116 P53+/+细胞、HCT116 P53-/-细胞、MCF7 细胞、Hela 细胞或 HEK293T 细胞，所述含有编码BARD1的核苷酸的表达质粒可为pcDNA3. 1-V5-His-BARD1质粒、 pCDNA4-Myc-His-BARDl 质粒或 pCMV-Tag2A-Flag-BARDl 质粒。具体而言，所述 HUWE1 可为 内源蛋白，所述转染为用含有编码BARD1的核苷酸的表达质粒单独转染所述细胞。优选地， 所述细胞的汇合度为85 %至90 %，所述质粒的量为1. 2 μ g/10平方厘米细胞至4 μ g/10 平方厘米细胞。所述HUWE1可为外源蛋白，所述转染为用含有编码BARD1的核苷酸的表达 质粒与含有编码HUWE1的核苷酸的表达质粒共转染所述细胞。优选地，所述细胞的汇合度 为85 %至90 %，所述含有编码BARD1的核苷酸的表达质粒的量为1 μ g/10平方厘米细胞 至2 μ g/10平方厘米细胞，且所述含有编码HUWE1的核苷酸的表达质粒的量为2. 5 μ g/10 平方厘米细胞至4 μ g/10平方厘米细胞。所述含有编码HUWE1的核苷酸的表达质粒可为 PCDNA3. Ι-Flag-HA-HUWEl 质粒、pcDNA3. l/V5-His-Topo_HUWEl 质粒或 pEYFP-HUWEl 质粒。
[0010] 另一方面，所述调节细胞内BARD1的表达水平可通过用BARD1的siRNA转染所 述细胞来实施，从而使所述细胞中HUWE1的表达水平提高。优选地，所述细胞为MCF10F 细胞，其汇合度为35%;所述siRNA的序列为SEQIDN0:15或SEQIDN0 :16，其量为 80X 1(Γ6μ M/10平方厘米细胞至120X 1(Γ6μ M/10平方厘米细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1示意性地显示pCDNA4-Myc-His-BARDl的质粒结构。
[0012] 图2示意性地显示pcDNA3. 1-V5-His-BARD1的质粒结构。
[0013] 图3示意性地显示pCMV-Tag2A-Flag-BARDl的质粒结构。
[0014] 图4a示意性地显示p⑶NA3. l-Flag-ΗΑ质粒结构，图4b示意性地显示 PCDNA3. Ι-Flag-HA-HUWEl 的质粒结构。
[0015] 图5示意性地显示pEYFP-HUWEl的质粒结构。
[0016] 图6显示在HCT116 P53+/+及HCT116 P53-/-细胞中过表达 pcDNA3. 1-V5-His-BARD1质粒后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹技术对细胞中 BARD1和HUWE1蛋白水平进行检测的结果。
[0017] 图 7 显示在 Hela 细胞中过表达 pCDNA4-Myc-His-BARDl 质粒 0. 5g、l. 0g ; pCDNA3. 1-Flag-HA-HUWEl 质粒 1. 2g ;及对照空载体 pCDNA4-Myc-His-BARDl 质粒 0· 2g、 0. 5g之后，转染48小时后收获细胞，用RIPA裂解液直接裂解细胞，通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳和免疫印迹技术对细胞中BARD1和HUWE1蛋白水平进行检测的结果。
[0018] 图 8 显示在 293T 细胞中过表达 pCMV-Tag2A-Flag-BARDl 质粒、pcDNA3. 1/ V5-His-Topo_HUWEl 质粒（Chen，D.，Kon，N.，Li，M.，Zhang，W.，Qin，J.，and Gu，W. (2005) · ARF-BPl/Mule is a critical mediator ofthe ARF tumor suppressor.Celll21 (7), 1071-83)及对照空载体p⑶NA3. 1-Flag-HA质粒后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹 对细胞中BARD1和HUWE1蛋白水平进行检测的结果。
[0019] 图 9 显示在 293T 细胞中过表达 pCMV-Tag2A-Flag-BARDl 质粒、pEYFP-HUWEl 质 粒及对照空载体pCMV-Tag2A-Flag质粒后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹对细胞中 BARD1和HUWE1蛋白水平进行检测的结果。
[0020] 图10显示在MCF7细胞中过表达pcDNA3. 1-V5-His-BARD1质粒、 PCDNA3. Ι-Flag-HA-HUWEl质粒及对照空载体pCDNA3. l-Flag-ΗΑ质粒后，通过聚丙烯酰胺 凝胶电泳和免疫印迹对细胞中BARD1和HUWE1蛋白水平进行检测的结果。
[0021] 图11显示用BARD1的干扰RNA即siBardl-2和siBardl-3转染MCF10F细胞后， 转染72小时后收获细胞，用RIPA裂解液直接裂解细胞，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印 迹技术对细胞中BARD1和HUWE1蛋白水平进行检测的结果。
【具体实施方式】
[0022] 下面将结合具体的实施例对本发明作进一步详细说明，以下实施例仅仅是为了举 例说明，对发明不构成任何限定。
[0023] 除非另有说明，本发明采用组织培养、分子生物学、基因工程、细胞生物学、免疫学 等生物学领域的常规技术，这些技术在本领域技术人员所理解的范围之内。
[0024] 本发明实施例中采用的细胞、抗体和相关试剂
[0025] 细胞系及来源
[0026] 本发明中的HCT116 P53+/+细胞（P53等位基因均正常的结肠癌细胞）、HCT116 P53-/-细胞（P53等位基因都缺失的结肠癌细胞）为人结肠癌细胞，购自美国模式培养物集 存库（ATCC) ;HEK293T细胞为用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5El区的人胚肾亚三倍体 细胞，该细胞容易被转染，购自美国模式培养物集存库（ATCC) ;MCF7细胞为人乳腺癌细胞， 购自美国模式培养物集存库（ATCC) ;MCF10F细胞为人乳腺上皮细胞，购自美国模式培养物 集存库（ATCC) ;Hela细胞为宫颈癌细胞，购自美国模式培养物集存库（ATCC)。
[0027] 细朐培养某及培养方法
[0028] 冊1(2931'及！1(：1'116?53+/+、！1(：1'116?53-/-细胞用含10%胎牛血清（办(31〇116) 的DMEM培养基培养。MCF7的培养基为含10%胎牛血清（Hyclone)的DMEM培养基，加入 0. 01mg/ml的胰岛素。MCF10F的培养基需要1 : 1混合的的DMEM培养基及Ham' s F12培 养基，同时添加20ng/ml的表皮生长因子（EGF)，100ng/ml的霍乱毒素，0. 01mg/ml的胰岛 素，500ng/ml的皮质醇，5%的马血清。所有细胞均在5%的二氧化碳、湿度合适的37°C培养 箱进行培养。
[0029] 抗体及相关试剂
[0030] 本发明使用的HUWE1兔抗、Myc鼠抗均购自Abeam公司；Flag鼠抗、GFP鼠抗购自 Sigma公司；V5-标签兔抗购自MBL公司；BRCA1鼠抗体购自Santa Cruz公司；BARD1鼠抗 体购自abeam公司；HA鼠抗体购自convance公司；鼠及兔的二抗购自Santa Cruz公司。
[0031] DMEM细胞培养基及Ham' s F12培养基购于Gibco公司；表皮生长因子（EGF)、 霍乱毒素、胰岛素、皮质醇购自sigma公司；马血清、胎牛血清购于Hyclone公司；胰蛋白 酶购自鼎国生物公司；限制性内切酶购自百灵克公司；脂质体（Lipofectamine)2000购自 Invitrogen 公司；转染干扰 RNA 的试剂（Lipofectamine RNAiMAX)购自 Invitrogen 公 司；NEB的phusion高保真DNA聚合酶购于百灵克公司；NEB的T4DNA连接酶购于百灵克公 司；苯甲基磺酰氟（PMSF)、Cocktail (P8340)、蛋白酶体抑制剂购自于Sigma公司；乙基苯 基聚乙二醇（NP-40)、十二烷基磺酸钠（SDS)购于鼎国生物公司；ECL化学发光试剂盒属于 Pierce公司；X光片购自柯达公司。
[0032] 实施例1质粒转染
[0033] 质粒构建
[0034] 1、pcDNA4-Myc-His_Bardl 质粒的构建
[0035] 将BARD1的开放阅读框架（即0RF)利用聚合酶链反应（即PCR)技术进行基 因扩增，其中模板为Hela细胞的cDNA(含有BARD1的开放阅读框架核苷酸序列，NCBI : NM_000465. 2)，上下游引物分别命名为ΚρηΙ-Kozak-hBardl-l，核苷酸序列为
[0036] 5'CGGGGTACCGCCACCATGCCGGATAATCGGCAGCCGAGG3'（SEQ ID NO :1)，
[0037] XbaI-hBardl-2,核昔酸序列为
[0038] 5, GCTCTAGAGCTGTCAAGAGGAAGCAACTC3'（SEQ ID NO :2)。
[0039] 用NEB公司的高保真DNA聚合酶phusion酶进行BARD1基因的特异性扩增，然后 用两种限制性核酸内切酶Kpnl、Xbal切割扩增出的BARD1基因，同时用这两种限制性内切 酶切割pcDNA4_cMyc_His载体（购自invitrogen公司），之后用NEB公司的T4DNA连接酶 连接切好的BARD1基因和载体，鉴定出连接正确的质粒后送三博DNA测序公司进行质粒测 序，选择测序正确的pcDNA4-Myc-His-Bardl质粒（图1)进行实验研究。
[0040] 2、pcDNA3. 1-V5-His-BARD1 质粒的构建
[0041] 利用聚合酶链反应（即PCR)技术进行BARD1开放阅读框架基因扩增，以 pcDNA4-Myc-His-Bardl质粒为模板，上下游引物分别为：
[0042] KpnI-Kozak-hBardl-1，核苷酸序列为
[0043] 5' CGGGGTACCGCCACCATGCCGGATAATCGGCAGCCGAGG3'（SEQ ID NO :3)
[0044] XbaI-hBardl_2dg，核昔酸序列为
[0045] 5, GCTCTAGACTGTCAAGAGGAAGCAACTC3'（SEQ ID NO :4)。
[0046] 用NEB公司的高保真DNA聚合酶phusion酶进行BARD1基因的特异性扩增，然后 用两种限制性核酸内切酶Kpnl、Xbal切割扩增出的BARD1基因，同时用这两种限制性内切 酶切割pcDNA3. 1-T0P0-V5载体（购自invitrogen公司），再用NEB公司的T4DNA连接酶连 接切好的BARD1基因和载体，鉴定出连接正确的质粒后送三博DNA测序公司进行质粒测序， 选择测序正确的pcDNA3. 1-V5-His-BARD1质粒（图2)进行实验研究。
[0047] 3、pCMV-Tag2A-Flag_BARDl 质粒的构建
[0048] 利用聚合酶链反应（即PCR)技术进行BARD1开放阅读框架基因扩增，模板为 pcDNA4-Myc-His_Bardl质粒，上下游引物分别为：
[0049] XhoI-hBardl-Ι :5, CCGCTCGAGGCCGGATAATCGGCAGCCGAGG3,（SEQ ID NO :5)，
[0050] XhoI-hBardl-2 :5' CCGCTCGAGTCAGCTGTCAAGAGGAAGCAA3'（SEQ ID NO :6)。
[0051] 用高保真DNA聚合酶phusion酶进行BARD1基因的特异性扩增，然后用一种限制 性核酸内切酶Xhol切割扩增出的BARD1基因，同时用Xhol切割pCMV-Tag2A-Flag载体（购 自Stratagene公司），再用T4DNA连接酶连接切好的BARD1基因和载体，鉴定出连接正确的 质粒后送三博DNA测序公司进行质粒测序，选择测序正确的pCMV-Tag2A-Flag-BARDl质粒 (图3)进行实验研究。
[0052] 4、pCDNA3. l-Flag-HA 质粒的构建
[0053] 以 p0Z_N 质粒（Shao G，Patter son-Fort in J，Me ss i ck T E，et al. MERIT40controls BRCAl_Rap80 complex integrity and recruitment to DNA double-strand breaks [J]· Genes Dev. 2009, 23 (6) :740-754)为模板，上下游引物分别 为：
[0054] NheI-FN-1 ：
[0055] 5' AGTCTTGCTAGCCTGCCAGATCTTCCGCTCGAT3'
[0056] (SEQ ID NO:7)，
[0057] ApaI-FN-2 ：
[0058] 5' ATCCGGGCCCTCCTCCGGCGTAGTCGGGCAC3'
[0059] (SEQ ID NO :8)。
[0060] 利用聚合酶链反应扩增出Flag和HA双标签的核苷酸序列，其中，
[0061] Flag标签的核苷酸序列为：
[0062] ATGG ACTACAAGGA CGACGATGAC AAG(SEQ ID NO ：9)
[0063] HA标签的核苷酸序列为：
[0064] TACCC CTACGACGTG CCCGACTACG CC(SEQ ID NO ：10)
[0065] 然后用限制性核酸内切酶Nhel和Apal切割扩增出的Flag-HA基因和载体 PCDNA3. 1 (invitrogen)，再用T4DNA连接酶连接切好的Flag-HA基因和载体，鉴定出连接正 确的质粒后送三博DNA测序公司进行质粒测序，选择测序正确的p⑶NA3. l-Flag-HA质粒 (图4a)进行实验研究。
[0066] 5、pCDNA3. Ι-Flag-HA-HUWEl 质粒的构建
[0067] 以pcDNA3. l/V5-His-Top〇-HUWEl质粒为模板，上下游引物分别为：
[0068] NotI-hHuwel-Ι ：
[0069] 5, ATAAGAATGCGGCCGCTGAAAGTAGACAGGACTAAACTG 3,（SEQ ID NO :11)，
[0070] NotI-hHuwel-2 ：
[0071] 5, ATAAGAATGCGGCCGCTTAGGCCAGCCCAAAGCCTTC3,（SEQ ID NO :12)。
[0072] 利用聚合酶链反应扩增出HUWE1的开放阅读框架核苷酸序列，然后用一种限制性 核酸内切酶Notl切割扩增出的HUWE1基因和质粒载体p⑶NA3. l-Flag-ΗΑ(图4a)，再用 T4DNA连接酶连接切好的HUWE1基因和载体，鉴定出连接正确的质粒后送三博DNA测序公司 进行质粒测序，选择测序正确的P⑶NA3. Ι-Flag-HA-HUWEl质粒（图4b)进行实验研究。
[0073] 6、pEYFP_HUWEl 质粒的构建
[0074] 以pcDNA3. l/V5-His-Top〇-HUWEl质粒为模板，上下游引物分别为：
[0075] BglII-hHuwel-Ι ：
[0076] 5, GAAGATCTAAAGTAGACAGGACTAAACTGAAG3,（SEQ ID NO :13)，
[0077] SacII-hHuwel-2 ：
[0078] 5, TCCCCGCGG TTAGGCCAGCCCAAAGCCTTC3'（SEQ ID NO :14)。
[0079] 利用聚合酶链反应扩增出HUWE1的开放阅读框架核苷酸序列，然后用两种限制性 核酸内切酶Bglll、SacII切割扩增出的HUWE1基因和载体pEYFP (购自Clontech公司）， 再用T4DNA连接酶连接切好的HUWE1基因和载体，鉴定出连接正确的质粒后送三博DNA测 序公司进行质粒测序，选择测序正确的PEYFP-HUWE1质粒（图5)进行实验研究。
[0080] 质粒转染过程
[0081] 1、细胞传代
[0082] 超净台台面应整洁，并用0. 1%新洁尔灭溶液擦净；打开超净台的紫外灯照射台 面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧；人进入无菌室之前 穿无菌衣、戴无菌手套、换无菌间用拖鞋、戴无菌口罩，并用75%酒精擦拭消毒。点燃酒精 灯；取出无菌试管，尖头吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管 内。将装有胰蛋白酶、PH7. 4工作浓度的磷酸盐缓冲液（PBS)、新鲜DMEM培养基的玻璃瓶分 别用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后放置于无菌超净台方便取用之处；倒置显微镜下观察 细胞形态，选择生长状态良好、细胞的汇合度达到约90-95%的细胞进行消化、传代；吸掉 培养细胞的旧培养基，酌情可用2-3mL PH7.4工作浓度的磷酸盐缓冲液（PBS)洗去残留的 旧培养基；每个25平方厘米的培养瓶加入1. 5mL胰蛋白酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒 置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后加入新鲜 的DMEM培养基中和胰蛋白酶的消化作用；用无菌尖吸管反复轻轻吹打消化好的细胞使其 脱壁并分散，转移至10mL的尖头离心管中，1000转/分钟，离心5分钟；弃掉上清液，加入 lmL新鲜的培养基重新悬浮细胞。
[0083] 2、种植待转染的细胞
[0084] 经过消化、离心后的细胞重新悬浮于lmL新鲜培养基后，按照不同的传代比例 (HEK293T 细胞 1 : 2.5、Hela 细胞 1 : 3、HCT116P53+/+及 HCT116P53-/-细胞 1 : 2.5、 MCF7细胞1 : 2. 5)，将细胞分散种植于6孔平板中，使得各种细胞在12-16小时之后细胞 汇合度达到85-90%。每个6孔平板的孔补加新鲜培养基至2mL。所有细胞均在5%的二氧 化碳、湿度合适的37°C培养箱进行培养。
[0085] 3、用脂质体法将质粒转染至细胞
[0086] 种植细胞12-16小时之后，用脂质体转染试剂（脂质体2000)将质粒转染 至细胞中。对于汇合度达到85 %至90 %，面积为10平方厘米的HEK293T、Hela细 胞、MCF7细胞，HCT116 P53+/+及HCT116 P53-/-细胞来说，单独转染BARD1质 粒（pcDNA3. 1-V5-His-BARD1)时所需质粒的量为1.2yg至4yg;当BARD1质粒与 HUWE1 质粒共转染时（包括 pCDNA4-Myc-His-BARDl 与 pCDNA3. Ι-Flag-HA-HUWEl 质 粒共转染；pCMV-Tag2A-Flag-BARDl 与 pcDNA3. l/V5-His-Topo_HUWEl 质粒共转染； pCMV-Tag2A-Flag-BARDl与pEYFP-HUWEl质粒共转染），所需BARD1的质粒量为1 μ g至 2 μ g，所需HUWE1的质粒量为2. 5 μ g至4 μ g。转染过程如下：对于6孔板的一个孔而言（即 一个孔是10平方厘米，每个孔的细胞汇合至约85-90% )，先分别取250 μ 1无血清的细胞 培养液两管，其中一管加入待转染的质粒（单独转染BARD1质粒时直接在250 μ 1无血清的 细胞培养液中加入BARD1质粒；当BARD1质粒与HUWE1质粒共共转染时则分别取两种质粒 所需的体积，如要转染〇. 5 μ gBARDl质粒，其质粒浓度为0. 25 μ g/ μ 1，则取2 μ 1 BARD1质 粒，加入到250 μ 1无血清的细胞培养液中混匀；而同时需共转染2. 0 μ g HUWE1质粒，其浓 度为〇. 5 μ g/ μ 1，则取4 μ 1 HUWE1质粒，加入到已含有0. 5 μ g BARD1质粒的250 μ 1无血 清的细胞培养液中，然后再轻轻混匀），用lmL量程的微量移液器轻轻上下混匀后放置；另 一管250 μ 1无血清的细胞培养液则按照脂质体转染试剂（脂质体2000)的说明书取10 μ 1 脂质体加入其中，轻轻混匀。将分别含有质粒和脂质体的两管250 μ 1无血清的细胞培养液 单独混匀后室温放置5分钟，然后将两者轻轻混合，室温孵育30分钟。最后加入到已经种 植好的细胞汇合度达到85%至90%的10平方厘米的孔板细胞中。为了降低实验操作的干 扰以及验证实验的可靠性，同样的实验同时做三份，将细胞放在5%的二氧化碳、湿度合适 的37°C培养箱进行培养。4-6小时后给转染过的细胞换新鲜的DMEM培养基，防止转染试剂 对细胞的毒性作用。48小时后收获转染的细胞。RIPA裂解液裂解细胞，一式三份，聚丙烯 酰胺凝胶电泳后用相关的HUWE1抗体标签、BARD1抗体标签进行免疫印迹分析（IB)。
[0087] 实施例2检测转染细朐中HUWE1等蛋白的表汰水平
[0088] 本实施例采用的检测方法
[0089] 1、细胞裂解液的制备和总蛋白质的提取
[0090] 单独转染BARD1或共转染BARD1与HUWE1至相应细胞，转染48小时之后收获细胞， 首先用磷酸盐缓冲液PBS漂洗2次，经0. 25%胰蛋白酶消化、用含有血清的DMEM培养基中 和胰酶的消化作用。1000转/分钟离心5分钟，弃上清，PBS清洗细胞细胞沉淀2次，再离 心，弃上清液。在细胞沉淀中加入适量预冷的RIPA细胞裂解液（150mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8.0，l%乙基苯基聚乙二醇（NP-40)，0. 1%十二烷基磺酸钠（SDS))。为防止蛋白质降解， 加入蛋白酶抑制剂（包括苯甲基磺酰氟（PMSF)、Cocktail (P8340)及蛋白酶抑制剂的片剂 1片/50ml，购自sigma公司），裂解完的样品在台式冷冻离心机上于4°C，13000rpm离心20 分钟，以去除未完全裂解的细胞碎片。将上清吸入新的Ep管中，即为总蛋白，接着测定上清 液的蛋白质浓度，取500 μ 1的Bradford染液与500 μ 1去离子水混匀，加入2 μ 1离心好的 蛋白质上清液，充分混匀，反应10分钟后用紫外分光光度计测定595nm处的蛋白质的吸光 度值即0D 59W根据已有的标准曲线公式计算出蛋白质的浓度，单位为μ g/μ 1，计算出上样 40 μ g蛋白所需的各种不同样品的体积，并加入含2% SDS的加样缓冲液，100°C煮5分钟， 一式三份，备用。
[0091] 2、蛋白质免疫印迹分析（Immunobloting，Western Bloting analyses，IB)
[0092] 聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE):电泳采用3?10%的分离胶，恒压80V/120V。 检测BARD1、HUWE1需采用1. 5mm的厚胶。电泳后的凝胶转移至硝酸纤维素（NC)膜采用 350mA恒流，持续2. 5?3小时。转膜后在含有5%脱脂牛奶的PBST缓冲液中封闭60分钟。 封闭后室温一抗孵育3小时或4°C过夜，再用PBST缓冲液洗膜三次，每次10分钟，然后和 耦联HRP的二抗室温孵育1小时。其中，用于检测内源性HUWE1蛋白的抗体有：兔种属来源 的HUWE1抗体（abeam公司）；用于检测外源性HUWE1蛋白的抗体有：兔种属来源的V5标签 抗体（MBL公司），鼠种属来源的HA标签抗体（convance公司），鼠种属来源的绿色荧光蛋 白GFP抗体（sigma公司）；用于检测过表达的BARD1的抗体有：兔种属来源的V5标签抗体 (MBL公司），属来源的Flag标签抗体（sigma公司），属来源的BARD1抗体（abeam公司）， 属来源的Myc标签抗体（abeam公司），兔种属来源的一抗用山羊抗兔的二抗进行杂交，鼠 种属来源的一抗用山羊抗鼠的二抗进行杂交。最后经PBST洗膜三次后，用ECL化学发光试 剂盒（Pierce)按照厂家说明书操作，用X光片依次进行化学发光、曝光、显影。蛋白印迹 (Western Blot)检测的蛋白质主要有HUWE1 (及带有不同载体标签的HUWE1)、BARD1 (及带 有不同载体标签的BARD1)、内参微管蛋白（Tublin)等。
[0093] 检测结果
[0094] 如图6所示，在HCT116 P53+/+及HCT116 P53-/-细胞中过表达 pcDNA3. 1-V5-His-BARD1质粒之后，内源性HUWE1蛋白水平下调。且随着BARD1量的递增， HUWE1的蛋白水平逐渐下调。
[0095] 如图7所示，在拖1&细胞中过表达？0)嫩4-]\^(3-把8-841?1与 PCDNA3. Ι-Flag-HA-HUWEl质粒之后，共表达质粒的外源性HUWE1蛋白水平下调，且随着 BARD1量的递增，HUWE1的蛋白水平逐渐下调。
[0096] 如图 8 所示，在 293T 细胞中过表达 pCMV-Tag2A-Flag-BARDl 与 pcDNA3. 1/ V5-His-Top〇-HUWEl质粒之后，共表达质粒的外源性HUWE1蛋白水平下调。
[0097] 如图 9 所示，在 293T 细胞中过表达 pCMV-Tag2A-Flag-BARDl 与 pEYFP-HUWEl 质粒 之后,共表达质粒的外源性HUWE1蛋白水平下调。
[0098] 如图10所示，在MCF7细胞中过表达pcDNA3. 1-V5-His-BARD1与 PCDNA3. Ι-Flag-HA-HUWEl质粒之后，共表达质粒的外源性HUWE1蛋白水平下调。
[0099] 实施例3合成siRNA序列
[0100] 根据BARD1的核苷酸序列（NCBI序列登录号：NM_000465. 2)设计针对BARD1基因 的siRNA序列，并由invitrogen公司合成。得到的siRNA序列为：
[0101] siBardl-2 :GCUGCUCGCGUUGUACUAA(SEQ ID NO :15)
[0102] siBardl-3 :GGUUUAGCCCUCGAAGUAA(SEQ ID NO :16)
[0103] 实施例4siRNA转染
[0104] 种植MCF10F细胞12-16小时之后，细胞汇合至35%，状态良好，符合siRNA转染的 要求。保证转染siRNA过程中所用到的液体、微量移液器的枪头等均没有RNA酶的污染，以 免siRNA被RNA酶所降解，影响敲低BARD1的效果。我们合成了两个BARD1的干扰RNA，分 别为 siBARDl-2 及 siBARDl-3,用 invitrogen 公司的不含 RNA 酶的 DEPC 水溶解 siBARDl-2 及siBARDl-3,使其终浓度达到20 μ M/L。siRNA的转染过程如下：
[0105] 对于6孔板的规格，对细胞汇合度达到35 %，面积约为10平方厘米的MCF10F细 胞，分别用4 μ 1至6 μ 1 20 μ M/L的siBARDl-2、siBARDl-3及一个对照siRNA进行干扰。过 程如下：先分别取250 μ 1无血清的细胞培养液放到三个1. 5mL EP管中，分别加入4 μ 1至 6 μ 1浓度为20 μ M/L的siBARDl-2、siBARDl-3及对照干扰RNA，用枪头充分混匀，室温放置 5分钟。再取一个EP管，加入750 μ 1无血清的细胞培养液，然后取18 μ 1转染干扰RNA的 试剂（脂质体RNAiMAX)加入其中，轻轻混匀，室温放置5分钟。5分钟之后，将750 μ 1含有 18 μ 1脂质体RNAiMAX的无血清细胞培养液一分为三，均等的分别加入到含有siBARDl-2、 siBARDl-3及对照干扰RNA的EP管中，用枪头充分混匀，室温放置25分钟。然后直接加入 到种植好的MCF10F细胞中，将细胞放在5%的二氧化碳、湿度合适的37°C培养箱进行培养。 为了降低实验操作的干扰以及验证实验的可靠性，同样的干扰实验同时做三份，6小时后给 转染过的细胞换新鲜的DMEM培养基，防止转染试剂对细胞的毒性作用。72小时后收获转染 的细胞，RIPA裂解液裂解细胞，一式三份，聚丙烯酰胺凝胶电泳后用HUWEUBARD1抗体进行 免疫印迹分析（IB)。
[0106] 实施例5检测转染细朐中HUWE1等蛋白的表汰水平
[0107] 检测方法与实施例2所采用的方法相同。结果见图11，显示MCF10F细胞中用 siRNA敲低BARD1基因表达，则检测到内源性HUWE1的蛋白水平上调。
[0108] 蛋白印迹分析结果证明，在HCT116 P53+/+细胞、HCT116 P53-/-细胞、MCF7细胞、 Hela细胞及HEK293T细胞中，过表达含有BARD1核苷酸序列的几种质粒后，内源性HUWE1的 蛋白水平被下调（图6)，外源性过表达的HUWE1的蛋白水平也均被下调（图7至图10)。且 在MCF10F细胞中，干扰BARD1的mRNA的表达，下调其蛋白表达，则使细胞内HUWE1的蛋白 水平上调（图11)。总之，改变细胞内BARD1的水平可相应调节癌蛋白HUWE1的表达水平， 这将会在肿瘤的治疗中发挥很大的作用。
[0109] 以上实施例仅仅用于对本发明进行举例说明，并不对本发明的保护范围构成任何 限定。此外，尽管本发明说明书中结合具体实施例对本发明进行说明，但是，本领域的普通 技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行各种修改或者等同变换，在不脱离本发 明实质的前提下，任何修改或等同变换仍落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种调节细胞内HUWE1的表达水平的方法，所述方法包括通过调节细胞内BARD1的 表达水平来调节细胞内HUWE1的表达水平。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，所述调节细胞内BARD1的表达水平通过用含有编 码BARD1的核苷酸的表达质粒转染所述细胞来实施，从而使所述细胞中的HUWE1的表达水 平降低。
3. 如权利要求2所述的方法，其中，所述细胞为HCT116 P53+/+细胞、HCT116 P53-/-细 胞、MCF7细胞、Hela细胞或HEK293T细胞，所述含有编码BARD1的核苷酸的表达质粒为 pcDNA3. 1-V5-His-BARD1 质粒、pCDNA4-Myc-His-BARDl 质粒或 pCMV-Tag2A-Flag-BARDl 质 粒。
4. 如权利要求2所述的方法，其中，所述HUWE1为内源蛋白，所述转染为用含有编码 BARD1的核苷酸的表达质粒单独转染所述细胞。
5. 如权利要求4所述的方法，其中，所述细胞的汇合度为85%至90%，所述质粒的量为 1. 2μ g/ΙΟ平方厘米细胞至4μ g/ΙΟ平方厘米细胞。
6. 如权利要求2所述的方法，其中，所述HUWE1为外源蛋白，所述转染为用含有编码 BARD1的核苷酸的表达质粒与含有编码HUWE1的核苷酸的表达质粒共转染所述细胞。
7. 如权利要求6所述的方法，其中，所述细胞的汇合度为85%至90%，所述含有编码 BARD1的核苷酸的表达质粒的量为1 μ g/ΙΟ平方厘米细胞至2μ g/ΙΟ平方厘米细胞，所述含 有编码HUWE1的核苷酸的表达质粒的量为2. 5 μ g/ΙΟ平方厘米细胞至4 μ g/ΙΟ平方厘米细 胞。
8. 如权利要求6所述的方法，其中，所述含有编码HUWE1的核苷酸的表达质粒为 PCDNA3. Ι-Flag-HA-HUWEl 质粒、pcDNA3. l/V5-His-Topo_HUWEl 质粒或 pEYFP-HUWEl 质粒。
9. 如权利要求1所述的方法，其中，所述调节细胞内BARD1的表达水平通过用BARD1的 siRNA转染所述细胞来实施，从而使所述细胞中HUWE1的表达水平提高。
10. 如权利要求9所述的方法，其中，所述细胞为MCF10F细胞，其汇合度为35% ;所述 siRNA的序列为SEQIDN0:15或SEQIDN0:16，其量为80Xl(Γ6μM/10平方厘米细胞至 120X 1(Γ6 μ M/10平方厘米细胞。
【文档编号】C12N5/10GK104140954SQ201310167863
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月9日 优先权日:2013年5月9日
【发明者】邵根泽, 王晓珍, 朱柏力, 李莉, 杨华, 林明, 张沙, 周柔丽, 严考文, 易娟, 卢广, 匡静宇, 丁羚昱, 漆豪, 王亚清 申请人:北京大学