人aurka基因治疗肿瘤的用途及其相关药物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体公开了单独的人AURKA基因；以及人AURKA基因与人EGFR基因作为协同施药靶标，在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。本发明还进一步构建了AURKA基因小干扰RNA、AURKA基因干扰慢病毒载体、AURKA基因干扰慢病毒，并公开了他们在与EGFR基因协同治疗肿瘤中的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的慢病毒载体、慢病毒能够特异性抑制人AURKA基因和/或人EGFR基因的表达，尤其是慢病毒，本发明的AURKA基因干扰慢病毒能单独、或者与EGFR基因干扰慢病毒协同抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
【专利说明】人AURKA基因治疗肿瘤的用途及其相关药物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地涉及单独的人AURKA基因；以及人AURKA基因和 人EGFR基因协同治疗肿瘤的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002] 目前肿瘤的基因治疗已经取得了蓬勃快速的发展，但是迄今为止，仍然存在很多 需要解决的问题。目前用于肿瘤基因治疗的基因太少，能抑制肿瘤生长的基因为数不多，急 需提供更多可利用的基因。另外，由于肿瘤的发生、发展、转移等过程是一个多基因参与、涉 及多条信号通路的复杂网络系统，因此单个基因治疗或单一治疗方法往往疗效有限。因此， 未来基因治疗发展的重点将在于挖掘并鉴定在临床上有重要价值的基因，探索多个具有不 同抗肿瘤作用机理的基因联合治疗以及将多基因靶向药物联合治疗等。
[0003] AURKA基因编码一个进化上保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，是Aurora激酶家 族成员之一。在有丝分裂中，AURKA通过参与中心体的分离和成熟以及纺锤体两极的 建立，确保有丝分裂中染色体的正确分离和胞质分裂的顺利完成，在细胞周期中起着 重要作用。AURKA的异常扩增和/或高表达常见于多种人类肿瘤（KamadaK，Yamada Y， Hirao T, et al. Amplification/overexpression of Aurora-A in human gastric careinoma:Potential role in differentiated tyPe gastric eareinogenesis. Oncol Rep. 2004:12(3):593-599.)。近年来的研究表明，AURKA可参与多条重要的细胞信号通路， 作为激酶直接或间接地激活多种致癌蛋白、或使多种抑癌蛋白失活，从而推动肿瘤的发生 发展。有研究发现AURKA siRNA抑制HEP-2细胞中AURKA基因表达后，喉癌HEP-2细胞移植 瘤在裸鼠皮下的生长速度较对照组显著下降，肿瘤接种后28天，肿瘤的平均重量也较对照 组显著降低，说明AURKA基因沉默能抑制喉癌细胞在体内的生长。Hata和Tanaka的研究发 现，抑制胰腺癌和食管癌细胞株中的AURKA基因后，接种至裸鼠后形成的肿瘤明显缩小甚 至完全抑制（Hata T，FurukawaT，Sunamura M，etal. RNA interference targeting aurora kinase a suppresses tumor growth and enhanees the taxane chemosensitivity in human Pancreatic cancer cells. Caneer Res. 2005;65(7) :2899-905. Tanaka E， Hashimoto Y，Ito T, etal. The suPPression of aurora-A/STK15/BTAK expression enhances chemosensitivity to docetaxel in human esophageal squamous cell carcinoma. Clin Caneer Res. 2007; 13 (4) : 1331-40.)，这些结果均提不 AURKA 高表达与体 内的成瘤能力显著相关。因此，AURKA是肿瘤治疗潜在的理想靶标。
[0004] 表皮生长因子受体（epidermalgrowth factor receptor，EGFR) EGFR 是一种跨膜 蛋白质，属于ErbB受体家族成员，其配体（EGF、TGF-a等）与EGFR胞外段结合使之二聚 化，由此导致胞内段酪氨酸激酶活化以及一系列信号转导的级联反应，促进细胞增殖，血管 生成，转移并抑制细胞凋亡(梁后杰，邹岚.EGFR靶向药物治疗晚期结直肠癌最新进展.中 国处方药2009;84:58-61.)，从而导致肿瘤的发生。大量研究发现EGFR基因在多种肿瘤组 织中过表达或异常活化，从而使肿瘤细胞增殖、侵袭和转移能力增强。EGFR已成为经临床 验证的多种类型肿瘤的治疗祀点（Ciardiello F, Tortora G. EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med2008;358:1160-1174. )〇
[0005] RNAi是利用双链RNA介导的序列特异性的转录后基因沉默现象，已成为研究 基因功能的一种新兴的有效手段，并有望成为肿瘤等疾病基因治疗的工具（Izquierdo M.Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy.Cancer Gene Ther. 2005; 12(3) :217-27.)。慢病毒（Ientivirus)载体是高效的基因转导工具，主要用于 感染对常规方法转染效率较低的细胞，如原代细胞等。慢病毒颗粒可同时感染增殖和非增 殖的细胞，且感染比较稳定、持久。运用慢病毒载体，可实现特定基因的高表达，也可以表 达发夹结构 RNA (short hairpin RNA，shRNA)以 RNA 干扰（RNA interference，RNAi)方式 下调某基因的表达。本发明拟采用慢病毒介导的RNAi技术研究AURKA基因在与EGFR基因 协同抑制肿瘤细胞增殖中的功能，为恶性肿瘤的非手术临床治疗提供理论依据。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于公开了 AURKA基因作为癌症治疗的靶标，治疗肿瘤的用途及其 相关药物；以及将AURKA基因和EGFR基因共同作为癌症治疗的靶标，通过同时沉默AURKA 基因和EGFR基因的表达，实现协同治疗肿瘤的用途，及其肿瘤治疗药物。
[0007] 本发明以RNA干扰为手段，研究了单独的AURKA基因在肿瘤发生和发展中的作用， 以及，AURKA基因与EGFR基因在肿瘤发生和发展中的协同作用，公开了一种抑制或降低肿 瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性 抑制AURKA基因和/或EGFR基因的转录、翻译，或能够特异性抑制AURKA蛋白和/或EGFR 蛋白表达的活性的物质，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化或存活。
[0008] 本发明第一方面，公开了分离的人AURKA基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者 在制备肿瘤诊断药物中的用途。
[0009] 本发明中，所述人AURKA基因作为针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备或筛选肿 瘤治疗药物，或者制备肿瘤诊断药物。进一步的，所述针对肿瘤细胞的作用祀标为RNA干扰 作用靶标。
[0010] 所述将分离的人AURKA基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其 一，将人AURKA基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物； 其二，将人AURKA基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药 物。
[0011] 所述将AURKA基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治 疗药物具体是指：将AURKA基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制 齐U，从而提高或降低肿瘤细胞内AURKA基因的表达水平。
[0012] 所述将AURKA基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治 疗药物具体是指：将AURKA基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或 促进人AURKA基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的AURKA基因小分子 干扰RNA (SiRNA)即是以人AURKA基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞 增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将AURKA基因及其蛋白作为 作用对象。
[0013] 所述将AURKA基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将AURKA基因表达产物作为一项 肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
[0014] 所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制AURKA基因的转录或翻译，或能够特异性抑 制AURKA蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中AURKA基因的表达水平，达到抑制 肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
[0015] 所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人AURKA基因的表达相关的任意一种肿 瘤；更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自：肺癌或结肠癌。
[0016] 本发明第一方面，还公开了分离的人AURKA基因和人EGFR基因在制备或筛选肿瘤 治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
[0017] 本发明中，所述人AURKA基因和人EGFR基因作为针对肿瘤细胞的作用靶标应用于 制备或筛选肿瘤治疗药物，或者制备肿瘤诊断药物。进一步的，所述针对肿瘤细胞的作用靶 标为RNA干扰作用靶标。
[0018] 所述将分离的人AURKA基因和人EGFR基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两 方面的内容：其一，将人AURKA基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶 标应用于制备肿瘤治疗药物；其二，将人AURKA基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿 瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物。
[0019] 所述将人AURKA基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应 用于制备肿瘤治疗药物具体是指：将AURKA基因和人EGFR基因共同作为RNA干扰作用的 靶标，研制能同时针对两种基因的肿瘤治疗药物或制剂，从而提高或降低肿瘤细胞内AURKA 基因和人EGFR基因的表达水平；或者，将AURKA基因和人EGFR基因分别作为RNA干扰作 用的靶标，来研制分别针对两种基因的肿瘤治疗药物，从而获得能提高或降低肿瘤细胞内 AURKA基因和人EGFR基因表达水平的肿瘤治疗药物或制剂。
[0020] 所述将人AURKA基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应 用于筛选肿瘤治疗药物具体是指：将人AURKA基因和人EGFR基因同时作为作用对象，对药 物进行筛选，以找到可以分别影响(抑制或促进)人AURKA基因表达的药物和影响(抑制或促 进）人EGFR基因表达的药物，然后作为肿瘤治疗备选组合物药物；或者找到可以同时影响 (抑制或促进）人AURKA基因和人EGFR基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明 所述的AURKA基因小分子干扰RNA (siRNA)、基因干扰核酸构建体、慢病毒，以及EGFR基因 小分子干扰RNA (siRNA)、基因干扰核酸构建体、慢病毒，均是以AURKA基因和EGFR基因分 别为作用对象筛选获得的；当它们共同使用时，存在协同作用的效果，比单一一种物质的使 用效果更好；可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子 药物等也可将人AURKA基因和人EGFR基因及其蛋白作为作用对象。
[0021] 所述将人AURKA基因和人EGFR基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将AURKA基因表 达产物和人EGFR基因表达产物作为肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断试剂的制备。
[0022] 本发明的所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制人AURKA基因和/或人EGFR基因 的转录或翻译，或能够特异性抑制人AURKA基因和/或人EGFR基因的表达或活性的分子， 从而降低肿瘤细胞人AURKA基因和/或人EGFR基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增 殖、生长、分化、存活的目的。
[0023] 本发明制备或筛选的肿瘤治疗药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、 小分子化学药(例如抑制剂)、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0024] 所述核酸分子包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸内 切酶ΠΙ制备的小干扰RNA (esiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。
[0025] 所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人AURKA基因和人EGFR基因的转录或翻 译，或者足够降低人AURKA蛋白和人EGFR蛋白的表达或活性的剂量。以使人AURKA基因和 人EGFR基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0026] 本发明中，当人AURKA基因和人EGFR基因作为协同施药靶标进行肿瘤治疗和药物 筛选时，是通过RNA干扰的方法，以人AURKA基因和EGFR基因作为RAN干扰的靶基因，降低 这两个基因的表达水平。
[0027] 所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人AURKA基因和人EGFR基因的表达相关 的任一种肿瘤；更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自：肺癌或结肠癌。
[0028] 采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法是通过单独降低人AURKA基因的表达水 平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的，或者通过同时降低人AURKA基因和人EGFR基 因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人 AURKA基因表达水平的物质；或者，将能有效降低人AURKA基因和人EGFR基因表达水平的 物质给药于患者。
[0029] 本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中AURKA基因表达的分离的核酸分子， 所述核酸分子包含：
[0030] b) AURKA基因双链RNA，所述AURKA基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与 AURKA基因杂交的核苷酸序列；或者
[0031] c) AURKA基因 shRNA，所述AURKA基因 shRNA中含有能够在严紧条件下与AURKA基 因杂交的核苷酸序列。
[0032] 较优的，所述AURKA基因双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链 互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与AURKA基因的靶序列基本相同。
[0033] 较优的，所述AURKA基因 shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义 链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所 述正义链片段的序列与AURKA基因的靶序列基本相同。
[0034] 更优的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0035] 更优的，所述AURKA基因的靶序列，为SEQ ID NO: 1所示序列。
[0036] 所述AURKA基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默AURKA基因表达时，与所述 siRNA互补结合的mRNA片段所对应的AURKA基因中的片段。
[0037] 所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为 19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。
[0038] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA (siRNA)。
[0039] 最优的，AURKA基因小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID N0:9所示，具体为 5' -GAAAGCUCCACAUCAAUAA-3'。SEQ ID NO :9 所示的 AURKA 基因 siRNA 的第一链为以 SEQ ID NO: 1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的针对人AURKA基因的小干扰RNA中的一条链， 该第一链与第二链组成的siRNA能够起到特异性沉默肿瘤细胞中内源AURKA基因表达的作 用。
[0040] 最优的，所述AURKA基因 ShRNA的序列如SEQ ID NO: 11所示，具体为： 5, -caGAAAGCUCCACAUCAAUAA CUCGAGUUAUUGAUGUGGAGCUUUCUG-3，。
[0041] 本发明第三方面，公开了一种AURKA基因干扰核酸构建体，含有编码前述分离的 核酸分子中的AURKA基因 shRNA的基因片段，能表达所述AURKA基因 shRNA。
[0042] 更优的，所述AURKA基因干扰核酸构建体为AURKA基因干扰慢病毒载体。
[0043] 所述AURKA基因干扰慢病毒载体是将编码前述AURKA基因 shRNA的DNA片段克隆 入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述AURKA基因干扰慢病毒载体经过病 毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出所述shRNA，通过酶切加工 等步骤，最终获得所述AURKA基因小干扰RNA，用于特异性沉默AURKA基因的表达。
[0044] 编码所述AURKA基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 1所示序列及其 互补序列。
[0045] 进一步的，所述AURKA基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤 细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白 (GFP) 0
[0046] 进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.1-CMV-Ne。、 pLKO.1-Ne。、 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAL 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。
[0047] 本发明第四方面，公开了一种AURKA基因干扰慢病毒，由前述AURKA基因干扰核酸 构建体中的AURKA基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包 装而成。
[0048] 本发明的慢病毒药物可感染肿瘤细胞并产生针对AURKA基因的小分子干扰RNA， 从而抑制肿瘤细胞的增殖。该AURKA基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。 [0049] 本发明第五方面，公开了一种用于治疗肺癌或结肠癌的药物组合物，其有效物质 含有前述降低肿瘤细胞中AURKA基因表达的分离的核酸分子、AURKA基因干扰核酸构建体、 AURKA基因干扰慢病毒中的至少一种。
[0050] 较优的，所述治疗肺癌或结肠癌的药物组合物，其有效成分还包括降低肿瘤细胞 中EGFR基因表达的分离的核酸分子、EGFR基因干扰核酸构建体、以及EGFR基因干扰慢病 毒中的至少一种。
[0051] 更优的，所述AURKA基因干扰核酸构建体为AURKA基因干扰慢病毒载体。
[0052] 进一步的，所述降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子为：
[0053] I) EGFR基因双链RNA，所述EGFR基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与EGFR 基因杂交的核苷酸序列；或者
[0054] 2) EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能够在严紧条件下与EGFR基因 杂交的核苷酸序列。
[0055] 优选的，所述EGFR基因双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链 互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与EGFR基因的靶序列基本相同。
[0056] 优选的，所述EGFR基因 ShRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义 链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所 述正义链片段的序列与EGFR基因的靶序列基本相同。
[0057] 更优选的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0058] 更优选的，所述EGFR基因的靶序列，为SEQ ID NO: 2所示序列。
[0059] 所述EGFR基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默EGFR基因表达时，与所述 siRNA互补结合的mRNA片段所对应的EGFR基因中的片段。
[0060] 所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为 19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。
[0061] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA (siRNA)。
[0062] 最优选的，EGFR基因小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO :10所示，具体为 5' -GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3'。SEQ ID NO :10 所示的 EGFR 基因 siRNA 的第一链为以 SEQ ID NO: 2所示的序列为RNA干扰靶序列设计的针对人EGFR基因的小干扰RNA中的一条链， 该第一链与第二链组成的siRNA能够起到特异性沉默肿瘤细胞中内源EGFR基因表达的作 用。
[0063] 最优选的，所述EGFR基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 12所示，具体为： 5, -GUGGCUGGUUAUGUCCUCAUUCUCGAG AAUGAGGACAUAACCAGCCAC-3，。
[0064] 当用作治疗肿瘤的药物时，是将安全有效量的双链RNA、shRNA、或慢病毒施用于哺 乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之 内的。
[0065] 较优的，所述EGFR基因干扰核酸构建体为含有编码前述EGFR基因 shRNA的基因 片段，能表达所述EGFR基因 shRNA。
[0066] 更优的，所述EGFR基因干扰核酸构建体为EGFR基因干扰慢病毒载体。
[0067] 优选的，所述EGFR基因干扰慢病毒由EGFR基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质 粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
[0068] 更优的，所述EGFR基因干扰慢病毒载体含有编码前述分EGFR基因 shRNA的基因 片段，能表达所述EGFR基因 shRNA。
[0069] 编码所述EGFR基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 2所示序列及其 互补序列。
[0070] 本发明的药物组合物中，特异性沉默AURKA基因表达，以及特异性沉默EGFR基因 表达的有效成分发挥了协同治疗的作用；本发明实施例记载，双基因敲减后的癌细胞生长 抑制率明显大于单基因敲减组的加和，表明特异性沉默AURKA基因表达的物质与特异性沉 默EGFR基因表达的物质协同抑制肿瘤细胞的增殖。
[0071] 进一步的，本发明所述药物或药物组合物含有1?99wt%所述小干扰RNA、shRNA、 基因干扰核酸构建体和/或基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0072] 制备药物时，通常将有效成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或 药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为 赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭 菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶 纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂（如羟基苯 甲酸甲酯和丙酯）、甜味剂等。
[0073] 本发明的有益效果为：本发明提供的SiRNA或者包含该小干扰RNA序列的核酸构 建体、慢病毒能够特异性抑制人AURKA基因的表达，尤其是慢病毒，能单独，或者与EGFR靶 向慢病毒协同抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。本发 明中的AURKA基因即可以作为单独的肿瘤治疗靶标，也可以作为EGFR基因协同治疗靶标， 在肿瘤治疗中具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0074] 图 I :GV115 质粒 DNA 图谱
[0075] 图 2 :GV113 质粒 DNA 图谱
[0076] 图3 :AURKA shRNA质粒鉴定图
[0077] 1# :阴性对照（ddH20) ;2# :阴性对照（空载自连对照组）
[0078] 3# :Marker 自上而下依次为 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，lKb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0079] 4# ?8# :AURKA shRNAl-5 号转化子鉴定
[0080] 图4 :EGFR shRNA质粒鉴定图
[0081] 1# :阴性对照（ddH20)
[0082] 2# :阴性对照（空载自连对照组）
[0083] 3# :Marker 自上而下依次为 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，lKb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0084] 4# ?8# :EGFR shRNAl-5 号转化子鉴定
[0085] 图5 :AURKA shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同时浸染人肺癌H1299细胞5天 后，显著抑制细胞增殖
[0086] 图6 :AURKA shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同时浸染人结肠癌RKO细胞5天 后，显著抑制细胞增殖
【具体实施方式】
[0087] 下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制 本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条 件，如[美]Sambrook. J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社 2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0088] 实施例1针对人AURKA基因和EGFR基因 RNAi慢病毒的制备
[0089] 1.慢病毒载体构建
[0090] 1)构建针对人AURKA基因和EGFR基因的慢病毒载体
[0091] 从 Genbank 调取 AURKA (NM_177990)和 EGFR 基因（NM_201282)信息；利用上海吉 凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对AURKA基因和EGFR基因的有效的 siRNA靶点。初步筛选得到具有明显抑制AURKA基因表达功能的siRNA靶点序列（SEQ ID NO. 1)和明显抑制EGFR基因表达功能的siRNA靶点序列（SEQ ID NO. 2)。通过Genbank数 据库进行BLAST分析，确定其不对任何其它基因产生干扰作用。
[0092] 表IsiRNA靶点序列
【权利要求】
1. 分离的人AURKA基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用 途。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述人AURKA基因作为针对肿瘤细胞的作用 靶标应用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者制备肿瘤诊断药物。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述针对肿瘤细胞的作用靶标为RNA干扰作 用靶标。
4. 分离的人AURKA基因和人EGFR基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊 断药物中的用途。
5. -种降低肿瘤细胞中AURKA基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含： a) AURKA基因双链RNA，所述AURKA基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与AURKA基 因杂交的核苷酸序列；或者 b) AURKA基因 shRNA，所述AURKA基因 shRNA中含有能够在严紧条件下与AURKA基因杂 交的核苷酸序列。
6. 如权利要求5所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述AURKA基因双链RNA包含第 一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序 列与AURKA基因的靶序列基本相同；所述AURKA基因 shRNA包括正义链片段和反义链片段， 以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的 序列互补，并且所述正义链片段的序列与AURKA基因的靶序列基本相同。
7. 如权利要求6所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述AURKA基因的靶序列为SEQ ID NO: 1所示序列。
8. 如权利要求5-7任一权利要求所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为 小干扰RNA，并且AURKA基因小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO :9所示；所述AURKA基 因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 11所示。
9. 一种AURKA基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求5-8任一权利要求所述分离的 核酸分子中的AURKA基因 shRNA的基因片段，能表达所述AURKA基因 shRNA。
10. 如权利要求9所述的核酸构建体，其特征在于，所述AURKA基因干扰核酸构建体为 AURKA基因干扰慢病毒载体。
11. 一种AURKA基因干扰慢病毒，由权利要求10所述AURKA基因干扰核酸构建体中的 AURKA基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
12. -种治疗肺癌或结肠癌的药物组合物，其有效成分含有权利要求5-8任一权利要 求所述降低肿瘤细胞中AURKA基因表达的分离的核酸分子、权利要求9-10任一权利要求所 述AURKA基因干扰核酸构建体、以及权利要求11所述AURKA基因干扰慢病毒中的至少一 种。
13. 如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分还包 括降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子、EGFR基因干扰核酸构建体、以及EGFR 基因干扰慢病毒中的至少一种。
14. 如权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述降低肿瘤细胞中EGFR基因表 达的分尚的核酸分子为： 1. EGFR基因双链RNA，所述EGFR基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与EGFR基因 杂交的核苷酸序列；或者 2. EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能够在严紧条件下与EGFR基因杂交 的核苷酸序列； 所述EGFR基因干扰核酸构建体为含有编码前述EGFR基因 shRNA的基因片段，能表达 所述EGFR基因 shRNA ; 所述EGFR基因干扰慢病毒由EGFR基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系 的辅助下，经过病毒包装而成；所述EGFR基因干扰慢病毒载体含有编码前述分EGFR基因 shRNA的基因片段，能表达所述EGFR基因 shRNA。
【文档编号】C12N15/113GK104225617SQ201310230959
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月9日 优先权日:2013年6月9日
【发明者】瞿红花, 曹跃琼, 朱向莹, 金杨晟 申请人:苏州吉凯基因科技有限公司