一株红球菌以及用于制备光学纯(r)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途
【专利摘要】本发明涉及一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途，该红球菌（Rhodococcus?baikonurensis），实验室编号为ECU1014，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC?No.7649，利用该菌株的静息细胞作为生物催化剂制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途。本发明所述的菌株用于不对称还原制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的生物工艺具有产物浓度高，反应条件温和，原子经济性强，不需要额外添加昂贵的辅酶，操作简便，易于放大等特点，在(R)-硫辛酸中间体的生产中具有很好的工业应用前景。
【专利说明】—株红球菌以及用于制备光学纯(R) -6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，涉及一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途，该菌株在2013年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为 CGMCC N0.7649。
【背景技术】
[0002]a -硫辛酸是一种能消除老化与致病的自由基的类似维他命的化合物，可协助辅酶进行有利于机体免疫力的生理代谢，是一种万能抗氧化剂药物。文献报道a-硫辛酸对肝脏疾病、糖尿病、艾滋病、肿瘤等许多疾病的治疗都有一定的效果。(R)-a -硫辛酸是人体内硫辛酸的天然形式，(S)-a-硫辛酸基本没有生物活性但也无副作用。如能得到光学纯的(R)-a-硫辛酸，患者服用药物剂量可减少一半，显然更有价值的(R)-C1-硫辛酸替代外消旋的硫辛酸是必然趋势。(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯是(R)-a-硫辛酸合成的重要手性中间体，其合成方法有两类:化学合成和生物合成法。与化学合成法相比，生物合成的方法具有反应条件温和、催化效率高、选择性高等多种优点。生物合成法又包括两种方法，一是通过脂肪酶催化外消旋的酯或者羟基酸进行动力学拆分，二是通过还原酶对潜手性酮进行不对称还原。后者由于其理论产率可达100%，远高于前者的50%理论产率，更受研究者的青睐。
[0003]目前仅有3篇文献报道用不对称还原制备(R)-6_羟基-8-氯辛酸酯的方法。在这3篇文献中，底物浓度最高的达到200mM(45g/L)，但它需要添加高达4mM的昂贵辅酶，反应时间长达24h，转化率只有95%，产物的ee值没有提及(W02007028729) ；Muller等应用来自于Thermoanaerobacter brocki的醇脱氢酶不对称还原6_羰基_8_氯辛酸甲酯得到相应的(R)-6-羟基-8-氯辛酸甲酯，虽然其产物光学纯度达到99.5%，是目前文献报道的最高水平，但其底物浓度仅为2.2g/L，反应需要添加0.5mM的辅酶和ImM的二硫苏糖醇(DTT)，并且转化率仅有85%(US7157253B2)。Olbrich等利用Geotrichum candidum野生菌细胞还原5g/L的6-羰基-8-氯辛酸甲酯制备(R) -6-羟基-8-氯辛酸甲酯，得率仅为62%，产物的ee 值仅为 88%(US7135328B2)。
[0004]以上方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺陷，与工业化生产的要求相距甚远。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是，已报道的酶促不对称还原制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法中普遍出现的转化率低，反应时间长，需要添加昂贵辅酶及其它添加剂等问题。
[0006]本发明提供一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途
[0007]本发明通过下述具体技术方案以解决上述技术问题:
[0008]本发明的发明人从土壤中，经过初筛、复筛及分离纯化，获得一株能高效率不对称还原制备(R) _6_羟基-8-氯辛酸酯的红球菌(Rhodococcus baikonurensis),实验室编号为E⑶1014，该菌株在2013年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏号为CGMCC N0.7649。
[0009]Rhodococcus baikonurensis ECU1014 (CGMCC N0.7649)具有如下特征:
[0010]1.大小形态
[0011]球状，2-3 iim，革兰氏染色阳性；
[0012]2.适合生长环境
[0013]可在温度25-35°C，pH5-9环境中生存；
[0014]3.平板培养菌落特性
[0015]淡粉色，潮湿状，底部有隆起，边缘粗糙，不透明。
[0016]经I6S rDNA 鉴定，确认该菌株为(Rhodococcus baikonurensis)，标号为Rhodococcus baikonurensis ECU1014。
[0017]本发明的红球菌株Rhodococcus baikonurensis EQJ1014可以不对称合成光学纯(R) -6-羟基-8-氯辛酸酯及其 它光学活性手性醇，包括下列步骤:
[0018]1.菌株的培养
[0019]将所述的红球菌Rhodococcus baikonurensis EQJ1014米用本领域常规的方法，在发酵培养基中进行扩增培养24-36h，温度20-50° C;
[0020]再以上述培养液做为种子，基于发酵培养基体积的接种量为I-10%(v/v)，接种至50mL的发酵培养基中，在20-50°C下100-160rpm摇床上培养24-48h，离心得到静息细胞；
[0021]所述的发酵培养基可采用常规的培养基，其中各组分的含量如下:葡萄糖10-50g,蛋白胨 I -20g, KH2PO4I -10g, K2HPO4I -10g, NaCl0.1 -2g, MgSO40.1 -2g,水IOOOmL, pH3 -8。
[0022]2.底物的生物转化
[0023]将收获的静息细胞，悬浮于pH为5.5-7.0的缓冲液中，静息细胞的含量为I-300g(湿重)/L ;在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD+的存在下，对潜手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。
[0024]所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳的为I-15mmol/L(6-羰基-8-氯辛酸乙酯为I-300mmol/L)。葡萄糖脱氢酶的用量较佳的为0.2-3kU/L(以6-羰基-8-氯辛酸乙酯作为底物时为0.2-60kU/L)。葡萄糖的用量较佳的为0.3-4.5g/L (以6-羰基-8-氯辛酸乙酯作为底物时为0.3-90g/L)。外加NAD+的用量较佳的为0-
1.0mmoI/Lo所述的缓冲液可为本领域常规磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05-0.lmol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳的为20-35°C。所述的不对称还原反应的时间较佳的以反应完全为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇产物。[0025]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0026]本发明的积极进步效果在于:本发明针对已报道的生物催化不对称合成(R) -6-羟基-8-氯辛酸酯的研究中存在产物浓度不高，转化率低，反应时间长，需要额外添加昂贵辅酶等问题，筛选得到一株红球菌作为催化剂，不对称还原6-羰基-8-氯辛酸酯及其它潜手性酮。在催化浓度高达300mmol/L(66g/L)的底物时，转化率仍可达99%以上，反应时间为36h，产物的ee值为93%，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于已报道的其它不对称还原制备(R) -6-羟基-8-氯辛酸酯的方法，具有一定的工业应用前景。
【具体实施方式】
[0027]以下通过实施例对本发明的技术内容作进一步的描述。其目的仅在于更好地理解本发明的内容，而非限制本发明的保护范围。
[0028]实施例1菌株的筛选
[0029]配制富集培养基，成分如下:(NH4)2S041.0g/L, KH2P043.0g/L, K2HP046.0g/L,MgSO40.5g/L, CaCl20.05g/L ;另配制丰富培养基,组成如下:葡萄糖15g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨 5g/L，KH2PO4L Og/L, K2HPO4L Og/L,MgSO40.5g/L，pH7.0。在 250mL 的三角烧瓶内装 50mL的富集培养基和2mM的底物作为碳源,加入土样后，于30°C, 180rpm培养I-6天。之后将该培养液涂布于丰富培养基平板上，30°C培养I-3天，长出的单菌落进行平板划线分离纯化。底物为6-羰基-8-氯辛酸乙酯。
[0030]将得到的单菌落接种到液体丰富培养基中，在30°C，180rpm培养2天后，取一定量的湿细胞(0.1-0.5g)悬浮于ImL磷酸缓冲液(PBS，50mM，pH6.0)中，添加底物6-羰基-8-氯辛酸乙酯(10mM，以乙醇助溶)和5%葡萄糖，在30°C，1100rpm条件下反应24h。反应结束后，使用薄板层析(TLC)分析产物/底物比例，选择产物比例高的菌株进行复筛。
[0031]复筛中，菌体的培养方法和条件同上，反应结束后离心(12，000rpm，5min)，收集的上清液用乙酸乙酯萃取两次，取上层有机相，用无水NaSO4干燥过夜，进行气相色谱分析，测定底物转化率和还原产物的ee值。
[0032]筛选结果是编号为ECU1014的菌株催化还原时具有最高的转化率与ee值。
[0033]产物ee值的具体分析条件如下:
[0034]使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasi 1-DEXCB，以氮气为载气，进样口温度280°C，检测器温度280°C，反应产物乙酰化后进行分析，柱温160°C。
[0035]实施例2-8静息细胞催化羰基化合物的不对称还原
[0036]在ImL憐酸钠缓冲液(100mmol/L,pH6.0)中加入0.0lg Rhodococcus baikonurensisE⑶1014的静息细胞和2U的葡萄糖脱氢酶粗酶液(制备方法参见Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology2011, 38, 633 - 641)，分别加入终浓度为 lOmmol/L 的潜手性羰基化合物(实施例2 - 8)，以及终浓度为0.5mmol/L的MD+和3g/L的葡萄糖。在30° C，IlOOrpm振荡反应24h。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取,萃取两次,合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和还原产物的ee值，结果见表I。
[0037]产物ee值的具体分析条件如下:
[0038]使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，以氮气为载气，进样口温度280°C，检测器温度280°C，其它条件如下:
[0039]实施例2:反应产物乙酰化后进行分析，柱温80°C ；
[0040]实施例3:柱温160°C ；
[0041]实施例4:反应产物乙酰化后进行分析，柱温160°C ；
[0042]实施例5:反应产物乙酰化后进行分析，柱温160°C ；
[0043]实施例6:反应产物乙酰化后进行分析，柱温160°C ；
[0044]实施例7:反应产物乙酰化后进行分析，柱温160°C ；
[0045]实施例8:反应产物乙酰化后进行分析，柱温160°C ；
[0046]表1.催化羰基化合物不对称还原反应的结果
【权利要求】
1.一株产羰基还原酶的红球菌(Rhodococcus baikonurensis),保藏号为CGMCCN0.7649。
2.一种如权利要求1 所述的红球菌(Rhodococcus baikonurensis CGMCC N0.7649)用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酷和其它光学活性手性醇的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于:所述的用途包括下列步骤: (a)将红球菌Rhodococcusbaikonurensis CGMCC N0.7649在发酵培养基中进行扩增培养，离心得到静息细胞； (b)将(a)收获的静息细胞悬浮于缓冲水溶液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD+的存在下，对潜手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于:所述的步骤(a)是将权利要求1所述的红球菌Rhodococcus baikonurensis CGMCC N0.7649在发酵培养基中进行扩增培养24-36h,温度20-50°C ;以此培养液做为种子，基于发酵培养基体积的接种量体积比为I-10%，接种至发酵培养基中，在20-50°C下100-160rpm培养24-48h，离心得到静息细胞； 所述的发酵培养基中各组分的含量如下:葡萄糖10-50g，蛋白胨I-20g，KH2PO4I-10g, K2HPO4I -10g, NaCl0.1 -2g, MgSO40.1 -2g，水 IOOOmL, pH3 -8。
5.如权利要求2或4所述的用途，其特征在于:所述的步骤(b)是将步骤(a)获得的静息细胞，悬浮于pH为5.5-7.0的缓冲液中，静息细胞的含量为1-300g湿重/L ;在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD+的存在下，在20-35°C和振荡或搅拌下，对潜手性羰基化合物进行不对称还原反应； 所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳的为I-300mmol/L ;葡萄糖脱氢酶的用量较佳的为0.2-60kU/L ;葡萄糖的用量较佳的为0.3-90g/L ；NAD+的用量较佳的为0-1.0mmoI/L ;所述的缓冲液中共轭酸碱的总浓度为0.05-0.lmol/L ； 所述的潜手性羰基化合物为e-酮酯或a-酮酯类化合物。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的潜手性羰基化合物为6-羰基-8-氯辛酸こ酯或者如结构式I或2所示的潜手性羰基化合物:
【文档编号】C12N1/20GK103451124SQ201310236252
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年6月14日 优先权日:2013年6月14日
【发明者】许建和, 陈睿杰, 郑高伟, 潘江, 张玉军 申请人:华东理工常熟研究院有限公司, 华东理工大学