表达脂肪酶的埃希氏菌f6,f6脂肪酶及其生产和应用的制作方法【专利摘要】分离的表达脂肪酶的埃希氏菌F6，F6脂肪酶及其生产和应用，尤其是用于生产生物柴油的用途。CGMCCNo.75072013.04.22【专利说明】表达脂肪酶的埃希氏菌F6,F6脂肪酶及其生产和应用【
技术领域：
】：[0001]本发明涉及微生物、酶工程，涉及脂肪酶及其生产和应用。【
背景技术：
】：[0002]脂肪酶（甘油三酯酰基水解酶，E.C.3.I.1.3)催化酯（由长链脂肪酸和甘油合成的酯）的水解和合成（PetersenM,DanielR.2006.PurificationandcharacterizationofanextracellularlipasefromClostridiumtetanomorphum.JMicrobiolBiotechnol22:431-435)。除了水解羧基酯键的基本功能外，脂肪酶还可催化酯化反应（形成酯），酯交换反应，酯基转移反应（酯键的交换）（HasanF,AamerAS,AbdulΗ.2006.Industrialapplicationofmicrobiallipases.EnzymeandMicrobTechnol39:235-251)。由于脂肪酶在工业、生物医疗、生物能源和医学研究上有巨大的潜在应用价值，如今已存在大量的有关脂肪酶的研究。[0003]脂肪酶普遍存在于自然界中，可从不同的植物，动物和微生物中生产获取这些脂肪酶（GuptaR，NamitaG，PoojaR.2004.Bacteriallipases:Anoverviewofproduction,purification,andbiochemicalsproperties.ApplMicrobiolBiotechnol64:763-781).尽管从动植物中已能够获得多种脂肪酶，但由于细菌生产的脂肪酶多为胞外脂肪酶，可通过细胞外膜分泌到培养基中，这在工业应用中特别有利，因此，采用微生物尤其是细菌进行脂肪酶的生产越来越受到青睐（RoyterM.2006.CloningandCharacterizationofThermostableLipasesfromThermophilicAnaerobicBacteria[Dissertation].Hamburg:TechnischeMikrobiologie,TechnischeUniversitatHamburg)〇[0004]目前已发现大量的脂肪酶生产菌株，但只有少数一些野生型或重组脂肪酶可在商业化中应用（JaegerKE，RansaeS，DjikstraBW，ColsonC，vanHeuvelM，Misset0·1994.Bacteriallipases.FEMSMicrobiolRev15:29-63))。[0005]由于生物柴油的可生物降解性、可再生、无毒害、低排放量和环境友好性，因此近来生物柴油备受世界各地的关注（LecaM,TcacencoL，MicutzM,StaicuT.2010.Optimizationofbiodieselproductionbytransesterificationofvegetableoilsusinglipases.RomanianBiotechnologicalLetters15(5):5618-5630)〇由于生物柴油是由植物油一类的可再生资源制备，因此被认为是CO2中性的，可生物降解的油类，有助于节约化石燃料。与传统的柴油燃料相比，它的燃烧污染排放大幅减少(RafaelC1GiandraV1KeikoW1MarcoA.2008.Enzymaticsynthesisofbiodieselfromtransesterificationreactionsofvegetableoilsandshortchainalcohols.JAmOilChemSoc85:925-930)。[0006]工业上，生物柴油可在碱性或酸性的催化剂条件下，由植物油和短链醇的酯化反应生成，其中，短链醇通常为甲醇。得到的反应产物为需要的酯类，单甘酯，甘二酯，甘油，水，和催化剂的混合物。和酶介导的过程相比，该过程需消耗更多的能量。由于皂类副产物的存在，化学法制备的生物柴油与酶法制备的生物柴油相比，它的分离纯化在一定程度上需更复杂的步骤。基于此，采用生物催化剂是一种具有吸引力的选择，因为酶促合成的生物柴油，无需纯化即可使用（RafaelC，GiandraV，KeikoW，MarcoA.2008.Enzymaticsynthesisofbiodieselfromtransesterificationreactionsofvegetableoilsandshortchainalcohols.JAmOilChemSoc85:925-930)〇[0007]通过脂肪酶作生物催化剂，可将来自植物油的甘三酯通过转酯化反应转变为脂肪酸烷基酯。在温和条件下即可进行酶处理，这减少了能耗，降低了废弃物处理的费用。同时，还可对固定化酶进行重复利用，这降低了成本，使酶处理过程具有经济性和实用性（IgorNjSusanaLjMarlyCjOtavioLjMarcioFjMartaA.2011.Enzymaticbiodieselsynthesisusingabyproductobtainedfrompalmoilrefining.EnzymeResearch)。【
发明内容】：[0008]概括地说，本发明主要包括以下内容：[0009]第一方面，本发明提供了一种分离的表达脂肪酶的菌株，命名为埃希氏菌F6,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7507。[0010]第二方面，本发明提供了一种脂肪酶，其氨基酸序列选自：SEQIDNO:1所示氨基酸序列或其保守性变体。[0011]第三方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，含有编码脂肪酶的核苷酸序列，所述脂肪酶的氨基酸序列选自SEQIDNO:1所示氨基酸序列或其保守性变体；所述核苷酸序列优选如SEQIDNO:2的1-1842所示；所述核酸分子的核酸序列优选如SEQIDNO:2所/Jn〇[0012]第四方面，本发明提供了一种重组细胞，含有第三方面所述的核酸分子，优选的，所述重组细胞选自含有所述核酸分子的大肠杆菌，含有所述核酸分子的酵母菌和含有所述核酸分子的保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.7507的埃希氏菌F6。[0013]第五方面，本发明提供了一种重组载体，含有第三方面所述的核酸分子，优选的，所述重组载体是质粒，优选的，例如由PUC19构建的含有所述核酸分子的PWB201、由PRK415构建的含有所述核酸分子的PWB204、或由pColdTF构建的含有所述核酸分子的pWB210。[0014]第六方面，本发明提供了一种生产脂肪酶的方法，包括：培养第一方面所述的菌株和/或第四方面所述的重组细胞以使所述菌株或细胞生产脂肪酶，收获脂肪酶；优选地，所述方法包括在培养基中添加脂肪酶诱导剂，优选的诱导剂为甘三酯，优选的甘三酯为橄榄油、棕榈油、椰子油、大豆油、棕榈仁油。[0015]所述收获可以包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的脂肪酶的培养物上清液，由此获得含有脂肪酶的脂肪酶液；优选地，所述方法还包括对所述脂肪酶液进行浓缩。[0016]第七方面，本发明提供了一种脂肪酶，用第六方面所述方法制得。[0017]第八方面，本发明提供了一种脂肪酶液，用第六方面所述方法制得。[0018]第九方面，本发明提供了一种生产生物柴油的方法，其特征在于采用第一方面所述菌株、第二方面所述脂肪酶、第八方面所述脂肪酶、第四方面所述重组细胞或第九方面所述脂肪酶液作为催化剂。[0019]油棕榈（Elaeisguineensis)果实表面或油棕榈果围，由于其油性的环境，是分离表达脂肪酶的菌株的潜在来源。我们从油棕榈果围成功分离得到一株表达脂肪酶的菌株，命名为埃希氏菌F6(Escherichiasp.F6)，本文中简称为F6,并将F6来源的脂肪酶命名为F6脂肪酶（F61ip)，经F6表现出的脂解活性称为F6脂肪酶活性。本发明的埃希氏菌F6菌种已于2013年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.7507。[0020]本发明提供了一种生产脂肪酶的方法，包括培养本发明分离得到的F6以令其生产脂肪酶，收获所述细菌生产的脂肪酶。F6可将生产的脂肪酶分泌到胞外的培养基中。实施方式之一中，所述收获包括从培养物中分离出上清液，由此得到含有脂肪酶具有脂肪酶活性的脂肪酶液。可选的是，可以对生产株进行破胞处理，从而释放出更多的脂肪酶。[0021]实施方式之一中，对本发明的脂肪酶液进行了浓缩，这样可以提高脂肪酶液的脂肪酶活性。本发明的酶液可以直接使用。可以采用酶工程领域已知的各种方法从本发明酶液中进一步分离和纯化脂肪酶，由此获得本发明的F6脂肪酶。[0022]实施方式之一中，本发明在培养基中添加了脂肪酶诱导剂。本发明发现，诱导剂显著提高培养上清中的酶活，由此表明诱导剂显著提高了上清中的酶得率。所述诱导剂的例子有橄榄油、棕榈油、椰子油、大豆油、棕榈仁油等甘三酯油脂。Pogori等报道称，甘三酯是一种常用的脂肪酶诱导剂，被广泛用于增强脂肪酶的分泌；加入2%豆油或橄榄油可增强华根霉（Rhizopuschinensis)脂肪酶的分泌（PogoriN,CheikhyoussefA,XuY,WangD.2008.ProductionandbiochemicalcharacterizationofanextracellularlipasefromRhizopuschinensisCCTCCM201021.Biotechnology7(4):710-717)。本发明实施例之一中，加入1-2%(v/v)的橄榄油促使培养基中脂肪酶活性提高。[0023]测定脂肪酶活性的方法有例如对硝基苯酚棕榈酸酯（pNPP)法。一个单位的脂肪酶活性的定义为：在PH8.0,37°C条件下，每分钟催化水解pNPP释放1μmol对硝基苯酚所消耗的酶量。所述方法包括：[0024](1)标准曲线的绘制[0025]1.称取0.1391g的pNP溶解到50ml的异丙醇中制备20mM的储存溶液。当使用它制作标准曲线时，以10:100的比例稀释，得2.OmM的pNP溶液。当制作标准曲线及对如培养物的上清等样品进行实验时，要确保所有的反应条件和反应体积是相同的。[0026]2.如下表所示，将所有的溶液混合一起。在37°C条件下孵育15min，加入2ml95%乙醇。以7000rpm离心2min，测定上清于410nm处的吸光度值A410(当使用分光光度计时，加水作为空白对照）。记录每个样品的A410值，制作标准曲线，公式为：Y=ax+b(Y:pNPP浓度；X:A410;a，b:反应因子）[0027]【权利要求】1.一种分离的表达脂肪酶的菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.7507。2.-种脂肪酶，其氨基酸序列选自：1.SEQIDN0:1所示氨基酸序列，或2.SEQIDNO:1所示氨基酸序列的保守性变体。3.-种分离的核酸分子，含有编码脂肪酶的核苷酸序列，所述脂肪酶的氨基酸序列选自SEQIDNO:1所示氨基酸序列或其保守性变体；所述核苷酸序列优选如SEQIDNO:2的1-1842所示；所述核酸分子的核酸序列优选如SEQIDN0:2所示。4.一种重组细胞，含有要求3所述的核酸分子，优选的，所述重组细胞选自含有所述核酸分子的大肠杆菌，含有所述核酸分子的酵母菌和含有所述核酸分子的保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.7507的埃希氏菌F6。5.-种重组载体，含有权利要求3所述的核酸分子，优选的，所述重组载体是质粒，优选为由PUC19构建的含有所述核酸分子的pWB201、由pRK415构建的含有所述核酸分子的PWB204、由pColdTF构建的含有所述核酸分子的pWB210。6.-种生产脂肪酶的方法，包括：培养权利要求1所述的菌株和/或权利要求4所述的重组细胞以使所述菌株或细胞生产脂肪酶，收获脂肪酶；优选地，所述方法包括在培养基中添加脂肪酶诱导剂，优选的诱导剂为甘三酯，优选的甘三酯为橄榄油、棕榈油、椰子油、大豆油、棕榈仁油。7.如权利要求6所述的方法，所述收获包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的脂肪酶的培养物上清液，由此获得含有脂肪酶的脂肪酶液；优选地，所述方法还包括对所述脂肪酶液进行浓缩。8.-种脂肪酶，用权利要求6或7所述方法制得。9.一种脂肪酶液，用权利要求7所述方法制得。10.-种生产生物柴油的方法，其特征在于采用权利要求1所述菌株、权利要求2所述脂肪酶、权利要求8所述脂肪酶、权利要求4所述重组细胞或权利要求9所述脂肪酶液作为催化剂。【文档编号】C12R1/185GK104278004SQ201310294466【公开日】2015年1月14日申请日期:2013年7月12日优先权日:2013年7月12日【发明者】A·苏万托,G·H·那塔迪普曲,Y·H·渃司坦申请人:丰益国际有限公司