猪瘟、猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种试剂盒，该试剂盒包括一个扩增试剂、一个初筛探针试剂和4个复筛探针试剂。本发明还公开了一种检测猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒的方法。在实际检测中，本发明所提供的试剂盒和方法能够在6小时内完成样品中上述几种病毒的筛查，大量阴性样本可以通过初筛阶段判定为阴性而不进入复筛阶段，可大大提高检测效率，节省大量时间、人力和物力，并且，初筛后的阳性结果待确认样本，可以在复筛过程中通过特异性捕获探针获得相应病毒阳性结果的最终判定确认，同时本发明所提供的方法具有较高灵敏性、特异性，适合于对待测样品的快速筛查。
【专利说明】猪瘟、猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒及检测方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地涉及一种猪瘟、猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎病毒 检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 核酸序列依赖性扩增检测技术（Nuclear acid sequence-based amplification, NASBA)是一项以核苷酸模板序列为模板进行等温核酸扩增 的检测方法（Compton, J·，Nucleic acid sequence-based amplification. Nature, 1991. 350(6313) :p. 91-92.)，该方法的扩增过程是由一对特异性引物介导的、连续 均一的等温酶促扩增反应过程。NASBA法扩增反应简单快速，约2小时可将RNA扩增IO 9至 IO12倍，相比常规PCR反应扩增产物量至少高1000倍，且不需要特殊的大型仪器。NASBA 扩增反应的高效性还在于扩增过程受到初始样本中RNA浓度的影响很小，反应在42°C下进 行，扩增产物的积累量与时间呈指数相关，扩增产物达到IO 5倍仅需15分钟，而PCR扩增则 需要85分钟。
[0003] 猪瘟病毒(又名古典猪瘟病毒Classical Swine Fever Virus，CSFV)是威胁养猪 业的一种主要传染病。尽管分离到不同的变异性毒株，但目前认为猪瘟病毒为单一血清型 (Kaden, V. and B. Riebe, Classical swine fever (CSF):ahistorical review of research and vaccine production on the Isle of Riems. Berl Munch Tierarztl ffochenschr, 20 01. 114(7-8) :p. 246-251)。
[0004] 猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)又称猪蓝耳病病毒，依据血清学及基因序列分析，分为以LV型为代 表的欧洲型亚型和以VR2332为代表的美洲型亚型，这两种不同基因型的病毒的核苷酸序 列同源性约为 GO^KShang, Y.，et al·，Pathogenic characteristics of three genotype II porcine reproductive and respiratory syndrome viruses isolated from China. Virol J，2013. 10:p. 7.)(张松林等，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的免疫学和免疫逃避研 究进展，病毒学报，2012. 28(6) :p. 689-698.)。
[0005] 猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV) 也是一种高度接触性传染性动物病毒，到目前为止，世界各地所分离的TGEV毒株均属同一 个血清型（Laude, H.，et al. , Molecular biology of transmissible gastroenteritis virus. Vet Microbiol, 1990. 23(1-4):p. 147-154. )〇
[0006] 目前，虽然有利用NASBA技术对这三种病毒的单一检测方法已有所报道，但是还 没有通过一次NASBA扩增而筛查出待测样品中是否存在上述病毒中的一种或几种的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服目前存在的不能通过一次性检测得知样品中是否存在猪 瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒中的 一种的缺陷，提供了一种试剂盒和一种猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒 美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒检测方法。
[0008] 根据本发明所提供的试剂盒，该试剂盒包括一个引物扩增试剂、一个初筛探针试 剂和4个复筛探针试剂；
[0009] 其中，所述引物扩增试剂中包括3个引物对：
[0010] 第一对引物对由SEQ ID NO: 1所示的引物和SEQ ID NO:2所示的引物组成，
[0011] 第二对引物对由SEQ ID N0:3所示的引物和SEQ ID N0:4所示的引物组成，
[0012] 第三对引物对由SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的引物组成，
[0013] 其中，所述初筛探针试剂中包含5个初筛探针，所述5个初筛探针的序列分别为 SEQ ID NO:7 至 SEQ ID NO: 11 所示的探针；
[0014] 其中，所述4个复筛探针试剂分别含有一个复筛探针对：
[0015] 第一对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 13所示的探针组成，
[0016] 第二对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 14所示的探针组成，
[0017] 第三对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 15所示的探针组成，
[0018] 第四对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 16所示的探针组成，
[0019] 其中，SEQ ID NO: 7以及SEQ ID NO: 13至SEQ ID NO: 16的5'末端标记有生物素 分子，SEQ ID NO:8至SEQ ID NO: 12的5'末端标记有地高辛分子。
[0020] 根据本发明所提供的猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型 亚型和猪传染性胃肠炎病毒的检测方法，该方法包括以下步骤：
[0021] (1)在dNTP、NTP、T7RNA聚合酶、AMV、RNaseH和NASBA缓冲液存在下，使扩增试剂 与待测核酸样本在NASBA反应条件下进行第一接触，得到第一接触后的产物；
[0022] (2)将第一接触后的产物与初筛探针试剂在杂交条件下在SSPE杂交缓冲液中进 行第二接触，得到第二接触后的产物；所述初筛检测探针能够与所述单链RNA扩增产物的 单链RNA杂交；
[0023] (3)将第二接触后的产物与含有抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体的检测试剂进 行第三接触，获得第三接触后产物；
[0024] (4)将第三接触后的产物先后在显色条件和终止条件下分别与显色反应试剂和终 止显色反应试剂进行第四接触和第五接触，得到第五接触后的产物；
[0025] (5)测定第五接触后的产物在405nm处的光密度值X，并判断该光密度值是否大于 等于临界值a，其中，临界值a的计算方法为：按照步骤（1) - (4)所述的方法对不少于10 例猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒 阴性的样品在405nm处的OD值进行检测，获得各样品的检测值，并根据检测值计算得到检 测值的平均值和标准差，根据公式：临界值a=平均值+10X标准差计算得到临界值a ;
[0026] (6)选择光密度值X大于等于临界值a的样本的第一接触后产物与所述4个复筛 探针试剂在杂交条件下进行第六接触，得到第六接触后产物；所述复筛探针能够与所述扩 增产物的单链RNA杂交；
[0027] (7)将第六接触后的产物与含有抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体的检测试剂进 行第七接触，获得第七接触后产物；
[0028] (8)将第七接触后的产物先后在显色条件和终止条件下分别与显色反应试剂和终 止显色反应试剂进行第八接触和第九接触，得到第九接触后的产物；
[0029] (9)测定第九接触后的产物在405nm处的光密度值y，并判断该光密度值是否大于 临界值a ;
[0030] (10)当光密度值y大于临界值a时，判定为相应孔中所含有的探针所对应的病毒 阳性。
[0031] 在实际检测中，通过利用本发明所提供的检测猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚 型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒的方法，能够在6小时内完成样品中 上述几种病毒的筛查，大量阴性样本可以通过初筛阶段判定为阴性而不进入复筛阶段，可 大大提高检测效率，节省大量时间、人力和物力，并且，初筛后的阳性结果待确认样本可以 在复筛过程中通过特异性捕获探针获得相应病毒阳性结果的最终判定确认，同时本发明所 提供的方法具有较高灵敏性、特异性适合于对待测样品的快速筛查。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0033] 图1本发明所提供的检测方法示意图
[0034] 图2猪瘟病毒RNA与其阳性质粒特异性扩增检测图
[0035] 图3猪蓝耳病病毒RNA与其阳性质粒特异性扩增检测图
[0036] 图4猪传染性胃肠炎病毒RNA与其阳性质粒特异性扩增检测图
[0037] 图5检测的灵敏度与检测限示意图
【具体实施方式】
[0038] 本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包括一个引物扩增试剂、一个初筛探针试剂 和4个复筛探针试剂；
[0039] 其中，所述引物扩增试剂中包括3个引物对：
[0040] 第一对引物对由SEQ ID NO: 1所示的引物和SEQ ID NO: 2所示的引物组成，
[0041] 第二对引物对由SEQ ID N0:3所示的引物和SEQ ID N0:4所示的引物组成，
[0042] 第三对引物对由SEQ ID NO: 5所示的引物和SEQ ID NO: 6所示的引物组成，
[0043] 其中，所述初筛探针试剂中包含5个初筛探针,所述5个初筛探针的序列分别为 SEQ ID NO:7 至 SEQ ID NO: 11 所示的探针；
[0044] 其中，所述4个复筛探针试剂分别含有一个复筛探针对：
[0045] 第一对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 13所示的探针组成，
[0046] 第二对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 14所示的探针组成，
[0047] 第三对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 15所示的探针组成，
[0048] 第四对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 16所示的探针组成，
[0049] 其中，SEQ ID NO: 7以及SEQ ID NO: 13至SEQ ID NO: 16的5'末端标记有生物素 分子，SEQ ID NO:8至SEQ ID NO: 12的5'末端标记有地高辛分子。
[0050] 其中，所述第一引物对可以通过NASBA反应扩增猪瘟病毒，所述猪瘟病毒具有 5 ' utr保守序列区段；所述第二引物对可以通过NASBA反应扩增猪蓝耳病病毒，所述猪蓝耳 病病毒具有〇rf7序列；所述第三引物对可以通过NASBA反应扩增猪传染性胃肠炎病毒，所 述猪传染性胃肠炎病毒具有S基因片段序列。
[0051] 所述扩增试剂可以配制为引物混合液管，在引物混合液管中包含的引物序列为 SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:6所示的引物序列，所述引物序列溶解于TE溶液中，所述引物序 列的浓度各自为1.6-3. 0 μ mol/L。优选地，所述引物序列的浓度各自为L 8-2. 8 μ mol/L。 为了方便使用者使用并保证检测条件的一致性，所述引物混合物管中所包含的溶液的总体 积可以为110 μ L/管。
[0052] 根据本发明所提供的试剂盒，其中，为了方便使用者使用并保证检测条件的一致 性，优选情况下，所述试剂盒还含有NASBA反应试剂、核酸杂交试剂、检测试剂、显色反应试 剂和终止显色反应的试剂中的一种或多种。
[0053] 其中用于NASBA扩增反应的反应试剂包括：扩增反应液管、酶液管、阳性对照管、 阴性对照管和空白对照管。
[0054] 为了方便使用者使用并保证检测条件的一致性，优选情况下所述NASBA反应试剂 按照以下方式配制：
[0055] 扩增反应液管中的溶液按以下浓度配制：IM Tris-HCl (ΡΗ8. 5)，IM KCl，IM MgCl2, IOmM dNTP，IOOmM NTP，50mM DTT 和 15 体积 ％DMS0。
[0056] 酶液管中的溶液按以下浓度配置：8υ/μ L T7RNA聚合酶、I. 6U/y LAMV、0. (MU/μ L RNase Η、I. 5U/μ L RNasin 和 0· 52 μ g/μ L BSA ;总体积可以为 250 μ L/管。
[0057] 阳性对照管分为4管，分别为猪瘟、猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病欧洲型亚 型和猪蓝耳病美洲型亚型的阳性重组质粒稀释液，体积各为500 μ L/管，质粒的浓度为 80-100ng/L〇
[0058] 阴性对照管：以猪瘟、猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳病病毒阴性猪血清样本基因提 取物作为阴性对照，体积为500μ L/管，质粒的浓度为80-100ng/L。
[0059] 空白对照管中包括无 RNA酶水，每管中的体积为lmL。
[0060] 在本发明所述的方法中，所述初筛探针试剂中包含5个初筛探针序列分别为SEQ ID N0:7至SEQ ID NO: 11所示的探针；其中，SEQ ID N0:7为标记有生物素的初筛捕获探 针，其能够与固相化的链霉亲和素结合，SEQ IDN0:8至SEQ ID NO: 11为分别标记有地高辛 的初筛结合探针，能够与扩增产物中含有的与其碱基互补配对的核酸序列杂交结合并且能 够被共同孵育的初筛捕获探针结合；其中SEQ ID N0:8能够与猪瘟病毒NASBA反应扩增产 物进行核酸杂交结合、SEQ ID N0:9能够与猪蓝耳病美洲型亚型病毒NASBA反应扩增产物 进行核酸杂交结合、SEQ ID NO: 10能够与猪蓝耳病欧洲型亚型病毒NASBA反应扩增产物进 行核酸杂交结合、SEQ ID NO: 11能够与猪传染性胃肠炎病毒NASBA反应扩增产物进行核酸 杂父结合。
[0061] 为了方便使用者使用并保证检测条件的一致性，优选情况下，所述初筛探针试剂 的配制方法为将初筛探针溶解于IXTE溶液中配置为混合液管，在混合液中各个初筛探针 的浓度各自为1. 6-3. 2 μ mol/L。优选地，所述初筛探针的浓度各自为2-3 μ mol/L。所述初 筛探针混合液的规格可以为110 μ L/管。
[0062] 其中，所述4个复筛探针试剂分别含有一个复筛探针对：
[0063] 第一对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 13所示的探针组成， 用于对猪瘟病毒进行复筛检测；
[0064] 第二对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 14所示的探针组成， 用于对猪蓝耳病美洲型亚型病毒进行复筛检测；
[0065] 第三对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 15所示的探针组成， 用于对猪蓝耳病欧洲型亚型病毒进行复筛检测；
[0066] 第四对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 16所示的探针组成， 用于对猪传染性胃肠炎病毒进行复筛检测。
[0067] 为了方便使用者使用并保证检测条件的一致性，优选情况下，将所述各复筛探 针对分别溶解于TE中制成4个复筛探针管，各复筛探针管中总的复筛探针的终浓度为 5-10 μ mol/L，体积为 110 μ L/ 管。
[0068] 在本发明所提供的试剂盒中，用于初筛和复筛的核酸杂交试剂为SSPE (saline sodium phosphate EDTA)杂交缓冲液。
[0069] 本发明所提供的试剂盒还包括初筛检测浓缩液和复筛检测浓缩液，所述初筛和复 筛检测浓缩液均为抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体，为了方便使用者使用并保证检测条 件的一致性，优选情况下，相对于每微升的扩增产物与探针杂交后获得的产物，所述抗地高 辛碱磷酸酶单克隆抗体的用量为〇. 01-0. 08微克。
[0070] 本发明所提供的试剂盒还包括复筛显色液和终止液，其中所述显色液为对硝基磷 酸苯的二乙醇胺溶液，优选地，对硝基磷酸苯的浓度在3-15g/L之间。
[0071] 所述终止液为无 RNA酶纯水配制的NaOH溶液，NaOH的浓度优选地为80-120g/L。
[0072] 为了方便试剂盒的使用，本发明所提供的试剂盒优选还包括TBS缓冲液，所述缓 冲液可以为1-10倍工作浓度的TBS缓冲液，使用时可以按比例稀释为工作浓度。
[0073] 本发明所述的试剂盒还可以包括酶标板，所述酶标板包被有链霉亲和素。所述包 被的方法可以为本领域公知的方法。
[0074] 需要说明的是，本发明中的3个引物对、5个初筛探针、4个复筛探针对均可以通过 商购合成的方式得到。
[0075] 本发明还提供了一种检测猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美 洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒的方法，该方法具体包括以下步骤：
[0076] (1)在dNTP、NTP、T7RNA聚合酶、AMV、RNaseH和NASBA缓冲液存在下，使扩增试剂 与待测核酸样本在NASBA反应条件下进行第一接触，得到第一接触后的产物；
[0077] (2)将第一接触后的产物与初筛探针试剂在杂交条件下在SSPE杂交缓冲液中进 行第二接触，得到第二接触后的产物；所述初筛检测探针能够与所述单链RNA扩增产物的 单链RNA杂交；
[0078] (3)将第二接触后的产物与含有抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体的检测试剂进 行第三接触，获得第三接触后产物；
[0079] (4)将第三接触后的产物先后在显色条件和终止条件下分别与显色反应试剂和终 止显色反应试剂进行第四接触和第五接触，得到第五接触后的产物；
[0080] (5)测定第五接触后的产物在405nm处的光密度值X，并判断该光密度值是否大于 等于临界值a，其中，临界值a的计算方法为：按照步骤（1) - (4)所述的方法对不少于10 例猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒 阴性的样品在405nm处的OD值进行检测，获得各样品的检测值，并根据检测值计算得到检 测值的平均值和标准差，根据公式：临界值a=平均值+IOX标准差计算，得到临界值a ;
[0081] (6)选择光密度值X大于等于临界值a的样本的第一接触后产物与所述4个复筛 探针试剂在杂交条件下进行第六接触，得到第六接触后产物；所述复筛探针能够与所述扩 增产物的单链RNA杂交；
[0082] (7)将第六接触后的产物与含有抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体的检测试剂进 行第七接触，获得第七接触后产物；
[0083] (8)将第七接触后的产物先后在显色条件和终止条件下分别与显色反应试剂和终 止显色反应试剂进行第八接触和第九接触，得到第九接触后的产物；
[0084] (9)测定第九接触后的产物在405nm处的光密度值y，并判断该光密度值是否大于 临界值a ;
[0085] (10)当光密度值y大于临界值a时，判定为相应孔中所含有的探针所对应的病毒 阳性。
[0086] 其中，所述第一接触中dNTP、NTP、T7RNA聚合酶、AMV、RNaseH、水、引物扩增试剂和 待测核酸样本的用量没有特别地限制，只要是能用于NASBA反应即可，例如可以为《分子克 隆实验指南》（科学出版社2003年出版）中所述的比例。
[0087] 其中，所述NASBA反应条件没有特别的限制，只要是能用于核酸依赖性扩增检测 即可，例如可以为《分子克隆实验指南》（科学出版社2003年出版）中所述的条件；优选情 况下所述NASBA反应条件包括：将含有待测核酸样本的反应体系于95°C变性5min后立即 放在冰上3min，42°C孵育5min，加入酶混合液5 μ L，混匀后在42°C扩增90min。
[0088] 需要说明的是，本发明中，所述待测核酸样本指从各种需要检测的疑似猪瘟病毒、 猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒的样品中获得 的核酸样本，所述待测核酸样本的获得方法没有特别的要求，使用本领域公知的方法即可， 例如待测样品可以为血液、组织、粪便污染物等，可以使用市售的商品化的RNA核酸提取试 剂盒或本领域常用的RNA提取试剂提取待测样品中的总RNA，作为待测核酸样本。
[0089] 根据本发明所提供的检测方法，其中，第二接触中，探针、封闭核酸和所述扩增 产物的用量没有特别要求，可以为《分子克隆实验指南》（科学出版社2003年出版）中所 述的用量，优选情况下，相对于每皮摩尔的初筛探针，第一接触后获得的扩增产物的用量 为1-3 μ L。优选的反应条件包括：在包被有链霉亲和素的酶标板中加入第一接触后产物 5 μ L，加入初筛探针2 μ L，杂交缓冲液43 μ L，震荡混匀后在42°C杂交1小时，倾去溶液，用 I XTBS缓冲液洗3次后获得第二接触后产物。
[0090] 根据本发明所提供的检测方法，其中，第二接触后产物与含有抗地高辛的单克隆 联合抗体的初筛检测试剂进行第三接触的条件没有特别的要求，可以为《分子克隆实验指 南》（科学出版社2003年出版）中所述的条件；优选情况下，所述第三接触的条件可以为相 对于每微升初筛探针，初筛检测试剂的加入量为20-22 μ L，并在20-42°C孵育30-90分钟， 孵育后用IXTBS缓冲液洗3次获得第三接触后产物。为了便于检测，第三接触可以按照以 下条件进行，使2 μ L初筛探针、43 μ L初筛检测试剂在37°C孵育60分钟，孵育后用I X TBS 缓冲液洗3次获得第三接触后产物。
[0091] 根据本发明所提供的检测方法，其中，所述第三接触后产物与显色反应试剂进行 第四接触的显色条件以及与终止显色反应试剂进行第五接触的终止条件没有特别的要求， 可以参照公知的酶联免疫显色和终止的条件进行，优选情况下，相对于每皮摩尔的初筛探 针，显色液的加入量可以为20 μ L,终止液的加入量可以为20 μ L,第四接触的条件为在 20-42°C下避光放置5-15min。
[0092] 本发明中，通过步骤1-4所提供的方法对不少于10例已知猪瘟病毒、猪蓝耳病病 毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒阴性样品在405nm处的OD 值进行检测，获得各样品的检测值并根据检测值计算得到检测值的平均值和标准差，根据 公式：临界值a=平均值+IOX标准差计算得到一个可用的初筛判定临界值a。当扩增样品 的第五接触后产物在405nm处的OD值小于初筛判定临界值a时，所扩增样品判定为猪瘟病 毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒阴性，大于 或等于初筛判定临界值a时则对扩增样品继续进行复筛。
[0093] 根据本发明所提供的检测方法，其中，将第一接触后产物与所述4个复筛探针试 剂在杂交条件下进行第六接触的条件没有特别的要求，可以为《分子克隆实验指南》（科学 出版社2003年出版）中所述的条件；优选的，所述第六接触的条件可以为相对于皮摩尔的 复筛探针，第一接触后产物的加入量为1-3 μ L，优选情况下，接触的条件可以为：将5 μ L 第一接触后产物分别加入酶标板4个独立孔中并标记为A、B、C和D，在A-D孔中对应的加 入2 μ L第一至第四复筛探针对(例如，加入的方式可以为在A孔中加入第一对复筛探针， 在B孔中加入第二对复筛探针，在C孔中加入第三对复筛探针，在D孔中加入第四对复筛探 针）以及43 μ L复筛杂交缓冲液，微微震动混匀后，在42°C接触杂交1小时，倾去溶液并用 I XTBS缓冲液洗3次后获得第六接触后产物。
[0094] 将第六接触后产物与复筛检测试剂进行第七接触的条件优选为，相对于2μ L复 筛探针，复筛检测试剂的加入量为43 μ L，并在20-42°C孵育30-90分钟，孵育后用I XTBS 缓冲液洗3次获得第七接触后产物。
[0095] 根据本发明所提供的方法，其中，所述复筛过程的显色条件和终止条件没有特别 的要求，可以参照公知的酶联免疫显色和终止的条件进行。
[0096] 复筛结果判定按照初筛结果的判定方法进行，当加入相应复筛探针的孔在405nm 处的OD值大于临界值a时，判定该孔中所含有的探针所对应的病毒阳性。
[0097] 本发明所提供的方法能够检测的第一接触产物中病毒核酸的检测灵敏度为：猪 瘟病毒1父1(^ 3111〇1/1、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型1\1(^3111〇1/1、猪蓝耳病病毒美洲型亚型 I X l(T13mol/L和猪传染性胃肠炎病毒I X l(T14mol/L。
[0098] 此外，在利用本发明所提供的方法进行检测时优选预先进行以下准备：将所有试 剂在冰上解冻；将酶标板预热至18-30°C备用。
[0099] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0100] 以下实施例中所用到的试剂：
[0101] RNA核酸提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司；
[0102] 病毒RNA小量提取试剂盒购自德国Qiagen公司；
[0103] BSA 购自瑞士 Roche 公司，浓度 10mg/mL ;
[0104] RNasin (浓度 250U/ μ I)购自美国 Promega 公司；
[0105] NTP 和 dNTP 购自 Fermentas 公司；
[0106] T7RNA 聚合酶(浓度 50U/ μ I)，AMV 反转录酶(浓度 5U/ μ I)，RNase H (浓度 60U/ μ 1)均购自宝生物工程（大连）有限公司，
[0107] 吸光度测定使用美国FEI公司生产的Tecan Infinite Μ200型连续光谱多功能酶 标仪。
[0108] 以下实施例中的引物、初筛探针和复筛探针均购自上海生工：
[0109] 引物：
[0110] SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO:6 所示的序列；
[0111] 初筛探针：
[0112] SEQ ID NO:7 至 SEQ ID NO: 11 所示的序列；
[0113] 复筛探针：
[0114] SEQ ID NO: 12 至 SEQ ID NO: 16 所示的序列；
[0115] 以下实施例中的阳性、阴性和空白对照样品按照以下方式进行制备：
[0116] 采用Trizol试剂根据该试剂使用说明书提取猪瘟、猪传染性胃肠炎病毒、猪蓝耳 病美洲型亚型、猪蓝耳病欧洲型亚型标准毒株的病毒RNA(由重庆出入境检验检疫局及中国 农业科学院哈尔滨兽医研究所提供并鉴定)，进行反转录PCR扩增，将扩增片段切胶回收，克 隆进PMD19-T质粒载体中，并进行测序验证确认所获得的阳性质粒的序列正确。将获得的 质粒稀释至50ng/ μ L。用同样方法提取经病毒培养结合荧光PCR法鉴定为4种病毒核酸阴 性的血清的RNA为阴性对照，测定核酸浓度稀释至50ng/ μ L。空白对照为无 RNA酶纯水。
[0117] 实施例1
[0118] 本实施例用于说明本发明所提供的试剂盒用于扩增猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲 型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒的特异性。
[0119] 以标准阳性毒株RNA (由重庆出入境检验检疫局及中国农业科学院哈尔滨兽医研 究所提供并鉴定）及所构建的阳性质粒为模板，按以下步骤操作，取5μ L浓度为50ng/y L 的阳性质粒样品和5 μ L无 RNA酶纯水阴性对照，分别加入13 μ L扩增反应液，2 μ L引物混 合液(浓度2 μ Μ)，于95°C变性5min后立即放在冰上3min，42°C孵育5min，加入酶液混合液 5 μ L，混匀，于42°C反应90min。将产物直接上样，于2. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结 果如图2-4所示：
[0120] 图2为猪瘟病毒RNA (第3泳道）和猪瘟病毒阳性质粒(第2泳道）扩增后检测结 果图，第1泳道为阴性对照；
[0121] 图3为猪蓝耳病病毒欧洲型亚型RNA (第1泳道)、猪蓝耳病病毒美洲型亚型RNA (第4泳道)、猪蓝耳病病毒美洲型亚型阳性质粒(第3泳道）以及阴性对照(第2泳道）扩增 后结果图；
[0122] 图4为猪传染性胃肠炎病毒RNA (第3泳道）及猪传染性胃肠炎病毒阳性质粒(第 2泳道）扩增后检测结果图，第1泳道为阴性对照。
[0123] 实施例2
[0124] 本实施例用于说明本发明所提供的方法中临界值的设置与计算。
[0125] 利用病毒培养结合荧光PCR法鉴定为阴性的10个猪瘟病毒阴性样品，按照本发明 所提供的检测方法的初筛步骤检测样品在405nm处的OD值，分别为：0. 172、0. 193、0. 198、 0·175、0·186、0·198、0· 162、0· 196、0· 169 和 0· 183。
[0126] 根据测量结果计算平均值为0. 1832,标准差为0. 1312,根据公式平均值+IOX标 准差计算判定临界值为0.314。复筛阶段的临界值数值与初筛步骤判定数值相同，均为 0·314。
[0127] 实施例3，
[0128] 本实施例用于说明本发明所提供的检测方法。
[0129] 选取已经用病毒培养结合荧光PCR方法进行确认的猪瘟病毒阳性血液样品20 例；
[0130] 猪蓝耳病病毒欧洲型亚型血液样品20例；
[0131] 猪蓝耳病病毒美洲型亚型血液样品80例；
[0132] 猪传染性胃肠炎病毒血液样品40例；
[0133] 四种病毒均确认阴性的血液样品160例。
[0134] 使用Trizol提取待测样品中的总RNA，并将所提取的总RNA的稀释至20-50 μ L无 RNA酶纯水中备用。
[0135] 试剂预备：将所有试剂在冰上解冻；将酶标板置于25°C放置30min备用。
[0136] 核酸扩增：取5 μ L所提取的各RNA样品、阳性对照、阴性对照和空白对照，分别加 入13 μ L扩增反应液，2 μ L扩增试剂，于95°C变性5min后立即放在冰上3min，于42°C孵育 5min，加入酶液5μ L，混匀，在42°C扩增90min。
[0137] 初筛检测：将包被有链霉亲和素的酶标板去除外包装，在孔板的每个孔中加入 各杂交体系，杂交体系包括：扩增产物5 μ L，初筛探针2 μ L，杂交缓冲液43 μ L，震动混匀 后，42°C杂交1小时，倾去溶液，用250 μ LlXTBS缓冲液洗3次每次1分钟，再在每孔加入 100 μ L稀释后的检测液，25°C温浴30min，用250 μ LI X TBS缓冲液洗3次，加入100 μ L显 色液，避光放置5min，加入100 μ L终止液，于405nm测定各待测样品的光密度值。
[0138] 初筛结果判定，选择光密度值大于等于临界值0. 314的样本。
[0139] 复筛检测：将光密度值大于等于临界值0. 314的样本所对应的NASBA反应扩增产 物以5 μ L分别加入酶标板4个独立孔中，标记为A、B、C和D，对应加入复筛探针管A (第一 对复筛探针)、B (第二对复筛探针)、C (第三对复筛探针）和D (第四对复筛探针）各2 μ L， 杂交缓冲液43 μ L，震荡混匀后，42°C杂交1小时，倾去溶液，250 μ LI XTBS缓冲液洗3次， 每孔加入IOOuL检测液，25°C温浴30min，用250yLlXTBS缓冲液洗3次，加入IOOyL显 色液，避光放置5min，加入100 μ L终止液，于405nm测定光密度值。
[0140] 复筛结果判定：光密度值大于等于临界值0. 314的，分别按照所加入的复筛探针 的种类判定为所对应的病毒阳性。将测定值小于判定阈值的样品判定为所对应的病毒阴 性，检测结果列于表1。
[0141] 表 1
[0142]
【权利要求】
1. 一种试剂盒，该试剂盒包括一个扩增试剂、一个初筛探针试剂和4个复筛探针试剂； 其中，所述扩增试剂中包括3个引物对： 第一对引物对由SEQ ID NO: 1所示的引物和SEQ ID NO:2所示的引物组成， 第二对引物对由SEQ ID N0:3所示的引物和SEQ ID N0:4所示的引物组成， 第三对引物对由SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的引物组成， 其中，所述初筛探针试剂中包含5个初筛探针，所述5个初筛探针的序列分别为SEQ ID NO:7至SEQ ID NO: 11所示的探针； 其中，所述4个复筛探针试剂分别含有一个复筛探针对： 第一对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 13所示的探针组成， 第二对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 14所示的探针组成， 第三对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 15所示的探针组成， 第四对复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 16所示的探针组成， 其中，SEQIDN0:7以及SEQIDN0:13至SEQIDN0 :16的5'末端标记有生物素分子， SEQ ID NO:8至SEQ ID NO: 12的5'末端标记有地高辛分子。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有NASBA反应试剂、核酸杂交 试剂、检测试剂、显色反应试剂和终止显色反应的试剂中的一种或多种。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述NASBA反应试剂包括；扩增反应液管、酶 液管、阳性对照管、阴性对照管和空白对照管；所述核酸杂交试剂包括SSPE杂交缓冲液，所 述检测试剂包括抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体；所述显色反应试剂为对硝基磷酸苯的 二乙醇胺溶液；所述能终止显色反应的试剂为氢氧化钠溶液。
4. 一种检测猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染 性胃肠炎病毒的方法，该方法包括以下步骤： (1) 在dNTP、NTP、T7RNA聚合酶、AMV、RNaseH和NASBA缓冲液存在下，使扩增试剂与待 测核酸样本在NASBA反应条件下进行第一接触，得到第一接触后的产物； (2) 将第一接触后的产物与初筛探针试剂在杂交条件下在SSPE杂交缓冲液中进行第 二接触，得到第二接触后的产物；所述初筛检测探针能够与所述单链RNA扩增产物的单链 RNA杂交； (3) 将第二接触后的产物与含有抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体的检测试剂进行第 三接触，获得第三接触后产物； (4) 将第三接触后的产物先后在显色条件和终止条件下分别与显色反应试剂和终止显 色反应试剂进行第四接触和第五接触，得到第五接触后的产物； (5) 测定第五接触后的产物在405nm处的光密度值X，并判断该光密度值是否大于等于 临界值a，其中，临界值a的计算方法为：按照步骤（1) - (4)所述的方法对不少于10例猪 瘟病毒、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型、猪蓝耳病病毒美洲型亚型和猪传染性胃肠炎病毒阴性 的样品在405nm处的0D值进行检测，获得各样品的检测值，并根据检测值计算得到检测值 的平均值和标准差，根据公式：临界值a=平均值+10 X标准差计算，得到临界值a ; (6) 选择光密度值X大于等于临界值a的样本的第一接触后产物与所述4个复筛探针 试剂在杂交条件下进行第六接触，得到第六接触后产物；所述复筛探针能够与所述扩增产 物的单链RNA杂交； (7) 将第六接触后的产物与含有抗地高辛碱磷酸酶单克隆联合抗体的检测试剂进行第 七接触，获得第七接触后产物； (8) 将第七接触后的产物先后在显色条件和终止条件下分别与显色反应试剂和终止显 色反应试剂进行第八接触和第九接触，得到第九接触后的产物； (9) 测定第九接触后的产物在405nm处的光密度值y，并判断该光密度值是否大于临界 值a ; (10) 当光密度值y大于临界值a时，判定为相应孔中所含有的探针所对应的病毒阳性。
5. 根据权利要求4所述的检测方法，其中，所述扩增试剂中包括3个引物对： 第一对引物对由SEQ ID NO: 1所示的引物和SEQ ID NO:2所示的引物组成， 第二对引物对由SEQ ID N0:3所示的引物和SEQ ID N0:4所示的引物组成， 第三对引物对由SEQ ID NO:5所示的引物和SEQ ID NO:6所示的引物组成， 其中，所述初筛探针试剂中包含5个初筛探针，所述5个初筛探针的序列分别为SEQ ID NO:7至SEQ ID NO: 11所示的探针， 其中，所述4个复筛探针试剂分别含有一个复筛探针对： 第一复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 13所示的探针组成， 第二复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 14所示的探针组成， 第三复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 15所示的探针组成， 第四复筛探针对由SEQ ID NO: 12所示的探针和SEQ ID NO: 16所示的探针组成， 其中，SEQIDN0:7以及SEQIDN0:13至SEQIDN0:16的5'末端标记有生物素分子， SEQ ID NO:8至SEQ ID NO: 12的5'末端标记有地高辛分子。
6. 根据权利要求4或5所述的检测方法，其中，所述的方法能够检测的第一接触产物中 病毒核酸的检测灵敏度为：猪瘟病毒1X l(T13m〇l/L、猪蓝耳病病毒欧洲型亚型1X l(T13m〇l/ L、猪蓝耳病病毒美洲型亚型IX l(T13m〇l/L和猪传染性胃肠炎病毒IX l(T14m〇l/L。
7. 根据权利要求4所述的方法，其中，相对于每皮摩尔的初筛或复筛探针，第一接触后 产物的用量为1-3微升。
8. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述杂交条件包括将扩增产物与探针在20-42°C 下维持30-90分钟。
9. 根据权利要求4所述的方法，其中，相对于每微升的扩增产物与探针杂交后获得的 产物，所述抗地高辛碱磷酸酶单克隆抗体的用量为〇. 01-0. 08微克；作用条件包括作用时 间为5-15分钟，作用温度为18-30°C。
【文档编号】C12Q1/68GK104293973SQ201310302447
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月15日 优先权日:2013年7月15日
【发明者】陈春英, 陈瑞, 邱杨, 聂福平, 刘杰, 黄伟, 刘建丽 申请人:国家纳米科学中心