与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记。所述单体型由5个多态性位点组成；所述5个多态性位点X1、X2、X3、X4和X5分别对应于玉米基因组DNA中序列表序列1的自5’末端第296位、第539位、第614位和第615位之间、第646位和第649位；这5个多态性位点在不同玉米自交系中共存在两种单体型，即三种基因型。通过检测所述5个多态性位点的情况，即可找到抗旱性相对较高的玉米。本发明为玉米的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育抗旱玉米品种或研究中具有重要意义。
【专利说明】与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记。
【背景技术】
[0002] 植物在复杂多变的环境中生长发育，常受到逆境胁迫，其中干旱是影响和限制植 物生长发育的主要逆境因子，甚至会导致植物死亡，严重影响农业生产。因此，培育抗旱作 物品种一直是农业科学技术研究的主要目标之一。玉米（Zea mays L.)是重要的粮食作物 之一，培育抗旱玉米品种对提高玉米产量具有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记。
[0004] 本发明所提供的与玉米抗旱性相关的单体型由五个多态性位点组成；所述五个多 态性位点X1、X2、X3、X4和X5分别对应于玉米基因组DNA中序列表序列1自5'末端第296 位、第539位、第614位和第615位之间、第646位和第649位。
[0005] 本发明研究发现，这五个多态性位点在不同玉米自交系中共存在两种单体型，即 三种基因型，因此本发明保护一种利用玉米多态性位点鉴定或辅助鉴定玉米基因型的方 法，所述多态性位点为所述XI、X2、X3、X4和X5五个多态性位点；
[0006] 所述五个多态性位点XI、X2、X3、X4和X5依次为下述a)、b)和C)的情况时相对 应的基因型分别为A、B和C:
[0007] a) A/A、C/C、无碱基插入/无碱基插入、G/G和G/G (即单体型甲纯合）；
[0008] b)C/C、T/T、插入CAC/插入CACU个碱基缺失/1个碱基缺失和C/C (即单体型乙 纯合）；
[0009] c) A/C、C/T、无碱基插入/插入CAC、G/1个碱基缺失和G/C (即单体型甲和乙杂 合）；
[0010] 所述"/"前为一条同源染色体上的情况，所述"/"后为另一条同源染色体上的情 况。
[0011] 所述获得基因型A、B和C的方法可为检测待测玉米基因组DNA中对应于序列表序 列1自5'末端第779位至第798位的情况，若为序列表序列7所示DNA片段/序列表序列 7所示DNA片段，则所述待测玉米的基因型为B ;若为缺失/缺失，则所述待测玉米的基因型 为A ;若为序列表序列7所示DNA片段/缺失，则所述待测玉米的基因型为C。所述"/"前 为一条同源染色体上的情况，所述"/"后为另一条同源染色体上的情况；
[0012] 所述检测待测玉米基因组DNA中对应于序列表序列1自5'末端第779位至第798 位的情况所使用的PCR引物对可为序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所示的单 链 DNA ;
[0013] 若所述PCR产物的大小为46bp，则所述待测玉米的基因型为A ;若所述PCR产物的 大小为66bp，则所述待测玉米的基因型为B ;若所述PCR产物的大小为46bp和66bp，则所 述待测玉米的基因型为c。
[0014] 所述获得基因型A、B和C的方法还可为利用引物对PCR扩增待测玉米的基因组 DNA中任意一段含有所述五个多态性位点的DM片段后进行测序；
[0015] 所述引物对为序列表序列5所示的单链DNA和序列表序列6所示的单链DNA。
[0016] 所述获得基因型A、B和C的方法还可为PCR-RFLP或SNP微测序的方法。
[0017] 本发明保护上述任一所述方法在鉴定或辅助鉴定玉米抗旱性中的应用。
[0018] 在上述应用中，被确定为基因型为A的待测玉米，其抗旱性高于被确定为基因型 为B和C的待测玉米；被确定为基因型为C的待测玉米，其抗旱性高于被确定为基因型为B 的待测玉米。
[0019] 在上述方法和应用中，所述待测玉米可为玉米自交系，也可为玉米杂交种如玉米 单交种。
[0020] 本发明还保护扩增如下DNA片段I或II的PCR引物对：
[0021] DNA片段I :玉米基因组DNA上的任意一段含有序列表序列1自5'末端第778位 和第799位核苷酸的DNA片段；
[0022] DNA片段II :玉米基因组DNA上的任意一段含有所述五个多态性位点的DNA片段。
[0023] 所述扩增DNA片段I的PCR引物对为序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列 4所示的单链DNA ;
[0024] 所述扩增DNA片段II的PCR引物对为序列表序列5所示的单链DNA和序列表序列 6所示的单链DNA。
[0025] 本发明还保护如下1) 一4)中任一种DNA片段及其在调控玉米抗旱性中的应用：
[0026] 1)其核苷酸序列是序列表中序列1的第296位至第798位所示的DNA分子；
[0027] 2)其核苷酸序列是序列表中序列1的第1位至第798位所示的DNA分子；
[0028] 3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少 具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具 有99%同源性的DNA分子；
[0029] 4)在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交的DNA分子。
[0030] 本发明通过对105个玉米自交系组成的自然变异群体中与抗旱性相关的基因 ZmDREB2. 7遗传变异分析，找到了形成玉米不同抗旱性的所述五个多态性位点（SNP-503， SNP-260, InDel-185, InDel-154和SNP-150)，且这五个多态性位点仅存在两种单体型。实 验证明，通过检测所述5个多态性位点的情况，即可找到抗旱性相对较高的玉米。本发明为 玉米的分子标记辅助选择育种提供了一个新方法，在培育抗旱玉米品种或研究中具有重要 意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为本发明两种单体型在抗旱型玉米和旱敏感型玉米中的序列差异。
[0032] 图2为对不同玉米自交系中分子标记InDel-21进行PCR扩增的结果。其中，泳道 1一5 分别为玉米自交系 Shen5003、CMBL70、CMBL91、(nMBL92 和 CML118。
[0033] 图3为对不同分离群体各单株中分子标记InDel-21进行PCR扩增的结果。 其中，从上至下的四幅图依次为分离群体CMBL70 X Shen5003、CMBL91 X Shen5003、 CMBL92XShen5003和CML118XShen5003的结果，泳道Pl均为亲本一玉米自交系 5116115003，泳道？2依次为亲本一(：頂81^70、(：頂81^91、(：頂81^92和01^118，其余泳道为各分离 群体中的不同单株。
[0034] 图4为ZmDREB2. 7遗传变异与玉米抗旱性的关联分析。其中，X轴为2. Ikb的基 因组片段示意图，包括ZmDREB2. 7基因 ATG上游600bp和下游1486bp，起始密码子（ATG)中 的A记为"+l"，y轴为"-log1(l (P值)"。启动子区的5个显著多态性和编码区的4个非同 义替换，均用实线连接坐标和连锁不平衡图。指示强连锁（连锁不平衡值r 2> 0.8)。
[0035] 图5为ZmDREB2. 7基因的相对表达水平与存活率的相关分析。其中，图A、B和C分 别为苗期干旱处理后正常生长（RLWC=98%)、中度干旱（RLWC=70%)和极度干旱（RLWC=58%) 时的结果。
[0036] 图6为不同亚群中本发明两种单体型的等位基因频率。
[0037] 图7为蛋白转录激活活性试验结果。
[0038] 图8为T3代转基因拟南芥植株的RT-PCR产物的电泳结果。
[0039] 图9为T3代转基因拟南芥植株经干旱处理并复水6天后的表型。
[0040] 图10为T3代转基因拟南芥植株经干旱处理并复水6天后的存活率统计结果。
【具体实施方式】
[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043] 下述实施例中多态性位点的命名方法为标记类型+序号；其中，标记类型有SNP和 InDel两种，SNP代表单核苷酸多态性，InDel代表插入或缺失；序号是以玉米自交系B73基 因组DNA中ZmDREB2. 7基因的起始密码子（ATG)中的A记为"+1" ；如SNP-503代表在起始 密码子（ATG)中的A的上游第503位碱基处存在单核苷酸多态性；InDel-185代表在起始密 码子（ATG)中的A的上游第185位碱基下游存在1个或多个碱基的插入或缺失；
[0044] 下述实施例中引物或序列的位置均以玉米自交系B73基因组DNA中ZmDREB2. 7基 因的起始密码子（ATG)中的A记为"+1" ；
[0045] 玉米自交系B73基因组DNA中ZmDREB2. 7基因的基因组序列如序列表序列1所示， 自序列1的5'端第701- 2284位编码全长cDNA序列，其中无内含子，自序列1的5'端第 799-1878位编码序列表序列2所示的蛋白；自序列1的5'端第799位为起始密码子ATG 的中的碱基A。
[0046] 实施例1、与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记与应用
[0047] -、与玉米抗旱相关的单体型
[0048] 本申请发明人在研究中发现，在玉米基因组DNA中与抗旱相关的基因 ZmDREB2. 7 (见实施例3)的起始密码子ATG上游的5个多态性位点共存在2种与抗旱相关的单体型(如 图1所示，实施例2)，所述5个多态性位点分别为SNP-503, SNP-260, InDel-185, InDel-154 和SNP-150 ;对应于序列表序列1的位置依次为：自5'末端第296位、第539位、第614位 和第615位之间、第646位和第649位。
[0049] 所述2种与抗旱相关的单体型(分别命名为甲和乙)是在上述5个多态性位点上的 核苷酸或寡聚核苷酸不同；其中，单体型甲在上述5个多态性位点的情况依次为：A、C、3个 碱基缺失、G、G ;单体型乙在上述5个多态性位点的情况依次为：C、T、CAC、1个碱基缺失、C。
[0050] 所述 5 个多态性位点 SNP-503, SNP-260, InDel-185, InDel-154 和 SNP-150 依次 为下述a)、b)和c)三种情况：
[0051] a)A/A、C/C、无碱基插入/无碱基插入、G/G和G/G (即单体型甲纯合）；
[0052] b)C/C、T/T、插入CAC/插入CACU个碱基缺失/1个碱基缺失和C/C (即单体型乙 纯合）；
[0053] c) A/C、C/T、无碱基插入/插入CAC、G/1个碱基缺失和G/C (即单体型甲和乙杂 合）；
[0054] 所述"/"前为一条同源染色体上的情况，所述"/"后为另一条同源染色体上的情 况。
[0055] 二、鉴定单体型的分子标记InDel-21及其特异引物
[0056] 将表3所示105份玉米自交系中的ZmDREB2. 7基因包括ATG上游的序列进行扩增、 测序和比对发现，在ZmDREB2. 7基因的起始密码子ATG上游的第21位碱基下游，单体型甲 纯合的玉米自交系中缺失20bp的DNA片段，单体型乙纯合的玉米自交系中插入20bp的DNA 片段，将该多态性位点命名为InDel-21，所述20bp的DNA片段的序列如序列表序列7所示。 该位点的多态性可作为分子标记用于鉴定玉米中上述5个多态性位点的情况，具体方法如 下：
[0057] 1、根据InDel-21两侧的保守序列，设计如下特异引物对：
[0058] F :5' -TCGCCATCAGTCGCCATA-3'（如序列表序列 3 所示）；
[0059] R :5' -GCGGCGGCACCCGATCCAT-3'（如序列表序列 4 所示)。
[0060] 2、以玉米基因组DNA为模板，用步骤1设计的引物对进行PCR扩增，若扩增产物的 大小为46bp，则待测玉米为单体型甲纯合的玉米；若扩增产物的大小为66bp，则待测玉米 为单体型乙纯合的玉米；若扩增产物的大小为46bp和66bp，则待测玉米为单体型甲和乙杂 合的玉米。
[0061] 三、应用分子标记InDel-21及其特异引物对不同玉米进行分型及抗旱性分析
[0062] 以抗旱型玉米自交系CMBL70 (表3中序号2)，CMBL91 (表3中序号9)，CMBL92 (表3中序号6)和CML118 (表3中序号14)分别为父本，旱敏感型玉米自交系Shen5003 (表3中序号84)为母本杂交，再自交1代，获得四个分离群体CMBL70XShen5003、 CMBL91 X Shen5003、CMBL92 X Shen5003 和 CMLl 18 X Shen5003。
[0063] 从上述五个玉米自交系亲本及四个分离群体中分别随机取150粒种子，催芽后移 栽到栽培盆(长X宽X深为〇. 70X0. 50X0. 18米，盛有5千克蛭石和5千克草炭土混合 的栽培基质)中，每盆种植144株，在温室中，于光周期为每天16小时光照和8小时黑暗、温 度为白天28°C、夜晚22°C、空气湿度60%的条件下培养10天，取单株子叶按照步骤二的方 法鉴定各亲本及群体中各单株的基因型，同时将植株进行干旱处理（即不浇水)，待土壤相 对含水量（即采用购于北京盟创伟业科技有限公司的土壤水分仪SU-LA(W)，测得的土壤中 水分的体积百分含量）达到〇%后一周，进行复水。复水6天后统计各亲本及群体中各基因 型植株的存活率(将复水6天后地上部未能转绿的植株，定义为死亡植株，将复水6天后地 上部能转绿的植株定义为存活植株；存活率为存活植株占总植株数的百分比)。实验重复三 次，每次重复约144个单株，取均值进行统计分析。结果如表1和表2和图2和图3所示。
[0064] 表1、亲本的基因型及干旱处理后的存活率统计结果
[0065]
【权利要求】
1. 一种利用玉米多态性位点鉴定或辅助鉴定玉米基因型的方法，所述多态性位点为 X1、X2、X3、X4和X5五个多态性位点，所述五个多态性位点X1、X2、X3、X4和X5分别对应于 玉米基因组DNA中序列表序列1的自5'末端第296位、第539位、第614位和第615位之 间、第646位和第649位； 所述五个多态性位点XI、X2、X3、X4和X5依次为下述a)、b)和c)的情况时相对应的 基因型为A、B和C : a) A/A、C/C、无碱基插入/无碱基插入、G/G和G/G ; b) C/C、T/T、插入CAC/插入CAC、1个碱基缺失/1个碱基缺失和C/C ; c) A/C、C/T、无碱基插入/插入CAC、G/1个碱基缺失和G/C。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述获得基因型A、B和C的方法为检测 待测玉米基因组DNA中对应于序列表序列1自5'末端第779位至第798位的情况，若为序 列表序列7所示DNA片段/序列表序列7所示DNA片段，则所述待测玉米的基因型为B ;若 为缺失/缺失，则所述待测玉米的基因型为A ;若为序列表序列7所示DNA片段/缺失，则 所述待测玉米的基因型为C。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述检测待测玉米基因组DNA中对应于 序列表序列1自5'末端第779位至第798位的情况所使用的PCR引物对为序列表序列3 所示的单链DNA和序列表序列4所示的单链DNA ; 若所述PCR产物的大小为46bp，则所述待测玉米的基因型为A ;若所述PCR产物的大小 为66bp，则所述待测玉米的基因型为B ;若所述PCR产物的大小为46bp和66bp，则所述待 测玉米的基因型为C。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述获得基因型A、B和C的方法为利用 引物对PCR扩增待测玉米的基因组DNA中任意一段含有所述5个多态性位点的DNA片段后 测序。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述引物对为序列表序列5所示的单链 DNA和序列序列6所不的单链DNA。
6. 权利要求1一5中任一所述方法在鉴定或辅助鉴定玉米抗旱性中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：被确定为基因型为A的待测玉米，其抗旱 性高于被确定为基因型为B和C的待测玉米；被确定为基因型为C的待测玉米，其抗旱性 高于被确定为基因型为B的待测玉米。
8. 扩增如下DNA片段I或II的PCR引物对： DNA片段I :玉米基因组DNA上的任意一段含有序列表序列1自5'末端第778位和第 799位核苷酸的DNA片段； DNA片段II :玉米基因组DNA上的任意一段含有所述五个多态性位点的DNA片段。
9. 根据权利要求8所述的PCR引物对，其特征在于： 所述扩增DNA片段I的PCR引物对为序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所 示的单链DNA ; 所述扩增DNA片段II的PCR引物对为序列表序列5所示的单链DNA和序列表序列6所 示的单链DNA。
10. 如下1) 一4)中任一种DNA片段及其在调控玉米抗旱性中的应用： 1) 其核苷酸序列是序列表中序列1的第296位至第798位所示的DNA分子； 2) 其核苷酸序列是序列表中序列1的第1位至第798位所示的DNA分子； 3) 与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性的DNA分子； 4) 在严格条件下与1)或2)或3)限定的DNA序列杂交的DNA分子。
【文档编号】C12N15/11GK104293900SQ201310304629
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月18日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】秦峰, 刘升学, 王向兰, 王宏伟 申请人:中国科学院植物研究所