用于治疗癌症的针对密蛋白-18的单克隆抗体的制作方法

用于治疗癌症的针对密蛋白-18的单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供抗体，所述抗体可作为治疗剂用于治疗和/或预防与表达CLD18的细胞相关的疾病，包括肿瘤相关疾病，如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。
【专利说明】用于治疗癌症的针对密蛋白-18的单克隆抗体
[0001]本申请是申请日为2006年11月24日、申请号为“200680043664.X”、发明名称为“用于治疗癌症的针对密蛋白-18的单克隆抗体”的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/EP2006/011302的中国国家阶段申请。
【技术领域】
[0002]与常规药物相比，基于抗体的癌症疗法具有较高特异性和较低副作用谱的潜力。其原因为抗体对正常细胞及赘生性细胞的精确区分以及以下事实，即其作用模式依赖于毒性较少的免疫学抗肿瘤机制，例如补体活化和细胞毒免疫细胞的募集。
【背景技术】
[0003]基于抗体的疗法的靶标必须具有特定的性质，这形成了正确区分正常细胞及赘生性细胞的基础。显然，排他性地局限在肿瘤细胞中并且在正常组织中完全检测不到的靶标对于开发高效且安全的抗体疗法而言是很理想的。另一方面，高水平的过表达也可以是治疗窗和低副作用的基础，例如由于基因扩增而成为抗体曲妥珠单抗(trastuzumab,赫塞汀)优良靶标的2型人表皮生长因子受体(HER-2)。
[0004]已获批准或正在临床开发的用于肿瘤疗法的抗体的其他靶标具有不基于靶分子在肿瘤细胞中数量上过表达的独特性质。对于针对蛋白聚糖MUC-1的抗体，靶标主链中的肽重复表位在肿瘤细胞中是低糖基化的，从而改变成其正常状态的对应物(counterpart)。对于针对CD20 (利妥昔单抗(rituximab))、CD52 (Campath-1H)和CD22 (依帕珠单抗(epratuzumab))的抗体,抗体祀标在肿瘤细胞和`正常淋巴细胞中的表达水平相当。这种情况下，抗体对正常细胞的去除是可以容忍的，因为靶标阴性的干细胞恢复了正常的淋巴细胞谱。抗体祀标差异性可接近性的其他实例为癌胚抗原(carcinoembryonal antigen, CEA)和碳酸酐酶IX(carboanhydrase IX, CA9)。这两种抗原分别在结肠和肾的正常上皮中表达。然而，经放射性标记的成像抗体确实良好区分了肿瘤及正常组织，而且细胞毒性抗体可以良好地容忍。这很可能是由于CA9和CEA在正常上皮组织中限制性表达在IgG抗体无法接近的腔侧。上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule, Ep-CAM)这种抗原也属于这一类别。作为上皮细胞的同型细胞粘附分子，它定位于在细胞间隙中。有意思的是，尽管高亲和力抗Ep-CAM抗体毒性极高，但中间亲和力的抗体却是良好容忍的。这提示了 Ep-CAM靶标在正常细胞上的可接近性，但也表明抗体结合动力学为治疗提供了可能。
[0005]一种可能性是涉及细胞/细胞粘附的其他上皮细胞特异性蛋白质对于抗体方法也有意义，因为它们在正常结构的上皮中几乎无法接近抗体，但在肿瘤细胞中却暴露出来。因此，我们对参与组织上皮组织结构的蛋白质作为治疗性抗体靶标的适用性进行了分析。一种特别吸引我们注意力的蛋白质是密蛋白18(claudin 18)。
[0006]密蛋白18 (CLD18)分子(Genbank 登记号:剪接变体 I (CLD18A1):NP_057453、NM016369,以及剪接变体 2 (CLD18A2):ΝΜ_001002026、ΝΡ_001002026)是分子量约为27，9/27，72kD的内在跨膜蛋白。密蛋白是位于上皮和内皮的紧密连接中的内在膜蛋白。紧密连接在相邻细胞之间组织膜内颗粒互联链的网。在紧密连接中，闭合蛋白(occludin)和密蛋白是最主要的跨膜蛋白组分。由于其强胞间粘附特性，它们产生了防止和控制溶质的细胞旁转运并限制膜脂和蛋白质侧向扩散以维持细胞极性的一级屏障。形成紧密连接的蛋白质关键性地参与了组织上皮组织结构。我们推测，这些蛋白质在构造良好的上皮中几乎无法接近抗体，但在肿瘤细胞中则变得暴露出来。
[0007]CLD18是一种四次跨膜蛋白，因此具有四个疏水区。我们得出的数据表明CLD18展示若干不同构象，这些构象可被抗体选择性寻址。一种构象(CLD18-构象-1)显示，全部四个疏水区均作为常规跨膜区(transmembrane domain, TM),并形成两个胞外环(环I由疏水区I和疏水区2环绕而成；环2由疏水区3和疏水区4环绕而成)，像对绝大多数密蛋白家族成员所描述的那样。另一种构象(CLD18-构象-2)显示，像对另一四次跨膜家族成员PMP22所描述的那样(Taylor等，J.Neurosc.Res.62:15-27，2000)，第二个和第三个疏水结构域不完全跨过质膜，从而第一个和第四个跨膜结构域之间的部分(环D3)在胞外。第三种构象(CLD18-构象-3)显示了由作为常规跨膜结构域的被第一个和第四个疏水区所环绕具有两个内部疏水区的大胞外结构域。由于环D3中存在经典的N-糖基化位点，密蛋白-18的拓扑学变体CLD18拓扑-2和CLD18拓扑-3带有额外的胞外N-糖基化位点。
[0008]两种不同剪接变体的存在给CLD18分子增添了另一层水平上的复杂性，这两种变体描述于小鼠和人中(Niimi，Mol.Cell.Biol.21:7380-90, 2001)。剪接变体 CLD18A1 和CLD18A2在包括第一个TM和环I的N端前21个氨基酸中存在差异，而C端的一级蛋白质序列相同。
[0009]CLD18A1在正常肺和胃的上皮中选择性表达，而CLD18A2仅在胃细胞中表达(Niimi, Mo 1.Cell.Biol.21 =7380-90,2001)。最重要的是，CLD18A2 局限在已分化的胃上皮短寿细胞中，但在胃干细胞区中不存在。我们使用灵敏的RT-PCR显示，两种变体在任何其他正常人器官中均完全检测 不到，但在若干癌症类型中强烈表达，包括胃、食管、胰腺和肺的肿瘤以及人癌症细胞系。表达主要是在这些适应症的腺癌亚型中。
[0010]该蛋白质的分子量在一些癌症和邻近的正常组织中存在差异。在健康组织中观察到的较高分子量的蛋白质可以通过用去糖基化化合物PNGase F处理组织裂解液而转变成与癌症中所观察到相同的分子量。这提示与其正常组织对应物相比，CLD18在癌症中N-糖基化较少。这种结构差异很可能产生改变的表位。经典的N-糖基化基序在该分子环D3结构域的116位氨基酸中。
[0011]本发明的术语“CLD18”和“CLD18变体”应包括(i) CLD18剪接变体；(ii) CLD18 N糖基化变体；(iii)CLD18构象变体；(iv)位于胞间紧密连接中的游离CLD18和同型/异型相连变体以及(v)CLD18的癌症相关变体和CLD18非癌症细胞相关变体。
[0012]CLD18的分子特征和功能特征使得该分子对基于抗体的癌症疗法非常有意义。特别是(i)绝大多数毒性相关正常组织中不存在CLD18 ;(ii)CLD18 A2变体的表达局限在作为已分化胃细胞的可分散细胞群体中，这些细胞可由靶标阴性的胃干细胞进行补充；(iii)正常及赘生性细胞之间潜在差异性糖基化的线索；(iv)不同构象拓扑学情况的存在。此外，CLD18作为紧密连接蛋白的作用可能进一步促成良好的治疗窗。由于肿瘤细胞表达密蛋白，但经常不像正常上皮组织中可见的那样通过密蛋白的同型和异型相关联形成经典的紧密连接，因此肿瘤细胞具有适用于胞外抗体结合及免疫疗法的可观的游离密蛋白库。有可能在健康上皮中密蛋白的结合表位被屏蔽在紧密连接中，使这些抗体无法接近。
[0013]本发明的一个目的是提供可用于治疗其中有CLD18表达的疾病(例如肿瘤疾病)的抗体。本文所述抗体还可用于诊断这些疾病。

【发明内容】

[0014]本发明一般地提供抗体，所述抗体可用作治疗剂用于治疗和/或预防与表达CLD18的细胞相关的疾病，包括肿瘤相关疾病，如胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。
[0015]本发明的一个方面涉及能够结合CLD18并介导杀伤表达CLD18的细胞的抗体。优选地，该抗体与CLD18A1和CLD18A2结合，更优选地，该抗体与CLD18A2结合但不与CLD18A1结合。优选地，本发明的抗体与CLD-构象-1的环I或环2结合并对其具有特异性。在另一优选实施方案中，本发明的抗体与CLD-构象-2的环D3结合并对其具有特异性，特别是与环D3中116位的N糖基化位点处或其周围结合。在另一实施方案中，本发明的抗体对环D3中116位潜在N糖基化位点未发生糖基化的形式具有特异性。
[0016]本发明抗体对细胞的杀伤优选通过该抗体与所述细胞所表达的CLD18结合来诱导，更优选通过该抗体与所述细胞所表达的CLD18A2结合来诱导。在一个实施方案中，本发明抗体与所述细胞所表达的CLD18A1的结合不诱导杀伤所述细胞。
[0017]所述表达CLD18的细胞优选为癌细胞，特别是选自致瘤性的胃、食管、胰腺、肺、卵巢、结肠、肝、头颈和膀胱的癌细胞。
[0018]优选地，本发明抗体通过诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬作用来介导对细胞的杀伤，优选通过诱导CDC介导的裂解和/或ADCC介导的裂解来介导对细胞的杀伤。
[0019]在一个实施方案中`，本发明的抗体不诱导CDC介导的细胞裂解。
[0020]优选地，ADCC介导的细胞裂解在效应细胞存在时发生，所述效应细胞在具体实施方案中选自单核细胞(monocyte)、单个核细胞(mononuclear cell)、NK细胞和PMN,吞卩遼作用是通过巨噬细胞来实现。
[0021 ] 本发明的抗体可以是单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或人源化抗体或者是抗体片段，并且可选自 IgGl、IgG2 (优选 IgG2a 和 IgG2b)、IgG3、IgG4、IgM、IgAl、IgA2、分泌性 IgA、IgD和IgE抗体。
[0022]根据本发明的所有方面，CLD18优选为人CLD18，优选人CLD18A2，并且CLD18A2优选具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，CLD18A1优选具有SEQ ID NO:8的序列。
[0023]在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体与活细胞表面上存在的CLD18的天然表位结合。在另一优选的实施方案中，本发明的抗体对癌细胞(优选胃癌细胞)具有特异性。
[0024]在本发明的某些实施方案中，CLD18表达于细胞表面。
[0025]本发明的抗体可通过包括以下步骤的方法获得:用具有选自SEQ ID NO:2、4、6、
16、18、20、21-23和26-31的氨基酸序列的蛋白质或多肽或其免疫原性片段或者表达所述蛋白质或多肽或其免疫原性片段的核酸或宿主细胞免疫动物。优选地，本发明的抗体对上述蛋白质、多肽或其免疫原性片段具有特异性。[0026]在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体通过登记号为DSMACC2737(182-D1106-055)、DSM ACC2738(182-D1106-056)、DSM ACC2739(182-D1106-057)、DSM ACC2740 (182-D1 106-058)、DSM ACC274 I (I 82-D I I O 6-O 59)、D SMACC2742(182-D1106-062)、DSM ACC2743 (182-D1106-067)、DSM ACC2745(182-D758-035)、DSM ACC2746 ( 1 82-D758-036)、DSM ACC2747 (I 82-D7 58-O 4 O)、D S MACC2748(182-D1106-061)、DSM ACC2808 (182-D1106-279)、DSM ACC2809(182-D1106-294)或 DSM ACC2810(182-D 1106-362)的克隆来产生。
[0027]在一个实施方案中，本发明的抗体与治疗剂如毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂偶联。
[0028]本发明的另一方面涉及能产生本发明抗体的杂交瘤。优选杂交瘤的登记号为 DSM ACC2737 (182-D1106-055)、DSM ACC2738 (182-D1106-056)、DSMACC2739(182-D1106-057)、DSM ACC2740(182-D1106-058)、DSM ACC2741(182-D1106-059)、DSM ACC2742 (182-D1 106-062)、DSM ACC2743 (I 82-D I I O 6-O 67)、D SMACC2745(182-D758-035)、DSM ACC2746(182-D758-036)、DSM ACC2747(182-D758-040)、DSMACC2748(182-D1106-061)、DSM ACC2808(182-D1106-279)、DSM ACC2809 (182-D1106-294)或DSM ACC2810(182-D1106-362)。
[0029]本发明的抗体在本文中通过参考该抗体的命名(如182-D758-035)和/或通过参考产生该抗体的克隆(如26D12)来命名。
[0030]本发明还涉及包含本发明抗体和/或其与治疗剂的缀合物以及可药用载体的药物组合物。
[0031]本发明的另一方面涉及杀伤表达CLD18(优选CLD18A2)和/或抑制其生长的方法，包括使细胞接触有效量的本发明抗体和/或其与治疗剂的缀合物。CLD18优选在所述细胞的表面表达。
[0032]本发明的另一方面涉及治疗或预防与表达CLD18(优选CLD18A2)的细胞相关的疾病或病症的方法，包括对受试者施用本发明的抗体、其与治疗剂的缀合物或者包含本发明抗体或其与治疗剂的缀合物的药物组合物。优选地，所述疾病或病症为肿瘤相关疾病，在具体实施方案中选自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。CLD18优选在所述细胞的表面表达。
[0033]优选地，本发明的抗体能够区分不同细胞类型(包括癌细胞和非恶性细胞)所表达的CLD18变体。在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体能够与CLD18A2结合，但不与CLD18A1结合，或者与CLD18A1结合的特异性低于与CLD18A2的结合特异性。
[0034]本发明的术语“结合”优选涉及特异性结合。“特异性结合”指试剂(如抗体)与其特异性靶标(如表位)的结合强于与其他靶标的结合。如果试剂与第一种靶标结合的解离常数(Kd)低于与第二种靶标的解离常数，则其与第一种靶标的结合强于与第二种靶标的结合。优选地，试剂特异性结合 的靶标的解离常数(Kd)低于该试剂非特异性结合的靶标的解离常数(Kd)的1/10以下，优选1/20以下，更优选1/50以下，甚至更优选1/100、1/200、1/500 或 1/1000 以下。
[0035]本发明的抗体通过结合CLD18(优选表达在所述细胞表面)介导杀伤表达CLD18(优选表达CLD18A2)的细胞。在一个实施方案中，本发明的抗体诱导补体依赖性细胞毒性(⑶C)，如CLD18表达细胞发生至少约20-40%⑶C介导的裂解，优选约40-50%⑶C介导的裂解，更优选高于50%⑶C介导的裂解。这样的抗体在本文中通过以下抗体进行示例:37H8、38G5、38H3、39F11、61C2、26B5、26D12、28D10、163E12、175D10、45C1、125E1、 ch_163E12和ch-175D10。作为诱导CDC的替代或补充，本发明的抗体可在效应细胞(如单核细胞(monocyte)、单个核细胞(mononuclear cell)、NK细胞和PMN)存在下诱导CLD18表达细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。这样的抗体在本文中通过以下抗体进行示例:37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、43A11、61C2、26B5、26D12、28D10、42E12、163E12、175D10、45C1 和125E1。本发明的抗体可具有以下能力:诱导CLD18表达细胞的凋亡、诱导CLD18表达细胞的同型粘附和/或在巨噬细胞存在下诱导CLD18表达细胞的吞噬作用。本发明的抗体可具有一种或多种上述功能特性。优选地，本发明的抗体诱导CLD18表达细胞的CDC介导的裂解和ADCC介导的裂解，更优选诱导CLD18表达细胞的ADCC介导的裂解，而不诱导所述细胞⑶C介导的裂解。本发明抗体的示例性靶细胞包括但不仅限于表达CLD18 (优选CLD128A2)的癌细胞，如致瘤性的胃、胰腺、食管和肺的癌细胞。在一个具体的优选实施方案中，本发明抗体介导的细胞杀伤是CLD18A2特异性的，即本发明抗体介导杀伤(优选CDC和/或ADCC介导的细胞裂解)表达CLD18A2的细胞，但是不介导杀伤表达CLD18A1而不表达CLD18A2的细胞。上述抗体可在例如以下癌症的治疗或预防中用于介导杀伤肿瘤细胞:胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。
[0036]本发明的抗体可根据其结合特性及其介导效应子对CLD18表达细胞的功能的能力分类到不同类别中。本发明抗体可根据以下特征分类:
[0037]?对表达CLD18A1或CLD18A2的细胞的结合特性和/或介导的效应子对所述细胞的功能(区分CLD18剪接变体)，
[0038]?对表 达糖基化或非糖基化CLD18变体的细胞的结合特性和/或介导的效应子对所述细胞的功能(区分有无N糖基化的CLD18变体)，
[0039]?对癌细胞或正常细胞类型的细胞的结合特性和/或介导的效应子对所述细胞的功能(区分肿瘤细胞表达的或正常细胞表达的CLD18变体)，
[0040]?对被紧密连接的形成所屏蔽的CLD18表位的结合特性，
[0041]?对活细胞诱导CLD18聚集体形成的能力，和
[0042]?与非人CLD18变体特别是来自小鼠、大鼠、兔和灵长类的CLD18结合的能力。
[0043]本发明的抗体具有一种或多种以下特性，其中给出本发明抗体(24H5、26B5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12、61C2、75B8、85A3、9E8、19B9、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10、ch_43All、ch_45Cl、ch_125El、ch-163E12、ch-166E2、ch-175D10)的具体实例作为参考:
[0044]a)与 CLD18A2 以及 CLD18A1 结合(如 26D12、28D10、37H8、38H3、39F11、61C2 和41C6)
[0045]b)与 CLD18A2 结合但不与 CLD18A1 结合(如 26B5、37G11、38G5、42E12 和 43A11、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10、ch_43All、ch_45Cl、ch_125El、ch_163E12、ch_166E2、ch-175D10)
[0046]c)与肿瘤细胞天然表达的CLD18结合但不与非癌细胞或组织(如胃和肺细胞)天然表达的 CLD18 结合(如 26B5、75B8、24H5、39F11、45C1、125E1、163E12、166E2、175D10)[0047]d)介导⑶C诱导的针对表达CLD18A2细胞的杀伤，而不针对表达CLD18A1的细胞(如 26D12、28D10、37H8 和 39F11、163E12、ch_125El、ch_163E12、ch_175D10)
[0048]e)介导 ADCC 诱导的对表达 CLD18 细胞的杀伤(如 26B5、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、43A11、47D12 和 61C2、ch_163E12、ch_175D10)
[0049]f)介导ADCC诱导的对表达CLD18细胞的杀伤，但不介导⑶C介导的杀伤(如37G1U42E12 和 43A11)
[0050]g)介导ADCC诱导的和CDC诱导的对表达CLD18A2细胞的杀伤(如37H8、38H3、39F11、ch-163E12、ch_175D10)。
[0051 ] 如本文所述示例的，本发明的抗体还包括以下分子，其
[0052]a)与已分化的正常胃细胞结合，但不与胃干细胞结合(如39F11)
[0053]b)不与正常胃组织以及其他正常器官结合，而是排他性地与癌细胞结合(如26B5)
[0054]c)与包含CLD18的116位非糖基化Asn的表位结合
[0055]d)与人及小鼠CLD18结合，使得可以在小鼠中充分进行临床前毒性研究。
[0056]本发明的抗体可来自不同物种，包括但不仅限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠和人。本发明的抗体还包括嵌合分子，其中来自一个物种(优选人)的抗体恒定区与来自另一物种的抗原结合位点组合。此外，本发明的抗体包括人源化分子，其中来自非人物种的抗体的抗原结合位点与人来源的恒定区和构架区组合。
`[0057]本发明的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体，并包括IgG2a(如IgG2a、κ、λ)、IgG2b (如IgG2b、κ、X)、IgG3(如IgG3、κ、λ)和IgM抗体。然而，本发明也包括其他抗体同种型，包括IgGl、IgAU IgA2、分泌性IgA、IgD和IgE抗体。所述抗体可以是完整抗体或其抗原结合片段，包括如Fab、F(ab' )2、Fy、单链Fy片段，或者是双特异性抗体。此外，所述抗原结合片段包括包含以下部分的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白:(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽(如重链可变区或轻链可变区)，(?)与该铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与该CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。这样的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白在US2003/0118592和US 2003/0133939中有进一步公开。
[0058]本发明的抗体优选以约1-1OOnM或更小的解离平衡常数(Kd)与CLD18解离。优选地，本发明的抗体不与相关细胞表面抗原交叉反应，因此不抑制其功能。
[0059]在一些优选的实施方案中，本发明的抗体可通过一种或多种以下特性进行表征:
[0060]a)对CLD18的特异性，特别是对CLD18A2的特异性；
[0061]b)对CLD18特别是CLD18A2的结合亲和性为约IOOnM或更小，优选约5_10nM或更小，更优选约1_3ηΜ或更小，
[0062]c)介导对⑶55/59阴性或⑶55/59阳性细胞的高水平⑶C的能力；
[0063]d)抑制表达CLD18的细胞生长的能力；
[0064]e)诱导表达CLD18的细胞凋亡的能力；
[0065]f)对表达CLD18的细胞诱导同型粘附的能力；
[0066]g)在效应细胞存在下对表达CLD18的细胞诱导ADCC的能力；
[0067]h)延长患有表达CLD18的肿瘤的受试者存活的能力；[0068]i)清除表达CLD18的细胞的能力；
[0069]j)清除表达低水平CLD18的细胞的能力，和/或
[0070]k)在活细胞表面聚集CLD18的能力。
[0071]本发明的抗CLD18抗体可进行衍生、连接或共表达以得到其它的结合特异性。在一个具体实施方案中，本发明提供双特异性或多特异性分子，其包含至少一种对CLD18的第一结合特异性(如抗CLD18抗体或其模拟体)以及对效应细胞的第二结合特异性，如对Fe受体(例如Fe- Y受体，如Fe- Y RI或其他Fe受体)或T细胞受体(如CD3)的结合特异性。[0072]因此，本发明包括与CLD18以及Fe受体或T细胞受体(如⑶3)均结合的双特异性和多特异性分子。Fe受体的实例为IgG受体、Fe- Y受体(Fe- Y R)如Fe- y RI (⑶64)、Fe-YRII(CD32)和Fe-yRIII(CD16)。也可靶向其他Fe受体，如IgA受体(如Fca RI)。所述Fe受体优选位于效应细胞如单核细胞、巨噬细胞或活化单个核细胞的表面上。在一个优选的实施方案中，所述双特异性和多特异性分子在Fe受体中不同于免疫球蛋白Fe(如IgG或IgA)结合位点的位点处与该受体结合。因此，所述双特异性和多特异性分子的结合不被生理水平的免疫球蛋白所封闭。
[0073]在另一实施方案中，本发明的抗CLD18抗体与其他功能分子如其他肽和蛋白质(如Fab'片段)进行衍生、连接或共表达。例如，本发明的抗体可以与一种或多种其他分子实体功能性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价连接等)，所述分子实体例如其他抗体(如用于产生双特异性或多特异性抗体)、毒素、细胞配体或抗原(如用于产生免疫缀合物，如免疫毒素)。本发明的抗体可以与其他治疗部分连接，如放射性同位素、小分子抗癌药物、重组细胞因子或趋化因子。因此，本发明包括多种抗体缀合物、双特异性或多特异性分子和融合蛋白，它们均与CLD18表达细胞结合，并可用于将其他分子靶向到这些细胞。
[0074]在另一方面中，本发明提供组合物，如药物和诊断组合物/试剂盒，其包含与一种本发明抗体或本发明抗体组合配制在一起的可药用载体。在一个具体实施方案中，该组合物包含抗体组合，所述抗体与不同的表位结合，或者具有不同的功能特征，例如诱导CDC和/或ADCC以及诱导凋亡。在本发明的这一实施方案中，抗体可组合使用，例如作为包含两种或更多种抗CLD18单克隆抗体的药物组合物使用。例如，可将具有不同但互补的活性的抗CLD18抗体组合在单一治疗中，以实现所需疗效。在一个优选的实施方案中，该组合物包含介导⑶C的抗CLD18抗体与诱导凋亡的其他抗CLD18抗体的组合。在另一实施方案中，该组合物包含在效应细胞存在下介导高效杀伤靶细胞的抗CLD18抗体与抑制CLD18表达细胞生长的其他抗CLD18抗体的组合。
[0075]本发明还包括同时或依次施用两种或多种本发明的抗CLD18抗体，其中至少一种所述抗体为嵌合抗CLD18抗体，且至少一种其他抗体为人抗CLD18抗体，所述抗体结合CLD18中相同或不同的表位。优选地，首先施用本发明的嵌合CLD18抗体，其后施用本发明的人抗CLD18抗体，其中所述人抗CLD18抗体优选长期施用，即作为维持疗法。
[0076]本发明的抗体、免疫缀合物、双特异性和多特异性分子以及组合物可用于抑制表达CLD18 (特别是CLD18A2)的细胞生长和/或选择性杀伤表达CLD18 (特别是CLD18A2)的细胞的多种方法中，所述方法通过使所述细胞接触有效量的抗体、免疫缀合物、双特异性/多特异性分子或组合物从而抑制细胞的生长和/或杀伤细胞来实现。在一个实施方案中，所述方法包括杀伤表达CLD18的细胞，任选地在效应细胞存在下进行杀伤，例如通过CDC、凋亡、ADCC、吞噬作用或通过两种或更多种这些机制的组合。可以使用本发明抗体抑制或杀伤的CLD18表达细胞包括癌细胞，如致瘤性的胃、胰腺、食管、肺、卵巢、结肠、肝、头颈和胆囊细胞。
[0077]因此，本发明的抗体可用于治疗和/或预防多种涉及CLD18表达细胞的疾病，这通过对患这些疾病的患者施用抗体来实现。可以治疗(如改善)或预防的示例性疾病包括但不仅限于致瘤性疾病。可以治疗和/或预防的致瘤性疾病的实例包括胃癌、胰腺癌、食管癌、肺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌。
[0078]在本发明的一个具体实施方案中，施用抗体的受试者还另外用化学治疗剂、放射或调节(如增强或抑制)Fe受体(如Fe-Y受体如细胞因子)表达或活性的药剂进行治疗。用于在治疗期间施用的典型细胞因子包括粒细胞菌落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-Y (IFN-y)和肿瘤坏死因子(TNF)。典型治疗剂包括抗肿瘤剂如阿霉素、顺钼、多西紫杉醇、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、吉西他滨和环磷酰胺。
[0079]在另一实施方案中，本发明涉及用人CLD18或其肽片段优选是CLD18A2或其肽片段免疫非人动物如小鼠以获得抗体的免疫策略。用于免疫的优选肽为选自SEQ ID NO:2,
4、6、16、18、20-23和26-31的肽。因此，在一些优选的实施方案中，本发明的抗体为通过用选自SEQ ID NO:2、4、6、16、18、20-23和26-31的肽进行免疫而获得的抗体。类似地，可以在非人转基因动物如转基因小鼠中产生诊断CLD18的抗体。所述非人转基因动物可以是基因组中包含编码全部或部分抗体的重链转基因和轻链转基因的小鼠。
[0080]可以用CLD18抗原和/或核酸和/或表达CLD18或其肽片段的细胞的经纯化或富集的制剂来免疫野生型以及非人转基因动物。优选地，所述非人动物能够通过进行V-D-J重组和同种型转换而产生多种对CLD18的人单克隆抗体同种型(如IgG、IgA和/或IgM)。同种型转换可通过如经典或`非经典同种型转换而发生。
[0081]因此，在另一方面中，本发明提供来自上述非人动物的分离的B细胞。接着可通过与永生化细胞融合而使所述分离的B细胞永生化，以提供本发明抗体的来源(如杂交瘤)。这样的杂交瘤(即产生本发明抗体的杂交瘤)也包括在本发明的范围中。
[0082]如本文所示例的，本发明的抗体可直接得自表达该抗体的杂交瘤，或者可以克隆并在宿主细胞(如CHO细胞或淋巴细胞)中重组表达。宿主细胞的其他实例为微生物，如大肠杆菌，以及真菌，如酵母。作为替代的，它们可在非人转基因动物或植物中重组产生。
[0083]用于产生本发明抗体的优选杂交瘤为在DSMZ (Mascheroder Weg Ib, 31824Braunschweig, Germany ;新地址:Inhoffenstr.7B, 31824 Braunschweig, Germany)测序或保藏的杂交瘤，其命名和登记号如下:
[0084]a.182-D1106-055，登记号 DSM ACC2737，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0085]b.182-D1106-056，登记号 DSM ACC2738，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0086]c.182-D1106-057，登记号 DSM ACC2739，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0087]d.182-D1106-058，登记号 DSM ACC2740，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0088]e.182-D1106-059，登记号 DSM ACC2741，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0089]f.182-D1106-062，登记号 DSM ACC2742，保藏于 2005 年 10 月 19 日
[0090]g.182-D 1106-067，登记号 DSM ACC2743，保藏于 2005 年 10 月 19 日[0091]h.182-D758-035，登记号 DSM ACC2745，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0092]1.182-D758-036，登记号 DSM ACC2746，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0093]j.182-D758-040，登记号 DSM ACC2747，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0094]k.182-D1106-061，登记号 DSM ACC2748，保藏于 2005 年 11 月 17 日
[0095]1.182-D1106-279，登记号 DSM ACC2808，保藏于 2006 年 10 月 26 日
[0096]m.182-D1106-294，登记号 DSM ACC2809，保藏于 2006 年 10 月 26 日
[0097]n.182-D1106-362，登记号 DSM ACC2810，保藏于 2006 年 10 月 26 日。
[0098]本发明优选的抗体为通过上述杂交瘤产生并可得自上述杂交瘤的抗体——即对于182-D1106-055的情况为37G11，对于182-D1106-056的情况为37Η8，对于182-D1106-057 的情况为 38G5，对于 182-D1106-058 的情况为 38Η3，对于 182-D1106-059 的情况为39F11，对于182-D1106-062的情况为43Α11，对于182-D1106-067的情况为61C2，对于 182-D758-035 的情况为 26Β5，对于 182-D758-036 的情况为 26D12，对于 182-D758-040 的情况为28D10，对于182-D1106-061的情况为42Ε12，对于182-D1106-279的情况为125Ε1,对于182-D1106-294的情况为163Ε12，对于182-D1106-362的情况为17OT10——及其嵌合及人源化形式。
[0099]在一些优选的实施方案中，本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括含有如下重链恒定区(CH)的抗体，所述重链恒定区包含来自人重链恒定区的氨基酸序列，如SEQID NO:46或150所示氨基酸序列或其片段。在另一些优选的实施方案中，本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括含有如下轻链恒定区(CL)的抗体，所述轻链恒定区包含来自人轻链恒定区的氨基酸序`列，如SEQ ID NO:41或148所示氨基酸序列或其片段。在一个具体的优选实施方案中，本发明的抗体(特别是嵌合形式的抗体)包括含有如下重链恒定区(CH)并含有如下轻链恒定区(CL)的抗体，所述重链恒定区包含来自人重链恒定区的氨基酸序列，如SEQ ID NO:46或150所示氨基酸序列或其片段，所述轻链恒定区包含来自人轻链恒定区的氨基酸序列，如SEQ ID NO:41或148所示氨基酸序列或其片段。
[0100]包含SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的CH可由包含SEQ ID NO:45所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:150所示氨基酸序列的CH可由包含SEQ ID NO:149所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的CL可由包含SEQ ID NO:40所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:148所示氨基酸序列的CL可由包含SEQ ID NO:147所示核酸序列的核酸编码。
[0101]在某些优选的实施方案中，嵌合形式的抗体包括这样的抗体，其包含重链和/或轻链，所述重链含有选自SEQ ID N0:115、116、117、118、119、120及其片段的氨基酸序列，所述轻链含有选自SEQ ID NO:121、122、123、124、125、126、127、128、129及其片段的氨基酸序列。
[0102]在某些优选的实施方案中，嵌合形式的抗体包括这样的抗体，其包含选自以下可能性(i)至(ix)的重链和轻链的组合:
[0103]⑴包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO:122所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0104](ii)包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO:121所示氨基酸序列或其片段的轻链，[0105](iii)包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO:123所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0106](iv)包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO:126所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0107](V)包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO:125所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0108](vi)包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO:124所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0109](vii)包含SEQ ID NO: 120所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO:127所示氨基酸序列或其片段的轻链，
[0110](Viii)包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO:128所示氨基酸序列或其片段的轻链，和
[0111](ix)包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列或其片段的重链以及包含SEQ ID NO:129所示氨基酸序列或其片段的轻链。
[0112]上文使用的“片段”或“氨基酸序列的片段”涉及抗体序列的一部分，即代表N和/C端缩短的抗体序列的序列，其在替换抗体中的所述抗体序列时保留所述抗体对CLD18的结合，并优选保留所述抗体如本文所述的功能，例如CDC介导的裂解或ADCC介导的裂解。优选地，氨基酸序列的片段含有来自所述氨基酸序列的至少80 %、优选至少90 %、95 %、96%、97%、98%或 99%的氨基酸残基。选自 SEQ ID NO:115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128和129的氨基酸序列的片段优选涉及其中除去了 N端17、
18、19、20、21、22或23`个氨基酸的所述序列。本文所述氨基酸序列的片段可分别由编码所述氨基酸序列的核酸序列的片段编码。
[0113]包含SEQ ID NO:115所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO:100所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO:101所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:117所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO:102所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:119所示氨基酸序列的重链可由包含SEQID NO:104所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO:103所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:120所示氨基酸序列的重链可由包含SEQ ID NO:105所示核酸序列的核酸编码。
[0114]包含SEQ ID NO:122所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO:107所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:121所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO:106所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:123所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO:108所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:126所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQID NO:111所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:125所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO:110所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:124所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO:109所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO: 127所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO:112所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:128所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO:113所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:129所示氨基酸序列的轻链可由包含SEQ ID NO:114所示核酸序列的核酸编码。[0115]在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区(VH)，其含有选自SEQID NO:132,133，134，135，136，137及其片段的氨基酸序列。
[0116]在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含轻链可变区(VL)，其含有选自SEQID NO:138,139，140，141，142，143，144，145，146 及其片段的氨基酸序列。
[0117]在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包括这样的抗体，其包含选自以下可能性(i)至(ix)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合:
[0118]⑴包含SEQ ID NO:132所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:139所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0119](ii)包含SEQ ID NO:133所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:138所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0120](iii)包含SEQ ID NO:134所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:140所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0121](iv)包含SEQ ID NO: 136所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:143所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0122](V)包含SEQ ID NO: 135所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:142所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0123](vi)包含SEQ ID NO: 137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0124](vii)包含SEQ` ID NO:137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:144所示氨基酸序列或其片段的VL，
[0125](viii)包含SEQ ID NO: 137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:145所示氨基酸序列或其片段的VLJP
[0126](ix)包含SEQ ID NO: 137所示氨基酸序列或其片段的VH以及包含SEQ ID NO:146所示氨基酸序列或其片段的VL。
[0127]包含SEQ ID NO:132所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID N0:55所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:133所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID N0:56所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:134所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO:57所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:136所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ ID NO:59所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:135所示氨基酸序列的VH可由包含SEQ IDNO:58所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:137所示氨基酸序列的VH可由包含SEQID NO:60所示核酸序列的核酸编码。
[0128]包含SEQ ID NO:139所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID N0:62所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:138所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:61所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:140所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:63所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:143所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:66所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:142所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ IDNO:65所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:141所示氨基酸序列的VL可由包含SEQID NO:64所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:144所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:67所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:145所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:68所示核酸序列的核酸编码。包含SEQ ID NO:146所示氨基酸序列的VL可由包含SEQ ID NO:69所示核酸序列的核酸编码。
[0129]在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含VH，其含有选自以下实施方案(i)至(vi)的CDR1、CDR2和CDR3互补性决定区组:
[0130](i)CDRl:SEQ ID NO:115 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:115 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:115 的 116-125 位，
[0131](ii)CDRl:SEQ ID NO:116 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:116 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:116 的 116-126 位，
[0132](iii)CDRl:SEQ ID NO:117 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:117 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:117 的 116-124 位，
[0133](iv)CDRl:SEQ ID NO:118 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:118 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:118 的 116-126 位，
[0134](v)CDRl:SEQ ID NO:119 的 44-51 位，CDR2:SEQ ID NO:119 的 69-76 位，CDR3:SEQ ID NO:119 的 115-125 位，
[0135](vi)CDRl:SEQ ID NO:120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO:120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位。
[0136]在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含VL，其含有选自以下实施方案(i)至(ix)的CDR1、CDR2和CDR3互补性决定区组: [0137](i)CDRl:SEQ ID NO:121 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:121 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:121 的 115-123 位，
[0138](ii)CDRl:SEQ ID NO:122 的 49-53 位，CDR2:SEQ ID NO:122 的 71-73 位，CDR3:SEQ ID NO:122 的 110-118 位，
[0139](iii)CDRl:SEQ ID NO:123 的 47-52 位，CDR2:SEQ ID NO: 123 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:123 的 109-117 位，
[0140](iv)CDRl:SEQ ID NO:124 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:124 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:124 的 115-123 位，
[0141](v)CDRl:SEQ ID NO:125 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:125 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:125 的 115-123 位，
[0142](vi)CDRl:SEQ ID NO:126 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:126 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:126 的 115-122 位，
[0143](vii) CDRl:SEQ ID NO:127 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:127 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:127 的 115-123 位，
[0144](viii)CDRl:SEQ ID NO:128 的47-58位，CDR2:SEQ ID NO:128 的76-78位，CDR3:SEQ ID NO:128 的 115-123 位，和
[0145](ix)CDRl:SEQ ID NO:129 的 47-52 位，CDR2:SEQ ID NO:129 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:129 的 109-117 位。
[0146]在一个优选的实施方案中，本发明的抗体包含VH和VL，其分别含有选自以下实施方案⑴至(ix)的CDR1、CDR2和CDR3互补性决定区组:
[0147](i)VH:CDR1:SEQ ID NO: 115 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:115 的 70-77位，CDR3:SEQ ID NO:115 的 116-125 位，VL:CDR1:SEQ ID NO: 122 的 49-53 位，CDR2:SEQ ID NO:122的 71-73 位，CDR3:SEQ ID NO:122 的 110-118 位，
[0148](ii)VH:CDR1:SEQ ID NO:116 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:116 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:116 的 116-126 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:121 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:121 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:121 的 115-123 位，
[0149](iii) VH:CDR1:SEQ ID NO:117 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:117 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID NO:117 的 116-124 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:123 的 47-52 位，CDR2:SEQ IDNO:123 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:123 的 109-117 位，
[0150](iv)VH:CDR1:SEQ ID NO:119 的 44-51 位，CDR2:SEQ ID NO:119 的 69-76 位，CDR3:SEQ ID NO:119 的 115-125 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:126 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:126 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:126 的 115-122 位，
[0151](v)VH:CDR1:SEQ ID NO: 118 的 45-52 位，CDR2:SEQ ID NO:118 的 70-77 位，CDR3:SEQ ID N0:118的116-126位，VL:CDR1:SEQ ID NO:125 的 47-58 位，CDR2:SEQ ID NO:125的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:125 的 115-123 位，
[0152](vi)VH:CDR1:SEQ ID NO: 120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO: 120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:124 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:124 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:124 的 115-123 位，
[0153](vii) VH:CDR1:SEQ ID NO:120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO:120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:127 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:127 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:127 的 115-123 位，
[0154](viii) VH:CDR1:SEQ ID NO:120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO:120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:128 的 47-58 位，CDR2:SEQ IDNO:128 的 76-78 位，CDR3:SEQ ID NO:128 的 115-123 位，和
[0155](ix)VH:CDR1:SEQ ID NO: 120 的 45-53 位，CDR2:SEQ ID NO: 120 的 71-78 位，CDR3:SEQ ID NO:120 的 117-128 位，VL:CDR1:SEQ ID NO:129 的 47-52 位，CDR2:SEQ IDNO:129 的 70-72 位，CDR3:SEQ ID NO:129 的 109-117 位。
[0156]在另一些优选的实施方案中，本发明的抗体优选包含针对CLD18的单克隆抗体(优选本文所述针对CLD18的单克隆抗体)中重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的一个或多个互补性决定区(CDR)，优选至少包含CDR3可变区，并且优选包含本文所述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的一个或多个互补性决定区(CDR)，优选至少包含CDR3可变区。在一个实施方案中，所述一个或多个互补性决定区(CDR)选自本文所述的CDR1、CDR2和CDR3互补性决定区组。在一个特别优选的实施方案中，本发明的抗体优选包含针对CLD18的单克隆抗体(优选本文所述针对CLD18的单克隆抗体)重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3，并优选包含本文所述重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)的互补性决定区CDR1、CDR2和CDR3。
[0157]在一个实施方案中，如本文所述包含一个或多个⑶R、一组⑶R或⑶R组的组合的本发明抗体包含与其介入构架区(intervening framework region)在一起的所述⑶R。优选地，该部分还将包含第一个和第四个构架区中其一或其二的至少约50%、所述50%为第一个构架区的C端50%和第四个构架区的N端50%。构建通过重组DNA技术产生的本发明抗体可能导致在可变区的N端或C端引入接头编码的残基，所述接头的引入是为了便于克隆或其他操作步骤，包括引入接头以连接本发明的可变区与其他蛋白质序列，所述其他序列包括免疫球蛋白重链、其他可变结构域(例如在双抗体的产生中)或蛋白质标签。
[0158]在一个实施方案中，如本文所述包含一个或多个⑶R、一组⑶R或⑶R组的组合的本发明抗体在人抗体构架区中包含所述CDR。
[0159]本文中提到的在其重链中包含特定链或特定区域或特定序列的抗体优选涉及所述抗体的所有重链均包含所述特定链、区域或序列的情况。相应地，这也适用于抗体的轻链。
[0160]本发明还涉及核酸，其包含编码如本文所述抗体或其部分(如抗体链)的基因或核酸序列。该核酸可以包含在载体中，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者例如在遗传工程中常规使用的其他载体。所述载体可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所公知，可包括启动子、剪接盒以及翻译起始密码子。
[0161]优选地，本发明的核酸与允许在真核或原核细胞中表达的上述表达控制序列有效连接。确保在真核或原核细胞中表达的控制元件为本领域技术人员所熟知。
[0162]用于构建本发明核酸分子、构建包含上述核酸分子的载体、将载体引入正确选择的宿主细胞、引起或实现表达的方法在本领域中是公知的。
[0163]本发明的另一方面涉及包含本文所述核酸或载体的宿主细胞
[0164]本发明的其他特征和优点在以下详细描述和权利要求中将十分明显。`【专利附图】

【附图说明】
[0165]图1显示转染了与绿色荧光染料偶联的CLD18A2的HEK293细胞的免疫荧光分析，所述细胞与用SEQ ID NO: 15进行DNA免疫后的小鼠血清进行了反应，所述SEQ ID NO:15是与辅助表位(helper epitope)相融合的。
[0166]图 2 显示转染了 CLD18A2-myc(SEQ ID NO:3)的 HEK293 细胞及未转染的 HEK293细胞的Western印迹分析，所述分析使用单克隆小鼠抗c_myc抗体9E11 (Serotec, CRLMCA2200)进行。
[0167]图3显示使用转染了 CLD18A2的CHO细胞和多克隆兔抗CLD18抗体(Zymed，CRL38-8000)进行的免疫荧光分析。
[0168]图4A和B显示通过流式细胞术测定的杂交瘤上清液24H5和85A3与瞬时转染了人CLD18A2和荧光标记的HEK293细胞的结合。图4C显示杂交瘤上清液45C1、125E1、163E12、166E2和175D10与稳定转染了人CLD18A2并用碘化丙锭(propidium iodide)复染的HEK293细胞的结合。
[0169]图5显示通过流式细胞术测定的杂交瘤上清液24H5(A)、9E8(B)、26B5(C)和19B9 (D)与瞬时转染了荧光标记以及人CLD18A2或CLD18A2_Myc或CLD18A2-HA的HEK293细胞的结合。
[0170]图6A和B显示通过流式细胞术测定的杂交瘤上清液37H8、43A11、45C1和163E12与稳定转染了人CLD18A2或CLD18A1的HEK293细胞的结合。[0171]图7显示CLD18A2同工型特异性单克隆抗体37G11的免疫荧光分析，所述分析通过在天然(A、B)及多聚甲醛固定(C、D)条件下染色分别转染了 CLD18A2(A、C)和CLD18A1 (B、D)的 HEK293 细胞来进行。
[0172]图8显示CLD18单克隆抗体26B5的免疫荧光分析，所述分析通过在天然(A、B)及多聚甲醛固定(C、D)条件下染色分别转染了 CLD18A2(A、C)和CLD18A1 (B、D)的HEK293细胞来进行。
[0173]图9.细胞系 RT-PCR
[0174]使用CLD18A2特异性引物的RT-PCR分析显示在4/5的测试细胞系中有明确的表达。
[0175]图10显示DAN-G细胞(亚克隆F2)和多克隆兔抗CLD18抗体(Zymed，CRL38-8000)的免疫荧光分析。
[0176]图11显示KATO-1II细胞(亚克隆3B94D5)和多克隆兔抗CLD18抗体(Zymed，CRL38-8000)的免疫荧光分析。
[0177]图12A显示SNU-16细胞(亚克隆G5)与多克隆兔抗CLD18抗体(Zymed，CRL38-8000)的免疫荧光分析。图12B显示KATO-1II细胞与本发明单克隆抗体的免疫荧光分析。
[0178]图13显示CLD18在KATO-1II和NUGC-4细胞表面的表达，其通过用单克隆抗体61C2和163E12染色随后进行 流式细胞术来进行分析。
[0179]图 14.人 CLD18A1 (NP_057453)、人 CLD18A2 (NP_001002026)、小鼠CLD18A1 (NP_062789)和小鼠 CLD18A2 (AAL15636)的蛋白质比对。
[0180]图15A和B显示通过流式细胞术分析的杂交瘤上清液38G5、38H3、37G11、45C1和163E12分别与瞬时转染了荧光标记以及小鼠CLD18A1或小鼠CLD18A2的HEK293细胞的结
八
口 ο
[0181]图16.使用多克隆抗体pl05进行的免疫组化分析
[0182]对正常组织亚组(胃、肺、骨髓和前列腺)的免疫组化染色证实了胃组织特异性(A)。还在胃癌(上面一行)和肺癌(B)中检测到了表达。仅分化细胞表达CLD18A2，但干细胞不表达(C)。
[0183]图17.使用单克隆抗体39F11D7进行的免疫组化分析
[0184](A)在正常胃粘膜中检测到特异性蛋白质表达，而测试的所有其他正常组织均为阴性。
[0185](B)在胃癌和肺癌中发现强CLD18A2表达。
[0186]图18.使用单克隆抗体 26B5(A)、17?10(B)、43A11(C)、163E12(D)和 45C1 (E)进行的免疫组化分析。所有抗体均显示HEK293-CLD18A2异种移植肿瘤和胃癌标本的强染色，而用HEK293-模拟对照转染的肿瘤则不然。
[0187]图19是比较通过85A3、28D10、24H5或26D12诱导针对稳定转染了人CLD18A2的HEK293细胞的CDC之后死细胞百分比的图，使用流式细胞术测定。
[0188]图 20 是通过 24H5、26D12、28D10、37G11、37H8、38G5、38H3、39F11、41C6、42E12、43A11、44E10、47D12或61C2诱导针对稳定转染了人CLD18A2或人CLD18A1的贴壁CHO细胞的CDC之后特异性细胞裂解百分比的图，通过荧光测量来测定。[0189]图21显示75B8(A)、28D10(B)或37H8 (C)浓度依赖性诱导针对稳定转染了人CLD18A2的CHO细胞的⑶C，通过荧光测量来测定。
[0190]图22显示在MNC存在下26B5、37H8、38G5、47D12和61C2分别诱导的HEK293-CLD18A2 细胞裂解。
[0191]图23显示在MNC存在下26B5、37H8、38G5、47D12和61C2分别诱导的HEK293-CLD18A1 细胞裂解。
[0192]图24显示在使用HEK293-CLD18A2细胞的早期治疗异种移植模型中本发明抗体对肿瘤生长的抑制。
[0193]图25A和B显示在两种使用HEK293-CLD18A2细胞的早期治疗异种移植模型中通过使用本发明抗体治疗的存活延长。
[0194]图26显不在使用HEK293-CLD18A2细胞的深度治疗(advanced treatment)异种移植模型中通过本发明抗体的存活延长。
[0195]图27A显示在早期治疗异种移植模型中通过本发明抗体的肿瘤生长抑制。图27B显示早期治疗异种移植模型中通过本发明抗体的存活延长。使用内源表达CLD18A2的DAN-G细胞。
[0196]图28显示小鼠组织中的CLD18A2mRNA表达。使用CLD18A2特异性引物的RT-PCR研究显示，在除胃以外的所有所测试正常组织中均无显著表达。分析了以下正常组织:1:小肠，2:脾，3:皮肤，4:胃，5:肺，6:胰腺，7:淋巴结，8:胸腺，9:阴性对照。
[0197]图29显示正常胃中的CLD18表达。使用CLD18特异性抗体的小鼠胃免疫组化分析显示了保守的表达模式。尽管表面上皮和更深处的隐窝(crypt)在其细胞表面表达CLD18，但中央颈部区(central ne`ck region)为CLD18阴性。
[0198]图30显示小鼠胃组织的苏木精和伊红染色。显示了用37G11处理的小鼠与仅用PBS处理的对照小鼠(C和D)的胃的概况(A)和细节(B)。
[0199]图31A和B显示使用本发明抗体(43A11、125E1、163E12、166E2和175D10)对分别稳定转染了 CLD18A1和A2的HEK293细胞以及内源性表达的KATO-1II细胞进行的流式细胞染色。
[0200]图32显示本发明嵌合抗体介导的对CLD18A2表达细胞的⑶C。
[0201]图33显示本发明嵌合抗体介导的对KATO-1II细胞的ADCC。
【具体实施方式】
[0202]本文所述抗体可以是与CLD18上存在的表位特异性结合的分离的单克隆抗体。本发明涵盖的分离的单克隆抗体包括IgA、IgGl-4、IgE、IgM和IgD抗体。在一个实施方案中，所述抗体为IgGl抗体，更具体地为IgGl K或IgGl λ同种型。在另一实施方案中，所述抗体为IgG3抗体，更具体地为IgG3K或IgG3X同种型。在另一实施方案中，所述抗体为IgG4抗体更特别地为IgG4K或IgG4X同种型。在另一实施方案中，所述抗体为IgAl或IgA2抗体。在另一实施方案中，所述抗体为IgM抗体。
[0203]在一个实施方案中，本发明涉及这样的抗体，其与表达CLD18的细胞特异性结合，并且优选地(i)与表达CLD18A2的细胞结合，并且(ii)不与不表达CLD18A2但表达CLD18A1的细胞结合。本发明的抗体优选地⑴介导杀伤表达CLD18A2的细胞，并且(ii)不介导杀伤不表达CLD18A2但表达CLD18A1的细胞。
[0204]在另一实施方案中，本发明涉及这样的抗体，其(i)与表达CLD18的肿瘤细胞结合，(ii)不与表达CLD18的正常胃粘膜细胞结合，和/或(iii)不与表达CLD18的非癌肺组织细胞结合。
[0205]本发明还包括这样的抗体，其⑴介导杀伤表达CLD18的肿瘤细胞，(ii)不介导杀伤表达CLD18的正常胃粘膜细胞，和/或(iii)不介导杀伤表达CLD18的非癌肺组织细胞。
[0206]在一些具体的实施方案中，本发明的抗体(i)结合CLD18A2上不存在于CLD18A1上的表位，优选SEQ ID NO:21、22和23，(ii)结合位于CLD18A2环I上的表位，优选SEQ IDNO:28, (iii)结合位于CLD18A2环2上的表位，优选SEQ ID NO:30，(iv)结合位于CLD18A2环D3上的表位，优选SEQ ID NO:31，(V)结合包括CLD18A2环I和CLD18A2环D3的表位，(vi)结合位于CLD18A2环D3上的非糖基化表位，优选SEQ ID N0:29，或者(vii)结合人和小鼠 CLD18 中存在的表位(分别为 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:37)。
[0207]在一些特别优选的实施方案中，本发明的抗体结合CLD18A2上不存在于CLD18A1上的表位。
[0208]本发明的抗体包括全人抗体。这样的抗体可以在非人转基因动物(如转基因小鼠)中产生，所述转基因动物能够通过进行V-D-J重组和同种型转换而产生多种针对CLD18的人单克隆抗体同种型。这样的转基因动物还可以是如US 2003/0017534所公开的用于产生多克隆抗体的转基因兔。
[0209]本发明抗体与CLD1 8抗原的结合可介导杀伤表达CLD18的细胞(如肿瘤细胞)，例如通过激活补体系统来介导。对表达CLD18的细胞的杀伤可通过一种或多种以下机制发生:表达CLD18的细胞的补体依赖性细胞毒性(⑶C);表达CLD18的细胞的凋亡；表达CLD18的细胞的效应细胞吞噬作用；或者表达CLD18的细胞的效应细胞抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
[0210]为了更易于理解本发明，首先定义一些术语。其他定义在详述全文中公开。
[0211]术语定义
[0212]术语“CLD18”指密蛋白_18，并包括细胞天然表达的或转染了 CLD18基因的细胞所表达的任何CLD18的变体(包括CLD18A1和CLD18A2)、构象、同工型(isoform)和种间同源物(species homologs)。优选地，“CLD18” 指人 CLD18，特别是 CLD18A2 (SEQ ID N0:l、2)和 / 或 CLD18A1 (SEQ ID NO:7、8)，更优选 CLD18A2。
[0213]术语“CLD18A1”包括细胞天然表达的或转染了 CLD18A1基因的细胞所表达的任何人CLD18A1的翻译后修饰变体、同工型和种间同源物。
[0214]术语“CLD18A2”包括细胞天然表达的或转染了 CLD18A2基因的细胞所表达的任何人CLD18A2的翻译后修饰变体、同工型和种间同源物。
[0215]术语“CLD18变体”应包括(i) CLD18剪接变体，(ii) CLD18翻译后修饰变体，特别是包括N糖基化状态不同的变体，(iii)CLD18构象变体，特别是包括CLD18-构象-1、CLD18-构象-2和CLD18-构象-3，(iv)位于胞间紧密连接处的游离CLD18和同型/异型相关联变体，(v)CLD18癌症相关变体和CLD18非癌症相关变体。[0216]术语“膜筏(raft) ”指位于细胞质膜外小叶区中的富含鞘脂和胆固醇的膜微结构域。某些蛋白质结合到这些结构域中的能力及其形成“聚集体”或“病灶聚集体”的能力可影响该蛋白质的功能。例如，CLD18分子在结合本发明抗体后迁移到这些结构中，这在质膜中产生高密度的CLD18抗原-抗体复合物。这些高密度的CLD18抗原-抗体复合物能在CDC过程中有效活化补体系统。
[0217]术语“构象”和“拓扑”描述整合的膜分子如何定位在细胞表面的膜中，特别地，其哪个区域在胞外并因而适合结合抗体。例如，CLD18可以三种不同构象存在，这很可能取决于它是否以同聚体或异聚体为优势，或者它是整合在超分子紧密连接结构中还是“游离的”。这些不同的状态导致不同的表位适于结合抗体。
[0218]根据本发明，术语“疾病”指任何病理状态，包括癌症，特别是本文所述的癌症形式。
[0219]“肿瘤”指一组异常的细胞或组织，它们通过快速、不受控制的细胞增殖来生长，并在起始该新生物生长的刺激停止后仍继续生长。肿瘤显示出部分或完全缺失结构的组织以及与正常组织的功能协调，并通常形成可以为良性或恶性的独特组织块。
[0220]“转移”指癌细胞从其原始部位传播到身体的其他部位。转移的形成是非常复杂的过程，依赖于恶性细胞从原发肿瘤中脱离、侵袭胞外基质、透过内皮基底膜以进入体腔和血管以及其后由血转运后浸润靶器官。最后，新肿瘤在靶部位的生长依赖于血管发生。肿瘤转移经常甚至在切除原发肿瘤后发生，因为肿瘤细胞或组分可能残留并发展出转移潜力。在一个实施方案中，本发明的术语“转移”指“远端转移”，这是指远离原发肿瘤和局部淋巴结系统的转移。
[0221]术语“治疗疾病”包括疾病或其症状的治疗、持续时间的缩短、改善、预防、延缓或抑制其发展或恶化，或者延缓其发作。
[0222]根据本发明，样`品可以是根据本发明可用的任何样品，特别是生物样品如组织样品(包括体液)和/或细胞样品，并可以常规方式获得，例如通过组织活检(包括钻孔活检)和通过收集血、支气管灌洗液、痰、尿、排泄物或其他体液来获得。根据本发明，术语“生物样品”还包括生物样品的级分。
[0223]术语“抗体”指包含通过二硫键互联的至少两条重(H)链和两条轻(L)链或其抗原结合片段的糖蛋白。术语“抗体”还包括抗体(特别是本文所述抗体)的所有重组形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及与抗原结合的抗体片段和下文所述的衍生物。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。VH和VL区可进一步细分为称为互补性决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守区域中。每条VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列:FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导该免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(Clq)。
[0224]术语“人源化抗体”指具有基本来自非人物种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子其余的免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域，或者仅包含移植到可变结构域中适当构架区的互补性决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的，或者通过一个或多个氨基酸替换进行修饰，例如进行修饰以与人免疫球蛋白更为相近。某些形式的人源化抗体保留了全部CDR序列(例如含有来自小鼠抗体的全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。其他形式具有一个或多个相对于原始抗体而言发生了改变的CDR。
[0225]术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其中每个重链和轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源，或者属于特定的类别，而该链的其余区段则与另一物种中的相应序列同源。一般地，轻链和重链的可变区均模拟来自一个哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种的抗体序列同源。这种嵌合形式的一个明显优点是可使用易于获得的B细胞或来自非人宿主生物的杂交瘤从目前已知的来源中方便地产生可变区，而与其组合的恒定区来自例如人细胞制备物。所述可变区具有易于制备的优点，并且特异性不受来源的影响，而由于恒定区为人类，因此该抗体在注射时引发人受试者免疫应答的可能性将比恒定区来自非人来源时更低。然而，定义不限于此具体实例。
[0226]本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“结合部位”)指抗体中保留特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。已经显示，抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来实现。属于抗体的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH结构域组成的一价片段；(ii)F(ab' ) 2片段，包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(V)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546) ； (vi)独立的互补性决定区(O)R),和(vii)可任选地通过合成接头连接的两个或更多个独立的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但它们可使用重组方法通过合成接头连接在一起，所述接头使它们成为单个蛋白质链，其中VL和VH区配对形成一价分子(称为单链Fv(SCFv)，参阅如Bird等(1988)Science 242:423-426 和 Huston 等(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体还旨在包括于术语抗体的“抗原结合部分”中。另一实例为包含以下部分的结合结构域免疫球蛋白融合蛋白:(i)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽，(ii)与该铰链区融合的免疫球 蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。所述结合结构域多肽可以是重链可变区或轻链可变区。所述结合结构域免疫球蛋白融合蛋白在US 2003/0118592和US 2003/0133939中有进一步描述。这些抗体片段使用本领域技术人员公知的常规技术获得，并以与完整抗体相同的方式筛选所述片段。
[0227]术语“表位”指能够与抗体结合的蛋白质决定簇，其中术语“结合”在本文中优选指特异性结合。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象表位与非构象表位的区别在于在变性剂存在下前者丧失结合，而后者则不然。
[0228]本文使用的术语“不连续表位”指蛋白质抗原上由至少两个蛋白质一级序列中独立的区域组成的构象表位。
[0229]术语“双特异性分子”旨在包括具有两种不同结合特异性的任何试剂，如蛋白质、肽或者蛋白质或肽复合物。例如，该分子可与(a)细胞表面抗原，和(b)效应细胞表面的Fe受体结合或相互作用。术语“多特异性分子”或“异种特异性分子”旨在包括具有多于两种不同结合特异性的任何试剂，如蛋白质、肽或者蛋白质或肽复合物。例如，例如，该分子可与(a)细胞表面抗原，(b)效应细胞表面的Fe受体，和(C)至少一种其他组分结合或相互作用。因此，本发明包括但不仅限于针对CLD18并针对其他靶标(如效应细胞上的Fe受体)的双特异性、三特异性、四特异性和其他多特异性分子。术语“双特异性抗体”还包括双抗体。双抗体是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短，以至于不允许同一链上的两个结构域配对，从而迫使结构域与另一链上的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参阅如Holliger, P.,等(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R.J.，等(1994)Structure 2:1121-1123)。
[0230]本发明还包括本文所述抗体的衍生物。术语“抗体衍生物”指抗体的任何修饰形式，例如抗体与另一试剂或抗体的缀合物。在如下情况下本文中使用抗体“来自”特定生殖系序列:即如果抗体通过免疫动物或通过筛选免疫球蛋白基因文库而得自一系统，并且其中所选抗体的氨基酸序列与该生殖系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列具有至少90%、更优选至少95 %、甚至更优选至少96 %、97 %、98 %或99 %的同一性。通常，来自特定生殖系序列的抗体将与该生殖系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列显示不多于10个氨基酸差异，更优选不多于5个氨基酸差异，或者甚至更优选不多于4、3、2或I个氨基酸差异。
[0231]本文使用的术语“异源抗体”指连接在一起的两个或更多个抗体、其衍生物或抗原结合区，其中至少两个具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞表面的Fe受体的结合特异性以及对靶细胞(如肿瘤细胞)上的抗原或表位的结合特异性。
[0232]本文所述的抗体可以是人抗体。本文使用的术语“人抗体”旨在包括具有来自人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包含不是由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
[0233]本文使用的术语“单克隆抗体”指单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体显示对特定表位的单结合特`异性和亲和性。在一个实施方案中，单克隆抗体通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的得自非人动物(例如小鼠)的B细胞。
[0234]本文使用的术语“重组抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体，例如(a)从免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞(如转染瘤)中分离的抗体，(C)从重组的组合抗体文库中分离的抗体，和(d)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接成DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。
[0235]本文使用的术语“转染瘤”包括表达抗体的重组真核宿主细胞，例如CHO细胞、NS/0细胞、HEK293细胞、HEK293T细胞、植物细胞或真菌(包括酵母)细胞。
[0236]本文使用的术语“异源抗体”就产生这种抗体的转基因生物进行定义。该术语指这样的抗体，其氨基酸序列或编码核酸序列对应于不包括该转基因生物的生物，并且通常来自与该转基因生物不同的物种。
[0237]本文使用的术语“异源杂合抗体(heterohybrid antibody) ”指具有生物来源不同的轻链和重链的抗体。例如，具有与小鼠轻链连接的人重链的抗体是异源杂合抗体。
[0238]本文所述抗体优选是分离的。本文使用的术语“分离的抗体”旨在指基本不含抗原特异性不同之其他抗体的抗体(例如，特异性结合CLD18的分离抗体基本不含特异性结合除CLD18以外抗原的抗体)。然而，与人CLD18的表位、同工型或变体特异性结合的分离的抗体可与其他相关抗原(如来自其他物种的抗原，如CLD18种间同源物)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，“分离的”单克隆抗体的组合指具有不同特异性并组合在明确确定的组合物中的抗体。
[0239]根据本发明，术语“结合”优选指“特异性结合”。本文使用的术语“特异性结合”指与预定抗原结合的抗体。通常，抗体结合的亲和力对应于约IX 10_7M或更小的KD，并且与预定抗原结合的亲和力所对应的Kd比其结合除该预定抗原以外的非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)或密切相关抗原的亲和力低至少两个数量级。
[0240]本文使用的术语“KD” (M)旨在指特定的抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。
[0241]本文使用的术语“同种型”指重链恒定区基因所编码的抗体类别(如IgM或IgGl)。
[0242]本文使用的术语“同种型转换”指抗体的类别或同种型由一个Ig类别变成另一 Ig类别的现象。
[0243]应用于某对象时，本文使用的术语“天然存在的”指该对象可见于自然界这一事实。例如，存在于可从自然界来源分离的生物(包括病毒)中，并且在实验室中未有意进行人工修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
[0244]本文使用的术语“重排”指重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型，其中V区段在编码基本完整VH或VL结构域的构象中分别位于紧邻D-J或J区段的位置。重排的免疫球蛋白(抗体)基因座可通过与生殖系DNA的比较来鉴定，重排的基因座将具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源性元件。
[0245]涉及V区段时 ，本文使用的术语“未重排的”或“生殖系构型”指V区段未重组为与D或J区段紧邻的构象。
[0246]本文使用的术语“核酸分子”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选为双链DNA。
[0247]本发明所述的核酸优选是分离的。根据本发明，术语“分离的核酸”指该核酸是(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。分离的核酸是可通过重组DNA技术操作的核酸。
[0248]根据本发明，核酸单独存在或与其他核酸组合存在，所述其他核酸可以是同源或异源的。在一些优选的实施方案中，核酸与表达控制序列功能性连接，所述表达控制序列对于所述核酸可以是同源或异源的。术语“同源”指还天然地与表达控制序列功能性连接的核酸，术语“异源”指核酸不是天然地与该表达控制序列连接。
[0249]如果表达RNA和/或蛋白质或肽的核酸与表达控制序列以所述核酸的表达或转录处在所述表达控制序列的控制或影响之下的方式彼此共价连接，则它们彼此“功能性”连接。如果该核酸待翻译成功能性蛋白质，而其带有与编码序列功能性连接的表达控制序列，所述表达控制序列的诱导引起所述核酸的转录，而不导致编码序列中的移码或导致所述序列不能翻译成所需蛋白质或肽。
[0250]根据本发明，术语“表达控制序列”包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调苄基因转录或mRNA翻译的其他控制元件。在本发明的一些具体实施方案中，所述表达控制序列可受到调节。表达控制序列的确切结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5'非转录序列和5'及3'非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5'非转录表达控制序列包含启动子区，启动子区包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。表达控制序列还可包括增强子序列或上游活化子序列。
[0251]根据本发明，术语“启动子”或“启动子区”指这样的核酸序列:其位于所表达核酸序列的上游(5')，并通过提供RNA聚合酶的识别和结合位点来控制该序列的表达。“启动子区”可包括用于参与基因转录调节的其他因子的其他识别和结合位点。启动子可控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以为“诱导型”，可应答于诱导物而起始转录，或者如果转录不受诱导物的控制则可以为“组成型”。如果诱导剂不存在，则诱导型启动子控制下的基因不表达，或表达程度很低。存在诱导物时，该基因开始转录，或者转录水平提高。一般而言，这通过特异性转录因子的结合来介导。
[0252]本发明优选的启动子包括用于SP6、T3和T7聚合酶的启动子、人U6RNA启动子、CMV启动子及其人工杂合启动子(如CMV)，其中启动子的某部分与其他细胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子的某部分融合，并包含或不包含额外的内含子。
[0253]根据本发明，术语“表达”以其最普遍的意义使用，包括产生RNA或者RNA和蛋白质/肽。还包括核酸的部分表达。此外，表达可瞬时进行或稳定进行。
[0254]在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子存在于载体中，适当时还带有控制该核酸表达的启动子。术语“载体”在本文中以其最普遍的意义使用，包括用于核酸的任何中间载体，所述载体使得所述核酸能够例如引入原核和/或真核细胞中，并且适当时整合进基因组。这类载体优选在该细胞中复制和/或表达。本文使用的术语“质粒”一般指能独立于染色体DNA进行复制的染色体外的遗传物质,通常为环状DNA双链体。
[0255]就用于表达抗体的载体而言，抗体重链及轻链存在于不同载体中的载体类型和重链及轻链存在于同一载体中`的载体类型均可使用。
[0256]本文就特定核酸和氨基酸序列(如序列表中所示)而言提供的教导应理解为还涉及对所述特定序列的修饰，所述修饰产生与所述特定序列功能等价的序列，例如显示与该特定氨基酸序列相同或相似的特性的氨基酸序列，以及编码显示与该特定核酸序列所编码氨基酸序列相同或相似的特性的氨基酸序列的核酸序列。一个重要的特性是保留抗体与其靶标的结合，或者维持抗体的效应子功能。优选地，就特定序列而言进行了修饰的序列在替换抗体中的该特定序列时保留所述抗体与CLD18的结合，并优选保留所述抗体如本文所述的功能，例如CDC介导的裂解作用或ADCC介导的裂解作用。
[0257]本领域技术人员会理解，特别是可以修饰CDR、高变区和可变区的序列而不丧失结合CLD18的能力。例如，CDR区可以与本文所述区域相同或高度同源。“高度同源”认为是可以在⑶R中产生I至5、优选I至4例如I至3或I或2个替换。此外，高变区和可变区可被修饰，从而与本文具体公开的区域显示显著的同源性。
[0258]应该理解，本文所述的特定核酸还包括为了优化特定宿主细胞或生物中的密码子使用而进行了修饰的核酸。生物之间密码子使用的差异可引起多种关于异源基因表达的问题。通过改变原始序列中的一个或多个核苷酸而进行密码子优化可在待表达所述核酸的同源或异源宿主中引起核酸表达的优化，特别是翻译效率的优化。例如，如果需根据本发明使用来自人并编码抗体恒定区和/或构架区的核酸，例如用于制备嵌合或人源化抗体，则为了优化密码子使用而修饰所述核酸可能是优选的，特别是在如果所述核酸(任选地与异源核酸如来自其他本文所述生物的核酸融合)需在不同于人的其他生物(如小鼠或仓鼠)细胞中表达的情况下。例如，分别编码人轻链和重链恒定区的核酸序列(如SEQ ID N0:40和45的序列)可经修饰，以包含一个或多个、优选至少1、2、3、4、5、10、15、20个并优选多达10、15、20、25、30、50、70或100个或更多核苷酸替换，所述替换引起密码子使用的优化，但不引起氨基酸序列的改变。这样的核苷酸替换优选指分别将SEQ ID NO:40和45中的核苷酸替换为不引起所编码氨基酸序列改变的经修饰的对应物，所述核苷酸分别选自下文SEQID NO:40和45的比对中所述的替换；或者指分别编码人轻链和重链恒定区的其他核酸序列中相应位置的相应替换。优选地，在编码人轻链和重链恒定区的核酸序列中分别实现下文SEQ ID NO:40和45的比对中所示的全部替换，所述替换使用不引起所编码氨基酸序列改变的经修饰对应物。
[0259]SEQ ID NO:40 与 SEQ ID NO:147 的比对:
[0260]
【权利要求】
1.能够结合CLD18并介导杀伤CLD18表达细胞的抗体。
2.权利要求1的抗体，所述抗体结合CLD18A1和CLD18A2。
3.权利要求1的抗体，所述抗体结合CLD18A2但不结合CLD18A1。
4.权利要求1-3中任一项的抗体，其中所述对细胞的杀伤是通过所述抗体与所述细胞表达的CLD18结合诱导的。
5.权利要求1-4中任一项的抗体，其中所述对细胞的杀伤是通过所述抗体与所述细胞表达的CLD18A2结合诱导的。
6.权利要求1-5中任一项的抗体，其中所述对细胞的杀伤不是通过所述抗体与所述细胞表达的CLD18A1结合诱导的。
7.权利要求1-6中任一项的抗体，其中所述CLD18表达细胞为癌细胞。
8.权利要求7的抗体，其中所述癌细胞选自致瘤性的胃癌、食管癌、胰腺癌和肺癌细胞。
9.权利要求1-8中任一项的抗体，所述抗体通过诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的裂解、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬作用来介导所述对细胞的杀伤。
10.权利要求1-9中任一项的抗体，所述抗体通过诱导CDC介导的裂解和/或ADCC介导的裂解来介导所述对细胞的杀伤。
11.权利要求1-10中任一 项的抗体，所述抗体不诱导所述细胞的CDC介导的裂解。
12.权利要求9-11中任一项的抗体，其中所述ADCC介导的裂解在效应细胞存在下发生，所述效应细胞选自单核细胞、单个核细胞、NK细胞和PMN。
13.权利要求9-12中任一项的抗体，其中所述吞噬作用通过巨噬细胞来实现。
14.权利要求1-13中任一项的抗体，所述抗体为单克隆抗体、嵌合抗体或人源化抗体或者抗体片段。
15.权利要求1-14中任一项的抗体，所述抗体选自IgGl、IgG2优选IgG2a和IgG2b、IgG3、IgG4、IgM、IgAU IgA2、分泌性 IgA、IgD 和 IgE 抗体。
16.权利要求2-15中任一项的抗体，其中CLD18A2具有SEQIDNO:2的氨基酸序列。
17.权利要求2-16中任一项的抗体，其中CLD18A1具有SEQIDNO:8的氨基酸序列。
18.权利要求1-17中任一项的抗体，所述抗体与活细胞表面存在的CLD18的天然表位≤口口 ?
19.权利要求1-18中任一项的抗体,所述抗体对癌细胞优选胃癌细胞具有特异性。
20.权利要求1-19中任一项的抗体，其中所述CLD18在所述细胞的表面上表达。
21.权利要求1-20中任一项的抗体，所述抗体可通过包括以下步骤的方法获得:用具有选自SEQ ID N0:2、4、6、16、18、20-23和26-31的氨基酸序列的蛋白质或肽或其免疫原性片段或者表达所述蛋白质或肽或其免疫原性片段的核酸或宿主细胞来免疫动物。
22.由以下列登记号保藏的克隆所产生的抗体:DSMACC2737，DSM ACC2738，DSMACC2739, DSM ACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSMACC2743, DSM ACC2745, DSMACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSMACC2808, DSM ACC2809 或DSM ACC2810。
23.能产生权利要求1至22中任一项的抗体的杂交瘤。
24.以下列登记号保藏的杂交瘤:DSMACC2737，DSM ACC2738, DSM ACC2739, DSMACC2740, DSM ACC2741, DSM ACC2742, DSM ACC2743, DSMACC2745, DSM ACC2746, DSM ACC2747, DSM ACC2748, DSM ACC2808, DSMACC2809 或DSM ACC2810。
25.缀合物，其包含与治疗剂偶联的权利要求1至22中任一项的抗体。
26.权利要求25的缀合物，其中所述治疗剂为毒素、放射性同位素、药物或细胞毒剂。
27.药物组合物，其包含权利要求1至22中任一项的抗体和/或权利要求25或26的缀合物以及可药用载体。
28.抑制表达CLD18的细胞生长和/或杀伤所述细胞的方法，包括使所述细胞接触权利要求I至22中任一项的抗体和/或权利要求25或26的缀合物。
29.治疗或预防与CLD18表达细胞相关的疾病或病症的方法，包括对受试者施用权利要求I至22中任一项的抗体、权利要求25或26的缀合物或权利要求27的药物组合物。
30.权利要求29的方法，其中所述疾病或病症为肿瘤相关疾病。
31.权利要求30的方法，其中所述肿瘤相关疾病选自胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、头颈癌和膀胱癌。
32.权利要求28-31中任一项的方法，其中所述CLD18为CLD18A2。
33.权利要求28-32中任一项的方法，其中所述CLD18在所述细胞的表面上表达。
【文档编号】C12R1/91GK103509114SQ201310314152
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2006年11月24日 优先权日:2005年11月24日
【发明者】乌尔·沙欣, 厄兹莱姆·图雷奇, 迪尔克·乌泽纳, 斯特凡·弗里茨, 克里斯托夫·乌赫雷克, 贡达·勃兰登堡, 哈拉尔德-格哈德·格佩特, 安雅·克里斯蒂娜·施罗德, 菲利普·蒂尔 申请人:加尼梅德药物公司, 约翰内斯·古滕伯格美因兹大学，由校长代表