一种人工合成的信号肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种人工合成的信号肽及其应用。本发明的信号肽的氨基酸序列为SEQIDNO:5。本发明的信号肽可添加于哺乳动物细胞表达载体,用于引导哺乳动物来源蛋白分泌表达，可将其在动物细胞中的外源蛋白表达量提高。
【专利说明】一种人工合成的信号肽及其应用
[0001] 本案为以下专利申请的分案申请：
[0002] 申请号：201210118230. 9 ;
[0003] 申请日：2012年4月20日；
[0004] 发明名称：一种人工合成的信号肽及其应用
【技术领域】
[0005] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及用于引导哺乳动物来源蛋白质在哺乳动物细 胞中分泌表达的信号肽及其应用。 技术背景
[0006] 外源基因在宿主细胞中的高效表达是蛋白质的结构和功能分析、蛋白质或多肽类 药物研究开发的先决条件。用于表达重组蛋白的表达体系有微生物、植物、酵母、昆虫细胞 和动物细胞等。哺乳动物细胞是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主，其优势在于能正确有 效地识别真核蛋白的合成、加工和分泌信号，识别和去除基因中的内含子，再经剪切加工成 为成熟的mRNA，能准确地完成糖基化、磷酸化，形成链内和链间二硫键及蛋白水解等翻译后 加工过程，因而产生的完整抗体和天然抗体一样，具有生物学活性，既可识别抗原又可激活 补体系统。哺乳动物细胞易被重组的DNA转染，经过筛选可得到转化的细胞，具有遗传稳定 性和可重复性，表达的产物分泌到培养基中易于纯化。利用哺乳动物细胞表达蛋白产物已 广泛应用于生物制品工业，如病毒疫苗、抗体、干扰素、免疫调节剂、激素、和生长因子等的 大量制备。但动物细胞外源蛋白表达效率低，且成本高，因此提高动物细胞外源蛋白表达效 率，降低生产成本是当前工作中的重中之重。
[0007] 影响外源蛋白质在哺乳动物细胞中的因素很多，如信号肽、转录和翻译控制因子、 RNA加工（RNA Processing)、基因拷贝的数目、mRNA的稳定性、外源基因在染色体上的整合 位点、重组蛋白对宿主细胞的潜在毒性和宿主细胞的基因组偏好性（genetic properties) 等。在表达载体已经确定的情况下，信号肽的选择就显得至关重要了。
[0008] 分泌蛋白的N-端通常由可被剪切的15_30Aa的前导顺序组成，此顺序称为信号肽 (signal sequence),在N-端或靠近N端处有2-3个极性Aa，而在信号肽的中部都是一个 唯一的疏水核心或者由很多的疏水Aa构成。信号肽中没有其它保守顺序也没有酸性基团。 和导肽相似，信号肽也是可足以将任何附加的多肽转运进靶膜。例如将信号肽加在珠蛋白 的N-端，就可使它不再留在胞液中，而是穿过膜而分泌到胞外。
[0009] 信号肽可使正在翻译的核糖体附着到RER膜上。核糖体是通过信号肽的功能而附 着并合成分泌蛋白的。因此游离的核糖体和膜结合核糖体之间本身并无差异。信号肽是作 为一种附着到ER膜上的信号识别，此可能通过开始合成出的N-端头几个氨基酸的疏水功 能。然后蛋白链插进膜中，信号肽埋在膜中的一种蛋白酶所剪切这时核糖体已完成翻译，蛋 白已延着导肽途经穿过膜。信号肽分泌外源蛋白的作用如下：
[0010] 1)信号肽能够引导分泌蛋白或膜蛋白出胞。
[0011] 2)信号肽的疏水核心决定蛋白质的分泌效率。
[0012] 3)信号肽能够引导蛋白质在细胞内不同区域或不同细胞器进行正确的定位。
[0013] 4)信号肽能够分泌增强子增强外源蛋白的分泌。
[0014] 5)短的信号欣有利于减少表达载体的分子置，提高整合到宿主染色体上外源基因 表达盒的
[0015] 稳定性和转录效率。
[0016] 对于分泌蛋白，选择合适的信号肽可以将其表达量成倍提高，无论对于工业生产 还是科学研究，其意义都是非常深远的。
【发明内容】
[0017] 本发明目的是提供一种可以引导外源哺乳动物细胞蛋白高效表达的信号肽及其 应用，以降低哺乳动物来源蛋白的生产成本。
[0018] 首先，本发明提供了一种人工合成的用于引导哺乳动物来源蛋白质在哺乳动物细 胞中分泌表达的信号肽，所述信号肽的氨基酸序列选自SEQ ID N0:1-5中的任一。其中，SEQ ID N0:1-5的信号肽具有较高的同源性。
[0019] SEQ ID NO:1 MDVLAFLLGLLLLWLPGVRC
[0020] SEQ ID NO :2 MDVPAEFLGLLLLWLSGVRC
[0021] SEQ ID NO :3 MRVLPEFLGLLLLWISGVRC
[0022] SEQ ID NO :4 MDVPLQLLGLLLLWLSGVRC
[0023] SEQ ID NO :5 MDVPAELLGLLLLWISGVRC
[0024] 所述的哺乳动物细胞可以是CH0、BHK、SP2/0、C127等。
[0025] 本发明的信号肽可用于在哺乳动物宿主细胞中引导哺乳动物来源蛋白的分泌表 达。
[0026] 本发明还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码所述用于引导哺乳动物来源蛋 白质在哺乳动物细胞中分泌表达的信号肽。
[0027] 进一步的，所述多核甘酸的序列选自SEQ ID N0:6-10中的任一：
[0028] ATGGATGTTCTTGCTTTTCTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGC (SEQ ID N0:6)
[0029] ATGGATGTTCCTGCCGAATTTCTTGGATTGTTGTTGTTGTGGCTCTCCGGAGTGCGTTGC (SEQ ID N0:7)
[0030] ATGAGGGTTCTGCCTGAATTCCTGGGACTTTTGTTGTTGTGGATTTCCGGCGTGCGATGT (SEQ ID N0:8)
[0031] ATGGATGTACCACTTCAGCTTCTTGGCTTGTTGTTGCTTTGGCTTTCTGGCGTGAGATGT (SEQ ID N0:9)
[0032] ATGGATGTGCCTGCTGAACTTTTGGGCCTTCTTTTGTTGTGGATATCAGGAGTACGATGC (SEQ ID NO:10)
[0033] 本发明的多核苷酸可通过常规的合成方法制备。
[0034] 本发明的多核苷酸可添加于哺乳动物细胞表达载体，用于引导哺乳动物来源蛋 白的分泌表达。
[0035] 利用本发明的信号肽在动物细胞中分泌表达哺乳动物来源蛋白的方法为：将编码 本发明信号肽的多核苷酸与编码表达哺乳动物细胞来源蛋白的多核苷酸连接后克隆入哺 乳动物细胞表达载体，而后将该重组哺乳动物细胞表达载体转染哺乳动物细胞后表达目的 蛋白。
[0036] 本发明还提供了一种哺乳动物细胞表达载体，所述表达载体含有前述编码本发明 信号肽的多核苷酸及编码哺乳动物来源的蛋白质的多核苷酸。
[0037] 所述表达载体中，编码本发明信号肽的多核苷酸紧接在所述编码哺乳动物来源的 蛋白质的多核苷酸前端。
[0038] 进一步的，所述表达载体中，所述编码本发明信号肽的多核苷酸的前端添加有 Kozak序列。
[0039] 所述表达载体的启动子可以是EF-la启动子、CMV启动子、SV40晚期启动子或 SV40早期启动子等。
[0040] 如本发明实施例列举的，所述表达载体为改造的pIRESneo3,所述改造的 pIRESneo3中，人EF-la启动子序列或人EF1-HTLV启动子序列替换了 pIRESneo3质粒中的 hCMV主要立即早期启动子序列。
[0041] 本发明还提供了一种哺乳动物宿主细胞，所述宿主细胞为前述表达载体所转染。 所述的哺乳动物细胞可选自CHO、BHK、SP2/0、C127等。
[0042] 本发明还进一步提供了一种哺乳动物来源的蛋白质的生产方法，为在适合表达所 述哺乳动物来源的蛋白质的条件下，培养前述哺乳动物宿主细胞，而后从培养物中采用常 规方法分离出所述哺乳动物来源的蛋白质。
[0043] 所述哺乳动物来源的蛋白质可以为任意分子量的蛋白质，如各种药物蛋白：促红 细胞生成素，各种具有促红细胞生成素活性的改构促红细胞生成素，以及抗体等。
[0044] 本发明将本发明信号肽与蛋白质自身信号肽进行比较，外源蛋白表达量的测定结 果表明，本发明的信号肽特别适用于CH0细胞，与现有信号肽相比，在动物细胞中的外源蛋 白表达量获得大幅提升，表达水平提高了约2?36倍，其应用有利于筛选到高表达单克隆 细胞株，具有降低生产成本、便于后续纯化等优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0045] 图1显示发明信号肽与ΕΡ0自身信号肽的比较（pEF载体）
[0046] 图2显示发明信号肽与ΕΡ0自身信号肽的比较（pEV载体）
【具体实施方式】
[0047] 下述实施例详细说明本发明，但并不对其发明范围进行限制
[0048] 本发明实施例所列举的表达载体，是由质粒pIRESne〇3改造获得。其中，人EF-1 a 启动子序列、人EF1-HTLV启动子序列分别替换了原质粒中的hCMV主要立即早期启动子 (Human cytomegalovirus major immediate early promoter)序列。
[0049] 实施例1信号肽的合成
[0050] 因信号肽较短，将信号肽按引物合成。5'端添加 Nhel酶切位点及Kozak序列，3' 端添加目的基因序列部分，以便于在目的基因上添加该信号肽。
[0051] 信号肽 1 ：TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTTCTTGCTTTTCTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTT CC
[0052] CGGGGTGAGGTGCGCCCCACCACG (SEQ ID NO:11)
[0053] 信号肽 2 ：TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTTCCTGCCGAATTTCTTGGATTGTTGTTGTTGTGGCTC TC
[0054] CGGAGTGCGTTGCGCCCCACCACG (SEQ ID NO:12)
[0055] 信号肽 3 ：TCGGAGCTAGCCACCATGAGGGTTCTGCCTGAATTCCTGGGACTTTTGTTGTTGTGGATT TC
[0056] CGGCGTGCGATGTGCCCCACCACG (SEQ ID NO:13)
[0057] 信号肽 4 ：TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTACCACTTCAGCTTCTTGGCTTGTTGTTGCTTTGGCTT TC
[0058] TGGCGTGAGATGTGCCCCACCACG (SEQ ID NO:14)
[0059] 信号肽 5 ：TCGGAGCTAGCCACCATGGATGTGCCTGCTGAACTTTTGGGCCTTCTTTTGTTGTGGATA TC
[0060] AGGAGTACGATGCGCCCCACCACG (SEQ ID NO:15)
[0061] 实施例2人EF-1 α启动子的扩增
[0062] 以质粒pEF6/V5_HisA (购自Invitrogen公司）为模版，人EF-1 a启动子序列为 参考，设计引物F01/R01,进行聚合酶链式反应，扩增出人EF-la启动子序列，反应条件如 表 1。F01:CATACTAGTGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAG (SEQ ID NO:16)
[0063] R01:ACGGCTAGCTCCGAGCTCGGTACCAAGCTTACCTAGCCA (SEQ ID NO:17)
[0064] 表1PCR反应条件
[0065]
【权利要求】
1. 一种人工合成的用于引导哺乳动物来源蛋白质在哺乳动物细胞中分泌表达的信号 肽，所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
2. 如权利要求1所述信号肽用于在哺乳动物宿主细胞中引导哺乳动物来源蛋白的分 泌表达。
3. -种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1所述信号肽。
4. 如权利要求3所述多核苷酸，其特征在于，所述多核甘酸的序列为SEQ ID NO: 10。
5. -种哺乳动物细胞表达载体，所述表达载体含有权利要求3或4所述多核苷酸及编 码哺乳动物来源的蛋白质的多核苷酸。
6. 如权利要求5所述哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，权利要求3或4所述多核苷 酸紧接在所述编码哺乳动物来源的蛋白质的多核苷酸前端。
7. 如权利要求5所述哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，进一步的，所述表达载体 中，权利要求3或4所述多核苷酸的前端添加有Kozak序列。
8. 如权利要求5所述哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述表达载体的启动子选 自EF-1 α启动子、CMV启动子、SV40晚期启动子或SV40早期启动子。
9. 如权利要求5所述哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述哺乳动物来源的蛋白 质选自促红细胞生成素，各种具有促红细胞生成素活性的改构促红细胞生成素，以及抗体。
10. -种哺乳动物宿主细胞，所述宿主细胞为权利要求5-9任一所述表达载体所转染。
11. 如权利要求10所述哺乳动物宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物宿主细胞为 CH0、BHK、SP2/0 或 C127。
12. -种哺乳动物来源的蛋白质的生产方法，为在适合表达哺乳动物来源的蛋白质的 条件下，培养权利要求10或11所述哺乳动物宿主细胞，而后从培养物中分离出所述哺乳动 物来源的蛋白质。
13. 如权利要求12所述哺乳动物来源的蛋白质的生产方法，其特征在于，所述哺乳动 物来源的蛋白质选自促红细胞生成素，各种具有促红细胞生成素活性的改构促红细胞生成 素，以及抗体。
【文档编号】C12N15/11GK104059128SQ201310332218
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2010年9月17日 优先权日:2010年9月17日
【发明者】周永春, 张玉晶, 厉颖 申请人:上海凯茂生物医药有限公司, 上海复星医药（集团）股份有限公司