一种生物转化胞磷胆碱的酿酒酵母菌种及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药领域。涉及一种生物转化胞磷胆碱的酿酒酵母菌种及应用，即高活力胞苷酸（CMP）激酶和高活力磷酸胆碱胞苷酰转移酶的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株及其在生物转化胞磷胆碱中的应用。本发明的酿酒酵母菌种，分类命名：S.cerevisiae，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC7978。
【专利说明】一种生物转化胞磷胆碱的酿酒酵母菌种及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域。涉及选育一种生物转化胞磷胆碱的菌种，即高活力胞苷酸(CMP)激酶和高活力磷酸胆碱胞苷酰转移酶的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株及其在生物转化胞磷胆碱中的应用。
【背景技术】
[0002]胞磷胆碱的制造目前采用化学合成、双菌发酵和酵母生物转化等三种方法。由于化学合成法成本高，环境污染比较严重，只有意大利利用此方法少量生产。90年代后日本雅玛山主要采用酵母生物转化法进行生产，但是由于主要原料CMP价格较贵，2000年后日本开发了双菌发酵的方法。它利用大肠杆菌和产氨棒杆菌等基因工程菌。以乳清酸(或尿嘧啶)为主要原料，制造胞磷胆碱，其转化率为56%。我国目前也是采用的酵母生物转化方法即利用废弃啤酒酵母为生物催化剂。由于CMP已有多种方法大量生产，价格下降幅度大， 在我国双菌发酵与酵母生物转化相比已没有优势。并且，双菌发酵还存在工艺复杂，转化率低，以及分离难度高等较难克服的瓶颈。利用废弃啤酒酵母生物转化存在酵母收集困难，废弃酵母的催化活性波动较大，转化率不稳定等缺陷。特别是胞磷胆碱规模化生产时，其不利因素会更加突显。
【发明内容】
[0003]本发明为克服生物转化胞磷胆碱生产的瓶颈，选育高活力CMP激酶和高活力的磷酸胆碱胞苷酰转移酶酿酒酵母菌株，并使原来胞磷胆碱60?70%的转化率提高到85%以上。
[0004]应用生物转化技术可由CMP和磷酸胆碱生物转化胞磷胆碱。CMP激酶和磷酸胆碱胞苷酰转移酶是此反应的关键酶。酵母菌对葡萄糖利用效率较高，在糖酵解途经中，一分子葡萄糖可释放二分子ATP用于CTP生物转化反应。该反应转化率的高低，主要取决于CMP 激酶和磷酸胆碱胞苷酰转移的活性。为此发明人设计了一种菌种选育的方法。即先用化学诱变的方法筛选出酿酒酵母氯化钾(KCl)敏感株，然后根据两种酶活力的高低筛选CDP-胆碱转化率较高的菌种。
[0005]本发明以酿酒酵母CGMCC2842为出发菌株，先用化学诱变方法筛选出KCL敏感株。 筛选取得的菌种进一步测定以上两个关键酶的活力。在此基础上，得到了本发明的`酿酒酵母菌种，分类命名:酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC N0.7978，简称QY131。保藏日:2013.8.2。
[0006]1、磷酸胆碱胞苷酰转移酶测定方法如下:
[0007]在250ml摇瓶中加入IOOml的反应液，其中含CTP25mmol/L，磷酸缓冲液200mmol/ L，葡萄糖2g。磷酸胆碱5g，硫酸镁0.4g，酵母菌种5g (干重)。32°C，转速150rpm，振荡反应lh。取样，测定胞磷胆碱的含量。采用文献(《医药工业》1985年第2 10)琼脂糖电泳法或HPLC法(中国药典2010版)测定胞磷胆碱含量，并换算成其微摩尔数。[0008]2、胞苷酸激酶的测定方法如下:
[0009]在250ml摇瓶中加入IOOml的反应液，其中含CMP25mmol/L，磷酸缓冲液200mmol/L，葡萄糖2g，硫酸镁0.4g，酵母菌种5g (干重)。32°C，转速150rpm，振荡反应lh。取样，测定CTP的含量。CTP测定可参考上述方法，但是应将原来硼酸缓冲液改为pH3.6柠檬酸缓冲液，并以CTP标样经电泳做标准曲线。样品用此方法测得含量，并换算成微摩尔数即可。
[0010]经上述两种酶活力高低的筛选，最终获得QY131酿酒酵母菌种。其磷酸胆碱胞苷酰转移酶活力可达到17.7U，比对照株提高106%。它的胞苷酸激酶活力提高129%。该菌种与对照株、文献[I]菌种、目前工业应用的啤酒酵母株的酶活力比较如下。
[0011]
【权利要求】
1.一种酿酒酵母菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为:CGMCC7978。
2.一种制备胞磷胆碱的方法，包括:权利要求1的酿酒酵母以CMP和磷酸胆碱为底物进行生物转化。
3.权利要求2的方法，其中在生物转化反应过程中补加或流加葡萄糖，补加的葡萄糖浓度为20?80% ;补加的间隔时间为0.5?3h ;流加葡萄糖的浓度为20?80% ;流加的速度为20?80ml/h,均为重量百分比。
4.权利要求3的方法，其中补加的葡萄糖浓度为40?50%;补加的间隔时间为I?2h ;流加葡萄糖的浓度为40?50% ;流加的速度为40?50ml/h。
5.权利要求2的方法，包括:底物在温度为28?34°C，pH为6.5?8.5条件下进行生物转化，转化反应中补加或流加葡萄糖，所述底物含胞苷酸28?40mmol/L、MgS04.4Η207.5?1Smmol /I,和憐酸胆喊7·5?QOmmoI /I,组成。
6.权利要求5的方法，其中，补加的葡萄糖浓度为20?80%;补加的间隔时间为0.5?3h ;流加葡萄糖的浓度为20?80% ;流加的速度为20?80ml/h，均为重量百分比。
7.权利要求6的方法，其中补加的葡萄糖浓度为40?50%;补加的间隔时间为I?2h ;流加葡萄糖的浓度为40?50% ;流加的速度为40?50ml/h。
8.权利要求5的方法，其中生物转化反应的温度为32?34°C；pH为6.5?7.2。
9.权利要求5的方法，其中底物含胞苷酸28?32mmol/L、MgSO4.4H207.5?IOmmol/L和磷酸胆碱75?80mmol/L组成。
10.权利要求5的方法，其中底物含28mmol/L胞苷酸、15mmol/LMgSO4.4H20、75mmol磷酸胆碱，温度为32°C，pH=7.2。
【文档编号】C12N1/18GK103436455SQ201310358526
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】邱蔚然, 周长林, 王鹏飞, 邱志云, 周洁, 马志娟 申请人:南通秋之友生物科技有限公司, 中国药科大学