基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，该方法采用在细胞液培养时加入标记物，从而达到实时跟踪细胞分布的目的，在支架材料制作的过程中，混合用于检测成细胞分泌物的试液，达到实时检测干细胞分化进程的目的。通过细胞追踪及细胞分化过程的实时检测，可以对装载细胞的凝胶沉积进行实时的监控，从而方便研究细胞成活和分化与沉积技术各参数（如沉积速度，压电脉冲宽度等）直接的关系，大大缩短了研究周期和成本。
【专利说明】基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞打印领域，尤其是涉及一种基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法。
【背景技术】
[0002]快速成型(RP)技术是九十年代发展起来的一项先进制造技术，在计算机的控制下，RP系统可以根据零件的形状，每次制作一个具有一定微小厚度和特定形状的截面，然后再把它们逐层粘结起来，就得到了所需制造的立体的零件。不同公司制造的RP系统所用的成形材料不同，系统的工作原理也有所不同，但其基本原理都是一样的，那就是"分层制造、逐层叠加"。利用快速成型(RP)技术，可以在无需准备任何模具、刀具和工装卡具的情况下，直接接受产品设计(CAD)数据，快速制造出新产品的样件、模具或模型。
[0003]在生物工程领域，快速成型技术是制造支架(三维细胞支架)的一项很好的技术工具。这些基于模型的技术可以通过在工作台上进行逐层材料沉积，得到多孔3D支架。在构造支架的过程中，每一层都是沉积成可互相渗透的纤维网络(材料和空隙)。这样可以构成一个具有多孔并无相连接的三维支架。一个可控的有空隙支架可以很好的给细胞和组织提供氧气、养料保证组织培养。支架的内部和外部结构可以由CAD或CAM绘制而成。通过这些方式可以生产可替换正常组织并满足其机械性能的3D结构。另外，利用电脑层析成像和核磁共振成像可以得到组织构造的支架。这种生产支架的多样性可以更有利于研究细胞在不同组织支架中的再生情况。近期，利用快速成型制造可以提供细胞生长的三维结构已经可以制造出来了，其目标是可以制造等效活细胞。这项技术，有很多人称之为组织或细胞打印，也可以被定义成多细胞群沉积技术，有望模仿活细胞进行排布。基本原理是设计一个可以更接近真实细胞、基质和生物分子组织的方法，这种方法可以帮助揭示细胞与细胞，细胞与基质关系，并且也可以为功能移植中的细胞再生提供帮助。
[0004]目前3D沉积技术对单纯聚合物支架打印技术已日趋成熟，单纯的打印一个符合要求的有机物支架已经不是细胞打印的主要瓶颈。但可以打印出一个可供活细胞生存并正常分化的凝胶支架尚且困难，目前常用的聚合物沉积支架主要缺点有(I)细胞和支架的制作不同步。现代细胞沉积的主要方法是先制作有机聚合物支架，再向支架中注入活细胞，其优点是保证注入活细胞成活率，但缺点是不能控制细胞在支架中的成分和比例，导致支架中细胞的含量由于支架结构的限制而分配不均；(2)细胞成活和分化有失实时性，由于无法在注入过程中实现细胞的实时监测，细胞成活与否只有在细胞完全注入并培育一段时间后，才能检测细胞是否成活和细胞的分化情况。而当所制作支架不满足成活条件时，需要重新制作支架并且重复实验，这就导致真正制作一个符合要求的支架将消耗大量的时间精力。(3)成活率检测为沉积后检测，当细胞注入到支架的过程中，细胞可能在注入的过程死亡，这是由于在细胞被注入及到达支架预定位置的时间段内，细胞并不能得到足够的养分，并且在这段时间里，细胞将受到不同程度的挤压。在诸多外界因素的影响，很有可能导致细胞提前死亡，这样的结果并不能证明支架本身的结构式有问题，对实验结果即会产生偏差。实验结果产生偏差会进而导致更多无效的重复制作支架过程。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，在制作过程中实时对细胞成活状态、在支架中的比例以及细胞分化情况进行检测反馈，根据检测数据调整三维细胞支架打印参数，进而得到精确的三维细胞支架。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下:
[0007]一种基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，包括:
[0008](I)将干细胞置于活体染料的培养皿中培养染色，直至干细胞变色后，将有色干细胞和无色干细胞分离，取出有色干细胞；
[0009](2)将染色后的有色干细胞置于凝胶原液中培养，培养完成后，加入凝胶浴液，过滤得到凝胶包裹的干细胞；
[0010](3)将步骤(2)得到凝胶包裹的干细胞装入三维打印装置的注射器中，进行三维细胞支架打印，打印过程中，根据有色干细胞的分布情况实时读取三维细胞支架上有色干细胞的分布信息，最后固化得到三维细胞支架；
[0011](4)将得到的三维细胞支架放置20-48小时后，浸入到干细胞初期分化检测试剂中，检测三维细胞支架上干细胞初期分化信息；
[0012](5)将得到的三维细胞支架放置10-15天，利用蛋白检测设备检测三维细胞支架上干细胞后期分化信息；
[0013](6)最后进行如下判断:
[0014]若制备得到三维细胞支架符合要求，则完成打印过程；
[0015]若制备得到三维细胞支架不符合要求，则将步骤(3)得到的三维细胞支架上有色干细胞的分布信息、步骤(4)得到的三维细胞支架上干细胞初期分化信息、以及步骤(5)得到的三维细胞支架上干细胞后期分化信息作为反馈信息，调整步骤(3)中三维打印装置打印参数，重复步骤(I) - (6)。
[0016]下面对上述技术方案的几种优选方案做进一步说明:
[0017]本发明所使用的干细胞，可选择各种干细胞，例如可采用骨骼干细胞、造血干细胞等。本发明中的三维细胞支架打印方法包括细胞培养部分和有机物支架制作部分:有机物支架一般选择凝胶类有机物，如海藻盐等可以有效抗紫外辐射及电磁影响的有机材料，除了有机物以外，支架部分还应含有分化细胞对应的蛋白酶和检测试液，如酚酞等酸碱检测溶液。
[0018]步骤(I)中，所述的培养染色过程中，可采用的染料为能够标记成活干细胞的活体染料，常见的活体染料可选择健那绿B或中性红的生理盐水溶液，活体染料的浓度可根据实际需要确定，活体染料浓度过高，会导致干细胞的粘度过大，最后形成的凝胶容易堵塞打印装置的打印喷头，不利于后续的打印操作；浓度过低，染色效果不佳；作为优选，所述的健那绿B或中性红的重量百分比浓度为0.01-0.05%。
[0019]步骤(I)中，所述的将有色干细胞和无色干细胞分离操作可选择通过离心分离；相对于活细胞，死细胞由于失水，密度相对降低，大部分死细胞会漂浮在活体染料的生理盐水溶液中，通过离心作业，可快速实现活细胞和死细胞的分离，提高分离效率和分离质量。[0020]步骤(2)中，所述的凝胶原液一般选择海藻酸钠水溶液，所述的海藻酸钠水溶液中海藻酸钠浓度可根据实际需要调整，实验证明，当海藻酸钠的浓度过高时，形成凝胶容易导致打印喷头堵塞，不利于后续的打印操作；当海藻酸钠的浓度过低时，由于凝胶浓度较稀，打印线条容易产生扩散，降低了打印精度；作为优选，所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠的重量百分比浓度为2-5%，选择该浓度时，凝胶更容易成型，提高了整体打印效率和打印质量。另外，由于离子会促进凝胶海藻酸钠的固化，所以在配置凝胶原液时，为避免凝胶原液发生固化，作为优选，配置海藻酸钠水溶液时，采用去离子水。
[0021]步骤(2)中，所述的凝胶浴液一般选择CaCl2水溶液，所述的CaCl2水溶液的浓度可根据实际需要调整，实验证明，CaCl2水溶液的浓度也不易过高过低，CaCl2水溶液的浓度过高和过低均不利于后续打印操作。作为优选，所述的CaCl2A溶液中CaCl2的质量百分比浓度为2-5%。
[0022]步骤(2)中，有色干细胞置于凝胶原液中培养的时间可根据实际需要确定，一般保证有色干细胞充分适应凝胶环境，降低干细胞后续的死亡率，作为优选，所述有色干细胞置于凝胶原液中培养的时间为4小时以上。有色干细胞在凝胶原液培养时间过长，会导致因养料不足死亡，所以作为进一步优选，所述有色细胞置于凝胶原液中培养的时间为4~10小时。该步骤中，加入凝胶浴液后，凝胶进行预固化，预固化时间一般控制在0.5-3分钟，预固化时间太长，会使得形成凝胶粘度过大，不利于后续的打印作业。
[0023]步骤(3)中，所述的三维打印装置可选用现有的结构，例如可选用压电式三维打印装置等。该步骤中通过CAD和CAM软件绘制设计三维细胞支架的结构和打印喷头的运动轨迹，通过打印喷头和打印接 收平面的X，y, z三轴移动沉积注射得到任意确定的三维支架结构。该步骤中，固化操作一般选用紫外光照射固化，利用可逆光敏特性将三维细胞支架固化定型。紫外灯照射时间不宜过长，紫外照射时间过长，会导致细胞死亡，为满足固化要求，作为优选，所述的紫外照射时间为1-3分钟，紫外光的强度一般选择的较弱的紫外光即可，例如可采用常规医学消毒用紫外线。打印过程中，有色干细胞的分布情况确定了成活细胞的分布情况，其中，有色干细胞为成活的干细胞，而未显色部分，表明细胞已经死亡或没有干细胞存在。通过确定有色干细胞分布从而确定支架中不同位置活干细胞的含量。
[0024]由于干细胞前期分泌的是碱式磷酸酶，后期分泌的胶原蛋白，所以干细胞前期和后期分化情况需要采用不同的检测手段。步骤(4)中，所述的干细胞初期分化检测试剂可选择酚酞指示剂或者花蕊溶液。所述的酚酞指示剂为0.5%酚酞乙醇溶液。将打印得到的三维细胞支架置入细胞初期分化检测试剂之前，为保证三维细胞支架的整体强度，一般需要放置20-48小时，作为优选，可选择放置24小时。测试过程中，利用制备的酚酞溶液观察三维细胞支架中颜色的变化，含有红色的位置表示酚酞变红，即细胞产生碱性磷酸酶，从而检测初始细胞分化的情况，得到干细胞初期分化信息。步骤(5)中，通过蛋白检测设备可检测出细胞后期分化的情况和位置，得到干细胞后期分化信息。蛋白检测设备可选用现有的设备。通过蛋白检测设备检测前，作为优选，可将得到的三维细胞支架放置2周。
[0025]在支架制作的过程中，将细胞及支架有机物按一定比例混合并在培养基中培养，培养时需要保证有机物的养分可以足够使干细胞成活并分化。在确定比例后，通过层状结构装入注射器中利用压电喷射原理进行沉积。通过CAD及CAM技术，设计沉积立体结构和沉积轨迹，通过打印喷头和接受平面的三轴移动实现装载细胞的三维细胞支架沉积。[0026]在实际操作的过程中，通过干细胞中荧光物质或放射性物质的检测，可以实时观察干细胞在三维细胞支架中的比例，从而通过实时改变压电的频率，电压，脉冲宽度等因素来控制干细胞在有机物中的占比。在构成的三维细胞支架结构中，利用不同蛋白酶及检测试剂来确定所含干细胞的分化情况。对于已分化干细胞，相应的酶检测到分化后特化细胞的分泌物并通过检测试剂表现出来，从而实时反应干细胞的分化情况。
[0027]本发明采用在细胞液培养时加入标记物，如染色溶剂或放射性元素标记特定的元素。从而达到实时跟踪细胞分布的目的，在支架材料制作的过程中，混合用于检测成细胞分泌物的试液，达到实时检测干细胞分化进程的目的。通过细胞追踪及细胞分化过程的实时检测，可以对装载细胞的凝胶沉积进行实时的监控，从而方便研究细胞成活和分化与沉积技术各参数(如沉积速度，压电脉冲宽度等)直接的关系，大大缩短了研究周期和成本。
[0028]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0029](I)通过干细胞和三维细胞支架材料在注射器中的层状融合，去除先制作支架后注入细胞导致的外界因素，将细胞培养和三维细胞支架形成两步分离，从而分步实现，避免大量的实验；(2)通过荧光和放射性标记的方式，标记跟踪培养干细胞，从而可以确定在混合到喷射再到沉积过程中，干细胞在支架中的含量以及干细胞的分布，这样就避免利用显微镜观察试验后支架组成，具有实时性；(3)通过利用三维细胞支架混入特化细胞蛋白酶及检测试液的方式，可以达到实时检测干细胞分化情况的目的，从而通过得到关于支架材料，结构和分化的对应关系，对后续的打印过程进行实时改进。
【具体实施方式】
[0030]实施例1
[0031](I)细胞培育部分:
[0032](I)配置中性红染 色液，取0.1g健那绿B粉末溶解于IL生理盐水中搅拌均匀，配制成浓度为0.01%的健那绿B溶液。
[0033](II)取IOOml上述溶液浸入培养皿中，浸泡骨骼干细胞Ih后，通过过滤纸过滤出骨骼干细胞。
[0034](III)在过滤出的骨骼干细胞中，通过离心机分离，选择沉淀绿色的细胞，分离出无色细胞。其中绿色细胞为活骨骼干细胞。再补充细胞培养液配置成IOOml细胞绿色溶液。
[0035](2)凝胶支架部分:
[0036]本发明采用海藻胶材料作为支架的基本材料，混合酚酞用于检测成骨细胞早期分泌的碱性磷酸酶。
[0037](I)取海藻酸钠4g溶解于IOOml去离子水中，配制成重量百分比浓度为4%的凝胶原液。
[0038](II)取CaCl2粉末2g溶解于IOOml蒸馏水中，配制成重量百分比浓度为2%的凝胶浴液。
[0039](3)将(I)部分筛选的绿色的骨骼干细胞置于凝胶原液中，通过抽吸的方式使细胞核凝胶原液混合均匀，培养4h。
[0040](4)向(3)中的培养液中加入凝胶浴液，加入过程伴有轻轻搅拌得到胶状凝胶包裹的干细胞。[0041](5)使用滤纸过滤出凝胶包裹的绿色细胞，得到骨骼干细胞与海藻胶层状混合结构，其海藻胶的层状孔隙在100-200um之间，装入三维打印装置的储液器中进行喷射沉积。
[0042](6)通过CAD和CAM软件绘制设计支架的结构和打印喷头的运动轨迹，通过注射器和接收平面的X，y, Z三轴移动沉积注射得到任意确定的三维支架结构，例如，本实施例中需要打印的三维支架结构为单层平面正方形结构，其中Q、P、R、S为该正方形结构的四个角部，接收平面移动速度lOmm/s，气压300kPa。本实施例中可选用市购的挤压式打印装置。
[0043](7)通过弱紫外线照射约Imin (即医学消毒用紫外线)，利用海藻酸盐凝胶可逆光敏特性将支架固化定型。
[0044](8)通过支架结构沉积过程中，加入少量蒸馏水冲洗并过滤，实时观察绿色的分布情况确定骨骼干细胞的分布情况，其中，显绿色的部分为成活的骨骼干细胞，而未显色部分，表明细胞已经死亡或没有细胞存在。通过确定绿色分布从而确定三维细胞支架中不同位置骨骼干细胞的含量信息。以单层平面正方形QPRS为例，四个角Q，P, R, S处绿色较深，而中心点O (O为单层平面正方形的中心)处绿色成零星点状分布。说明，外围四角活细胞含量多而正方形中心处细胞含量少。
[0045](9)配制酚酞指示剂(0.5%酚酞乙醇溶液):取0.5g酚酞，用95%乙醇溶解，并稀释至IOOmL，无需加水。
[0046](10)支架形成后24小时，滴入步骤(9)制备的酚酞溶液观察支架-单层平面正方形QPRS中观察颜色的变化，含有红色的位置表示酚酞变红，即产生碱性磷酸酶，从而确定骨干细胞分化成特化细胞的位置，即得到骨干细胞的初期分化信息。观察得，中心处O点红色呈时断时续，Q，P, R, S处基本无红色。说明中心处细胞含量少但成功分化，四个角细胞含量高但营养不足没有很好的分化。
[0047](11)支架形成后2周左右，检测支架中胶原蛋白的含量及分布情况，从而确定得到骨干细胞的后期分化信息，检测支架中胶原蛋白的方法如下:
[0048](I)分别选取三维细胞支架结构上单层正方形的四个角Q，P, R, S以及中心点O五点标记为1，2，3，4，5，取五个位置的样品5g溶于50ml蒸馏水中配制成五份待测溶液，记为a，b，c，d，ο。
[0049](II)使用I型胶原ELISA检测试剂盒，用标本稀释液1:1稀释后加入50ml于反应孔内，然后加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37°C温育I小时。
[0050](III)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
[0051](IV)每孔加入80ml的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37°C温育30分钟。
[0052](V)甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
[0053] (￥1)每孔加入显色剂4、8(八，8为试剂盒自带显色剂)各50ml，轻轻振荡混匀，37°C温育10分钟。避免光照。
[0054](VII)取出酶标板，迅速加入50ml终止液，加入终止液后应立即测定结果。
[0055](VIII)在450nm波长处测定各孔的OD值。若OD值极低或为零则不含胶原蛋白。即此位置的细胞没有分化。
【权利要求】
1.一种基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，其特征在于，包括: (1)将干细胞置于活体染料的培养皿中培养染色，直至干细胞变色后，将有色干细胞和无色干细胞分离，取出有色干细胞； (2)将染色后的有色干细胞置于凝胶原液中培养，培养完成后，加入凝胶浴液，过滤得到凝胶包裹的干细胞； (3)将步骤(2)得到凝胶包裹的干细胞装入三维打印装置的注射器中，进行三维细胞支架打印，打印过程中，根据有色干细胞的分布情况实时读取三维细胞支架上有色干细胞的分布信息，最后固化得到三维细胞支架； (4)将得到的三维细胞支架放置20-48小时后，浸入到干细胞初期分化检测试剂中，检测三维细胞支架上干细胞初期分化信息； (5)将得到的三维细胞支架放置10-15天，利用蛋白检测设备检测三维细胞支架上干细胞后期分化信息； (6)最后进行如下判断: 若制备得到三维细胞支架符合要求，则完成打印过程； 若制备得到三维细胞支架不符合要求，则将步骤(3)得到的三维细胞支架上有色干细胞的分布信息、步骤(4)得到的三维细胞支架上干细胞初期分化信息、以及步骤(5)得到的三维细胞支架上干细胞后期分化信息作为反馈信息，调整步骤(3)中三维打印装置打印参数，重复步骤(I) - (6)。
2.根据权利要求1所述的基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的培养染.色过程中，采用健那绿B或中性红的生理盐水溶液进行染色，所述的健那绿B或中性红的重量百分比浓度为0.01-0.05%。
3.根据权利要求1所述的基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的将有色干细胞和无色干细胞分离操作采用通过离心分离。
4.根据权利要求1所述的基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的凝胶原液为海藻酸钠水溶液，所述海藻酸钠水溶液中海藻酸钠的重量百分比浓度为2-5%。
5.根据权利要求4所述的基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，其特征在于，所述的海藻酸钠水溶液中的水采用去离子水。
6.根据权利要求1所述的基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的凝胶浴液为CaCl2水溶液，所述的CaCl2水溶液中CaCl2的质量百分比浓度为2-5%。
7.根据权利要求1所述的基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，其特征在于，步骤(2)中，有色干细胞置于凝胶原液中培养的时间为4小时以上。
8.根据权利要求1所述的基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，其特征在于，步骤(2)中，加入凝胶浴液后，保持0.5-3分钟。
9.根据权利要求1所述的基于细胞状态反馈的三维细胞支架打印方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的干细胞初期分化检测试剂为0.5%酚酞乙醇溶液。
【文档编号】C12N5/071GK103468635SQ201310371480
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年8月23日 优先权日:2013年8月23日
【发明者】贺永, 夏冰, 傅建中, 赵朋, 金育安 申请人:浙江大学