一种基于RNAi技术及rescue原理制备的siRNA和突变型克隆载体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种利用RNAi技术和RNAirescue原理制备的siRNA和突变型克隆载体。本发明的降低SPP1基因表达的小干扰RNA序列如SEQIDNO：1-2所示；本发明的突变型克隆载体针对前述降低SPP1基因表达的RNAi的靶序列构建。本发明的方法通过RNAi沉默基因观察功能变化情况，回复突变的载体与RNAi同时感染或转染目的细胞，沉默内源目的基因，通过外源突变型载体表达与内源相同功能的蛋白，经过这样组合处理细胞功能不发生改变；或者将突变型载体导入RNAi沉默后，功能得到回复，证明功能表型是由此基因引起的，为基因功能研究提供了一种新的模型和方法。
【专利说明】—种基于RNAi技术及rescue原理制备的siRNA和突变型克隆载体
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】,具体涉及一种基于RNAi rescue原理制备突变型克隆载体的方法。
【背景技术】
[0002]RNAi (RNA interference, RNA干扰)是一种高效的特异性强的基因阻断技术,通过切断目的基因mRNA达到沉默目的基因的作用，RNAi技术是一种新兴的基因研究工具，目前已经被广泛常规应用于各种领域的基因功能研究。
[0003]随着研究深入发现RNAi存在比较普遍的脱靶现象，为了证实沉默的是否为靶基因，人们采用不同的RNAi靶点证实获得相同的基因功能结果来证明对目的基因进行了特异性沉默，但这种方法存在所设计的RNAi靶点均发生脱靶的几率，如果所设计的RNAi靶点均发生脱靶，则无法证明对目的基因是否进行了特异性沉默。
`[0004]另一种方法就是构建RNAi target区突变体，即对该区的碱基序列进行同义突变，一方面不被RNAi沉默，一方面能保证表达的蛋白与内源、野生型载体表达的蛋白功能一致，该方法被称为RNA干扰回复(即:RNAi rescue)技术。通过RNA干扰回复技术对基因表达进行回复，如果回复的结果和RNAi的结果相反，则可以确认该基因功能。RNA干扰回复方法在设计上更加科学，也更加严格。对于RNA干扰回复的应用目前报道不多，其主要原因在于获得突变型过表达载体的关键技术不够成熟。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于构建沉默SPPl基因表达的小干扰RNA，以及针对该RNAi的靶序列构建的突变型克隆载体，该突变型克隆载体能够避免RNAi沉默，同时该突变型克隆载体能够表达正常功能的蛋白；两者结合可用于SPPl基因功能的研究。
[0006]本发明首先提供了一种降低SPPl基因表达的小干扰RNA (siRNA)，包括正义链和反义链，序列如下:
[0007]正义链:5’-CCAUUCUGAUGAAUCUGAU-3’ (SEQ ID NO:1);
[0008]反义链:5，-AUCAGAUUCAUCAGAAUGG-3’(SEQ ID NO:2)。
[0009]进一步的，本发明所述小干扰RNA针对的SPPl基因上的RNA干扰靶序列如SEQ IDNO:3所示。
[0010]一种降低SPPl基因表达的shRNA，所述shRNA含有SEQ ID NO:1所示序列的正义链片段和SEQ ID NO:2所示序列的反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的
茎环结构。
[0011]进一步的，所述降低SPPl基因表达的ShRNA可剪切成前述含有如SEQ ID NO:1所示正义链以及SEQ ID NO:2所示反义链的降低SPPl基因表达的siRNA。
[0012]优选的，所述茎环结构的序列可选自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0013]一种SPPl基因干扰慢病毒载体，含有编码前述降低SPPl基因表达的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA，并剪切获得如SEQ ID NO:1~2所示序列的siRNA。
[0014]所述SPPl基因干扰慢病毒载体是将编码前述SPPl基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述SPPl基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出所述ShRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述SPPl基因小干扰RNA，用于特异性沉默SPPl基因的表达。
[0015]进一步的，所述慢病毒载体可以选自:pLK0.1-pur ο > pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-tGFP, pLK0.1-CMV-Neo, pLK0.l_Neo、 pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635、pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1 PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
[0016]最优选的，所述慢病毒载体为pGCL-GFP。
[0017]一种SPPl基因干扰慢病毒，由前述SPPl基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
[0018]本发明第二方面公开了一种SPPl基因突变型克隆载体，针对前述降低SPPl基因表达的SiRNA的RNA干扰靶序列突变获得；该突变型克隆载体含有突变的RNA干扰靶序列，并编码RNAi target mRNA区第三个碱基同义突变的SPPl基因mRNA。
[0019]优选的，所述突变型克隆载体含有SPPl蛋白表达序列，其特征在于，所述突变型克隆载体的SPPl蛋白表达序列中含有突变的RNA干扰靶序列，并能编码RNAi target mRNA区第三个碱基同义突变的SPPl基因mRNA ;所述RNA干扰靶序列为权利要求1_2任一权利要求所述siRNA所针对的RNA干扰靶序列；所述RNAi target mRNA区为所述RNA干扰靶序列区段所对应并编码的mRNA。
[0020]所述RNAi target mRNA区为RNA干扰靶序列区段所对应并编码的mRNA。本发明突变型克隆载体表达的S PPl蛋白序列可参考Gene Bank (NM_000582.2)。
[0021]本发明所述RNAi target mRNA区第三个碱基同义突变是指将目的基因RNA干扰靶序列中，所有编码氨基酸的三联密码子中的第三个碱基进行同义突变，使其碱基序列改变但表达的氨基酸种类不变。
[0022]优选的，所述突变的RNA 干扰靶序列为 5’-TCACTCCGACGAGTCCGAC-3’(SEQ ID NO:4)。即采用SEQ ID NO:4所示突变的RNA干扰靶序列替换掉SEQ ID NO:3所示RNA干扰靶序列，从而使SPPl基因RNAi target mRNA区发生同义突变。
[0023]更优选的，所述突变型克隆载体含有SEQ ID NO:23所示突变的SPPl基因序列。
[0024]本发明突变型克隆载体的关键在于通过分子克隆的方法在目的基因的RNAitarget序列的所有编码氨基酸的三联密码子中的第三个位置的碱基进行同义突变，使其碱基序列改变但氨基酸不变，通过碱基同义突变后获得的克隆载体具有不被RNAi沉默又能表达正常功能蛋白的特性。
[0025]本发明还公开了前述突变型克隆载体的方法，包括下列步骤:目的基因RNAi有效靶点设计、构建shRNA载体；RNAi target mRNA区第三个碱基同义突变；多重PCR获得含同义突变的目的基因全长mRNA ;突变型克隆载体构建；突变型克隆载体构建成功证明；回复功能实验证实细胞克隆形成。
[0026]本发明最后一方面公开了前述降低SPPl基因表达的小干扰RNA，前述突变型克隆载体在SPPl基因功能研究中的应用。
[0027]本发明制备的突变型载体不被RNAi干扰沉默，能表达出功能与野生型载体相同的蛋白；它是研究基因功能的良好模型，对内源基因进行沉默，外源基因导入后不被沉默。同时，本发明通过RNAi沉默基因观察功能变化情况，回复突变的载体与RNAi同时感染或转染目的细胞，一方面沉默内源目的基因，但不沉默外源目的基因，通过外源突变型载体表达与内源相同功能的蛋白，经过这样组合处理细胞功能不发生改变；或者将突变型载体导入RNAi沉默后，功能得到回复，证明功能表型是由此基因引起的。本发明为基因功能研究提供了一种新的模型、方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1:用于shRNA构建的质粒图谱。
[0029]图2:载体线性化电泳图。
[0030]图3:shRNA载体阳性克隆PCR琼脂糖电泳图。
[0031]图4:突变型载体构 建流程图。
[0032]图5:突变型载体质粒图谱。
[0033]图6:突变型载体线性化电泳图。
[0034]图7:突变型载体阳性克隆PCR琼脂糖电泳图。
[0035]图8 =RT-PCR验证实突变型克隆载体的突变是否成功。
[0036]图9 =WB验证实突变型克隆载体的突变是否成功。
【具体实施方式】
[0037]下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0038]实施例1突变型克隆载体制备
[0039]1.制备原理
[0040]本实施例中使用的目的基因为SPPl (NM_000582.2)基因，制备两端设酶切位点粘端的表达干扰序列的双链DNA oligo序列，直接连入干扰载体；然后将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的克隆先进行PCR鉴定，在进行测序比对后，鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。
[0041]突变型慢病毒过表达载体在目的基因的RNAi target序列的所有编码氨基酸的三联密码子中的第三个位置的碱基进行同义突变，即虽然目的基因碱基序列发生改变，但由于其编码的mRNA的RNAi target mRNA区发生了同义突变，因此突变型克隆载体表达的氨基酸序列不变；因此，该突变型能够避免被RNAi降解，同时翻译出的蛋白具有正确的生物学功能。[0042]2、制备步骤:
[0043]2.1针对目的基因SPP1，根据AA-N19-TT设计原则，设计RNA干扰靶序列为:
[0044]5’-CCATTCTGATGAATCTGAT-3’ (SEQ ID NO:3)。
[0045]2.2根据已经设计的RNA干扰靶序列，设计两端含Hpa I和Xho I酶切位点粘端的表达干扰序列的双链DNA oligo序列，设计结果如表1中SEQ ID NO:4_5序列所示:
[0046]表1两端含Hpa I和Xho I酶切位点粘端的双链DNA oligo序列
[0047]
【权利要求】
1.一种降低SPPl基因表达的小干扰RNA，包括正义链和反义链，所述正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于，所述小干扰RNA针对的SPPl基因上的RNA干扰靶序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种降低SPPI基因表达的shRNA，所述shRNA含有SEQ ID NO:1所示序列的正义链片段，SEQ ID NO:2所示序列的反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构。
4.一种SPPl基因干扰慢病毒载体，含有编码权利要求3所述降低SPPl基因表达的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA，并剪切获得如SEQ ID NO:1~2所示序列的siRNA。
5.一种SPPl基因干扰慢病毒，由权利要求4所述SPPl基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
6.一种SPPl基因突变型克隆载体，含有SPPl蛋白表达序列，其特征在于，所述突变型克隆载体的SPPl蛋白表达序列中含有突变的RNA干扰靶序列，并能编码RNAi target mRNA区第三个碱基同义突变的SPPl基因mRNA ;所述RNA干扰靶序列为权利要求1_2任一权利要求所述siRNA所针对的RNA干扰靶序列；所述RNAi target mRNA区为所述RNA干扰靶序列区段所对应并编码的mRNA。
7.如权利要求6所述突变型克隆载体，其特征在于，所述突变的RNA干扰靶序列如SEQID NO:4所示；所述RNA干扰祀序列如SEQ ID NO:3所示。
8.如权利要求6所述突变型克隆载体，其特征在于，所述突变型克隆载体含有SEQIDNO: 23所不SPPI蛋白表达序列。
9.权利要求1-2任一权利要求所述降低SPPl基因表达的小干扰RNA，权利要求3所述shRNA,权利要求4所述SPPl基因干扰慢病毒载体，权利要求5所述SPPl基因干扰慢病毒，及权利要求6-8任一权利要求所述突变型克隆载体在SPPl基因功能研究中的应用。
【文档编号】C12N15/867GK103509796SQ201310399709
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】曹跃琼, 朱向莹, 金杨晟 申请人:苏州吉凯基因科技有限公司