小麦TaAGO4a-D抗体、蛋白及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦TaAGO4a-D蛋白及其编码基因，其中，所述TaAGO4a-D蛋白为：（1）SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由（1）衍生的蛋白质。本发明还提供了小麦TaAGO4a-D抗原多肽和小麦TaAGO4a-D抗体。本发明还提供了所述TaAGO4a-D抗体的特异性。本发明在小麦中利用TaAGO4a-D抗体可以特异结合24nt的小分子RNA；在水稻中过表达TaAGO4a-D基因可明显增加转基因水稻对白叶枯病的抗性，可用于解决植株在由于细菌性病害白叶枯导致的产量减少等问题。
【专利说明】小麦TaAGCMa-D抗体、蛋白及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及小麦TaAGCMa-D抗体特异结合24nt小分子RNA的 应用，特别涉及小麦TaAGCMa-D蛋白及其编码基因在抗病工程中的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于杀菌剂的大量使用，尽管没有出现作物病害大面积爆发的局面，然而 过多依赖于农药，不仅增加了生产成本，而且还造成了大面积环境污染，严重威胁农业生态 安全。采用生物技术手段，克隆作物抗病基因并将其应用于作物抗病遗传育种是控制作物 病害流行最经济、安全、有效的方法。然而，由于抗病基因和无毒基因的互作表现为品种对 小种的专化抗性，植物抗病性常因病原菌群体生理小种的变化而被克服，有些抗病基因还 没有克隆到，其抗病性就由于病菌群体毒性的变化而丧失。由此可见，利用抗病基因培育抗 病品种也在不断面临新的挑战。人们转而开始筛选广谱、持久的抗病重要相关基因并培育 具有持久抗病性的作物品种。
[0003] ARGONAUTE (AGO)蛋白是小分子RNA介导的基因沉默路径的核心组成部分（Tang， siRNA and miRNA:an insight into RISCs, Trends Biochem Sci,2005,30:106-114)。 几乎所有的AGO蛋白都包含4个结构域：N末端、PAZ、MID (middle)和PIWI (Song and Joshua-Tor, Argonaute and RNA-getting into the groove, Curr Opin Struct Biol, 2006,16:5-11)，其中N末端在AGO蛋白间变化很大；PAZ结构域识别小分子RNA3'末端 (Linge1， Structure and nucleic-acid binding of the Drosophila Argonaute2PAZ domain，Nature，2003,426:465-469) ;PIWI结构域既可以切割靶位点的mRNA，也可以 以一种未知的机制启动翻译抑制（Rivas，Purified Argonaute2and an siRNA form recombinant human RISC，Nat Struct Mol Biol，2005,12:340-349)。AGO 蛋白在进化上 非常保守，根据其结构域的不同，分为两类：包括AGO亚家族和PIWI亚家族（Mallory and Vaucheret，RNAmediated chromatin-based silencing in plants，Curr Opin Cell Biol， 2010,21:367 - 376)，植物中的AGO蛋白均属于AGO亚家族。
[0004] 拟南芥中有 10 个 AGO 基因（Vaucheret，Plant ARG0NAUTES· Trends Plant Sci，2008,13:350-358)。其中，AGOl通过几个病原菌胁迫相关的miRNA参与PTI (Li, Identification of miRNAs involved in pathogen-associated molecular pattern-triggered plant innate immunity, Plant Physiol，2010,152:2222-2231)； AG02被Pst强烈诱导，而AG02突变体则削弱了其对细菌病原的免疫（Zhang，Arabidopsis Argonaute2Regulates Innate Immunity via miRNA393*_Mediated Silencing of a Golgi-Localized SNARE Gene， MEMB12,2011， Mol Cell42:356-366)。 AG04 则表现出 参与抗病的特异性，它不仅参与PAMP启动的基础抗性，同时参与抗病基因介导的小 种专化抗性，表现出在植物抗病过程中的重要作用（Agorio and Vera，ARG0NAUTE4is required for resistance to Pseudomonas syringae in Arabidopsis， Plant Cell， 2007,19:3778-3790;Bhattacharjee, Virus resistance induced by NB-LRR proteins involves Argonaute4~dependent translational control， Plant J，2009,58:940-951)〇 拟南芥ago4突变体对病原细菌Pseudomonas syringae DC3000高度敏感，并对致病菌株、 非致病菌株以及非寄主菌株的感病性均表现出显著提高（Agorio and Vei^ARGONAUTEMs required for resistance to Pseudomonas syringae in Arabidopsis，Plant Cell，2007， 19:3778-3790)，说明AG04基因是维持植物寄主抗性和非寄主抗性所必需。
[0005] 植物中有关AG04基因的研究主要在拟南芥（Agorio and Vera，ARG0NAUTE4is required for resistance to Pseudomonas syringae in Arabidopsis， Plant Cell， 2007,19:3778-3790;He,An effector of RNA-directed DNA methylation in arabidopsis is an ARG0NAUTE4-and RNA-binding protein， Cell，2009137:498-508)、水稻（Wu， DNAMethylation Mediated by a MicroRNA Pathway，Mol。611，2010,38:465-475)、烟草 (Jones,Virus-induced gene silencing of argonaute genes in Nicotiana benthamiana demonstrates that extensive systemic silencing requires Argonautel-Iike and Argonaute4-1 ike genes，Plant Physiol，2006,141:598-606;Bhattacharjee， Virus resistance induced by NB-LRR proteins involves Argonaute4~dependent translational control， Plant J，2009,58:940_951)、天竺葵（He， A Pelargonium ARG0NAUTE4gene shows organ-specific expression and differences in RNA and protein levels，J Plant Physiol，2010，167:319_325)等为数不多的植物中进 行。研究内容主要集中在AG04参与细菌（Agorio and Vera，ARG0NAUTE4is required for resistance to Pseudomonas syringae in Arabidopsis， Plant Cell，2007， 19:3778-3790)和病毒病害抗性（Jones，Virus-induced gene silencing of argonaute genes in Nicotiana benthamiana demonstrates that extensive systemic silencing requires Argonautel-Iike and Argonaute4-1 ike genes，Plant Physiol，2006， 141:598-606;Bhattacharjee，Virus resistance induced by NB-LRR proteins involves Argonaute4_dependent translational control，Plant J，2009,58:940_951) ;AG04 器官 特异性表达（He，A Pelargonium ARG0NAUTE4gene shows organ-specific expression and differences in RNA and protein levels，J Plant Physiol，2010，167:319_325)以及 AG04 蛋白在小分子 RNA 分拣（Wu，DNA Methylation Mediated by a MicroRNA Pathway， Mol Cell，2010,38:465-475)和 RNA 介导的 DNA 甲基化（RNA-directed DNA methylation， RdDM)中作用机制（He，An effector of RNA-directed DNA methylation in arabidopsis is an ARG0NAUTE4-and RNA-binding protein，Cell，2009137:498-508)研究方面。
[0006] RNA介导的DNA甲基化（RdDM)代表一类由小分子RNA驱动的影响基因表达的表 观遗传学调控机制。植物中，最丰富的小分子RNA是转座子和重复序列来源的siRNA，这 些siRNA与AG04蛋白结合，在其产生部位指导胞嘧啶甲基化（CG，CHG，和CHH，H代表A，C， 或者T)，并对其附近基因的表达进行调控（Cao and Jacobsen，Role of the arabidopsis DRM methyltransferase in de novo DNA methylation and gene silencing，Curr Biol， 2002,12:I138-1144;Matzke，RNAmediated chromatin-based silencing in plants，Curr 0口化〇61181〇1，2009,21:367 - 376)。水稻中由00^切割产生的1〇叫1^题六（11^1?離）也进 入AG04蛋白，并通过顺式或反式对其祀位点进行转录水平基因调控（Wu，DNA Methylation Mediated by a MicroRNA Pathway，Mol Cell，2010,38:465-475)。也有研究指出，一些典 型的miRNA基因也可以产生23-到27-nt siRNA，这些siRNA也被分拣入AG04并在它们的 作用革巴点以反式方式介导DNA甲基化（Chellappan，siRNAs from miRNA sites mediated DNA methylation of target genes, Nucleic Acid Res,2010,38:6883-6894)。
[0007] 然而迄今为止，作为RdDM路径核心组分的AG04所结合的小分子RNA及其介导 的DNA甲基化是否在抗病反应中发挥作用鲜有报道。最新研究发现，拟南芥RdDM路径 的另一组分RNA聚合酶Pol V的缺陷突变体中，水杨酸（salicylic acid, SA)介导的对 PsDC3000的防御增强，而茉莉酸（Jasmonic acid, JA)介导的对死体营养真菌的防御减 弱。染色质免疫沉淀分析表明，SA防御路径相关基因组蛋白修饰水平的变化为其基因表 达增强做准备，暗示了表观遗传调控路径在植物免疫调控中的可能作用（Lopez，The RNA silencing enzyme RNA polymerase V is required for plant immunity, PLoS Genet, 2011，7:el002434)。
[0008] AG04主要结合24nt的小分子RNA (siRNA)，而siRNA则表现出参与抗病的 特异性，它不仅参与PAMP启动的基础抗性，同时参与抗病基因介导的小种专化抗性， 表现出在植物抗病过程中的重要作用（Agorio and Vera, ARG0NAUTE4is required for resistance to Pseudomonas syringae in Arabidopsis, Plant Cell,2007, 19:3778-3790;Bhattacharjee, Virus resistance induced by NB-LRR proteins involves Argonaute4-dependent translational control, Plant J,2009,58:940-951)〇 拟南芥ago4突变体对病原细菌Pseudomonas syringae DC3000高度敏感，并表现出对致病 菌株、非致病菌株以及非寄主菌株的感病性均显著提高（Agorio and Vera，ARG0NAUTE4is required for resistance to Pseudomonas syringae in Arabidopsis, Plant Cell, 2007)，说明AG04基因是维持植物寄主抗性和非寄主抗性所必需。
[0009] 然而，在小麦中，TaAGCMa-D基因的应用，及其生物学功能并没有明确阐释。
【发明内容】
[0010] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种小麦TaAGCMa-D蛋白、其编码基 因及在植物抗病育种中的应用。
[0011] 本发明的另一目的是提供一种小麦TaAGCMa-D抗原多肽和小麦TaAGCMa-D抗体。
[0012] 为了实现上述目的，本发明提供了一种小麦TaAGCMa-D蛋白，所述蛋白为：
[0013] (I) SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0014] (2)SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 同等功能的由（1)衍生的蛋白质。
[0015] 本发明还提供了编码所述小麦TaAGCMa-D蛋白的基因 TaAGCMa-D，优选地，所述基 因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0016] 应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员 可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0017] 所述小麦TaAGCMa-D基因包含2751bp的开放阅读框架（SEQ ID No. 2)，TaAGCMa-D 蛋白含有916个氨基酸（SEQ ID No. 3)。
[0018] 本发明还提供了含有所述TaAGCMa-D基因的载体。
[0019] 优选地，所述载体为 pEASY-TlSimple-TaAG04a-D。
[0020] 本发明还提供了含有所述TaAGCMa-D基因的重组表达载体。
[0021] 优选地，所述含有TaAGCMa-D基因的重组表达载体为pCUbil390-TaAG04a_D。
[0022] 所述重组表达载体pCUbil390-TaAG04a_D的构建过程如下：
[0023] (1)以小麦叶片为材料，提取RNA并反转录获得cDNA，以cDNA为模板，以 TaAGCMa-DF 和 TaAGCMa-DR 为引物，进行 PCR ;
[0024] TaAG04a-DF ：ATCAGTTCAGCGGTTCGGCTCCTC (SEQ ID No. 4)
[0025] TaAG04a-DR ：GCGGCAACCAGCTTAGGAACACAAC(SEQ ID No. 5)；
[0026] (2)将PCR产物克隆连接到pEASY-TlSimple载体上，获得 pEASY-TlSimple-TaAG04a-D ；
[0027] (3)用 KpnI 和 SpeI 酶切 pEASY-TlSimple-TaAG04a_D，得到 TaAGCMa-D 片段，用 KpnI和SpeI酶切表达载体pCUbil390,得到载体片段，将酶切得到的两个片段连接，获得重 组表达载体 pCUbil390-TaAG04a-D。
[0028] 其中，步骤（1)中小麦材料优选为中国春小麦（Triticum aestivum L.)叶片。
[0029] 步骤（1)中PCR反应程序：95°C预变性10分钟；95°C变性30秒，56°C退火30秒， 72 °C延伸2分钟，重复35次；72 °C延伸10分钟。
[0030] 步骤（1)中PCR反应体系：
[0031] 2X Easy Taq PCR SuperMix 12.5 μ 1 ；
[0032] TaAG04a_DF (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0033] TaAG04a-DR (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0034] cDNA 模板 2 μ 1 ;
[0035] 双蒸水 补足25 μ 1。
[0036] 本发明还提供了含有所述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括重组菌， 如大肠杆菌、农杆菌等。
[0037] 本发明还提供了小麦TaAGCMa-D蛋白在提高植物抗病性中的应用。所述应用为将 小麦TaAGCMa-D基因或含有小麦TaAGCMa-D基因的重组表达载体导入植物中过表达小麦 TaAGCMa-D蛋白，使植物产生抗病性。
[0038] 优选地，所述的抗病为抗白叶枯病。
[0039] 优选地,所述植物为小麦和水稻。
[0040] 本发明还提供了小麦TaAGCMa-D抗原多肽，所述抗原多肽为：
[0041] (I) SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽；
[0042] (2)SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 同等功能的由（1)衍生的多肽。
[0043] 本发明还提供了小麦TaAGCMa-D抗体，所述的TaAGCMa-D抗体是根据TaAGCMa-D 基因编码的TaAGCMa-D蛋白N末端设计的特异针对TaAGCMa-D蛋白的多克隆抗体。
[0044] 优选地，所述TaAGCMa-D抗体是根据SEQ ID No. 1所示的小麦TaAGCMa-D抗原多 肽设计的特异针对TaAGCMa-D蛋白的多克隆抗体。
[0045] 本发明还提供了所述小麦TaAGCMa-D抗体特异结合24nt小分子RNA的应用。
[0046] 本发明还提供了 TaAGCMa-D抗体特异性的western结果、质谱测序结果和特异结 合24nt小分子的结果。
[0047] 本发明的有益效果如下：
[0048] 本发明在小麦中利用TaAGCMa-D抗体可以特异结合24nt的小分子RNA ;在水稻中 过表达TaAGCMa-D基因可明显增加转基因水稻对白叶枯病的抗性，可进一步用于解决植株 在由于细菌性病害白叶枯导致的产量减少等问题，对抗白叶枯病植物的培育和育种具有较 大的实际意义和广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0049] 图1为本发明实施例2中TaAGCMa-D抗体免疫沉淀银染检测图，其中，箭头表示 TaAGCMa-D 蛋白；
[0050] 图2为本发明实施例2中TaAGCMa-D抗体免疫沉淀的western blot检测图；
[0051] 图3为本发明实施例3中TaAGCMa-D抗体免疫沉淀特异条带的质谱分析结果，其 中，完整的蛋白序列为小麦TaAGCMa-D蛋白；标记部分为质谱检测到的肽段；
[0052] 图4为本发明实施例4中TaAGCMa-D抗体免疫沉淀的特异小分子分布；
[0053] 图5为本发明实施例5的植物表达载体pCUbi 1390图谱；
[0054] 图6为本发明实施例6的TaAGCMa-D基因增强水稻(成株期)对白叶枯病抗性的叶 片表型图；
[0055] 图7为本发明实施例7中各水稻转化植株接种白叶枯病原菌后的叶片枯斑长度与 叶片总长度的比值统计图。
【具体实施方式】
[0056] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0057] 若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若 未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0058] 本发明中涉及到的生物材料中国春小麦（Triticum aestivum L.)为公知公用品 种，参见 Szyroki，KATlis not essential for stomatal opening, 2001, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,98,2917-2921〇
[0059] 2 XEasy Taq PCR SuperMix、pEASY_TlSimple Cloning Kit 均购自北京全式金生 物技术有限公司。
[0060] 水稻空育131和植物表达载体pCUbil390及水稻转化方法均由中国农业科学院 作物科学研究所万建民课题组提供，具体参见Peng, A putative leucine-rich repeat receptor kinase, OsBRRl, is involved in rice blast resistance,2009,230:377-385。
[0061] 实施例ITaAGCMa-D基因编码区序列的获得
[0062] 以中国春小麦（Triticum aestivum L.)叶片为材料，提取RNA并反转录获得 cDNA，以cDNA为模板，以TaAGCMa-DF和TaAGCMa-DR为引物，进行PCR，获得小麦TaAGCMa-D 基因序列全长。
[0063] TaAGCMa-D基因全长的扩增引物序列：
[0064] TaAG04a-DF ：ATCAGTTCAGCGGTTCGGCTCCTC(SEQ ID No. 4)；
[0065] TaAG04a-DR :GCGGCAACCAGCTTAGGAACACAAC(SEQ ID No. 5)。
[0066] PCR反应程序：95°C预变性10分钟；95°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸2 分钟，重复35次；72 °C延伸10分钟。
[0067] PCR反应体系：
[0068] 2 X Easy Taq PCR SuperMix 12. 5 μ 1 ；
[0069] TaAG04a_DF (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0070] TaAG04a-DR (10 μ Μ) 1 μ 1 ；
[0071] cDNA 模板 2μ1;
[0072] 双蒸水 补足25 μ 1。
[0073] PCR产物切胶回收纯化后按照pEASY-TlSimple Cloning Kit克隆方法克隆连接到 pEASY-TlSimple载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序 筛选获得pEASY-TlSimple-TaAG04a-D，其中，TaAGCMa-D包含2751bp的开放阅读框架（SEQ ID No. 2)，其编码的TaAGCMa-D蛋白含有916个氨基酸残基（SEQ ID No. 3)。
[0074] 实施例 2TaAG04a_D western blot 检测
[0075] I、TaAGCMa-D 抗体的制备
[0076] 针对小麦TaAGCMa-D蛋白的N端序列，设计合适的肽段作为抗原，并进一步制备多 克隆抗体。所述抗原多肽序列为：MESHSDDLPPPPC(SEQ ID No. 1)，抗原多肽、多克隆抗兔血 清均在北京华大蛋白质研发中心有限公司合成。
[0077] 2、TaAGCMa-D 抗体的纯化
[0078] 多克隆抗体的纯化参考Thermo公司sulfolink coupling resin产品说明书进 行，具体方法如下：
[0079] 1)将 750 μ I sulfolink coupling gel 加入至 IOml 普通蛋白纯化柱（BI0-RAD 公 司产品）中，尽量避免产生气泡；
[0080] 2)将纯化柱底部小帽打开，使gel中的storage buffer流下；
[0081] 3)加入 10ml coupling buffer 平衡柱子，重复一次，其中，coupling buffer : 50mMTris-Hcl、5mM EDTA-Na (pH7. 5);
[0082] 4)用coupling buffer溶解抗原多肽，抗原多肽浓度：2. 0mg/ml，若抗原多肽难 溶，用DMSO溶解；
[0083] 5)抒紧纯化柱下部小帽，然后将Iml (称0· 002g溶于Iml coupling buffer中） 溶解的抗原多肽加入到上述平衡好的柱中，盖紧纯化柱上部小盖，室温下，用上下翻转混合 仪（rotator)旋转混合15min ;
[0084] 6)将上述柱子室温下放置30min，勿旋转；
[0085] 7)打开纯化柱上部小盖和下部小帽，使液体流下；
[0086] 8)加入 10ml coupling buffer 洗柱；
[0087] 9)用coupling buffer溶解半胱氨酸(浓度：15. 8mg/ml)，抒紧纯化柱下部小帽， 将2ml半胱氨酸溶液加入上述纯化柱中，盖好上部小盖；
[0088] 10)如步骤5)，上下混合15min，如步骤6)，室温放置30min ;
[0089] 11)打开纯化柱上部小盖和下部小帽，使液体流下；
[0090] 12)加入 10ml wash solution 平衡清洗柱，重复一次，wash solution : IM NaCl、 0.05%NaN3 ；
[0091] 13)待上述液体流下后，加入IOmllOmM Tris-Hcl (ρΗ7· 5)清洗柱，重复一次；
[0092] 14)在6mll0mM Tris-Hcl中加入4ml抗兔血清并混勻，4000rpm离心lOmin，去沉 淀；
[0093] 15)将上清加入到清洗好的纯化柱中，与gel混匀，4°C条件下，上下旋转混合 I. 5h ；
[0094] 16)打开纯化柱上部小盖和下部小帽使液体流下，并加入IOmllOmM Tris-Hcl (PH7.5)洗柱一次；
[0095] 17)用 wash buffer 洗柱一次，并使液体流下，wash buffer : IOmM Tris-Hcl (ρΗ7· 5)、500mM NaCl ;
[0096] 18)准备6个进口离心管，每管加入75 μ IlM Tris-Hcl (ρΗ8· 5)并依次放在离心 管架上；
[0097] 19)每次分别加入500 μ 150mM甘氨酸（ρΗ2. 5)，洗脱TaAGCMa-D抗体，共6次，分 别滴入上述准备好的6个离心管中；
[0098] 20)纯化好的TaAGCMa-D抗体于4 °C或-80°C保存。（柱子中加入IOml IOmM Tris-Hcl (pH7.5)，4°C保存，重复纯化从步骤13)开始）
[0099] 3、TaAGCMa-D 蛋白的纯化
[0100] 1)取20g左右的中国春小麦（Triticum aestivum L.)幼苗，液氮充分研磨，粉 末装入 50ml 管中，加入 20ml 预冷的 IP Buffer (50mM Tris-Cl pH7.5、150mM NaCUlOmM MgCl2、0. 1%ΝΡ-40 (乙基苯基聚乙二醇）、5mM DTT 和 1/5 片 complete，Mini，EDTA-free (购 自Roche公司）），冰上溶解；
[0101] 2)4°C 4, OOOrpm离心25min，上清转入15ml离心管中；
[0102] 3) 4°C 14, OOOrpm离心30min，上清转移至多个I. 5ml新管中；
[0103] 4)4°C 14, OOOrpm 离心 30min ;
[0104] 5)上清转移至15ml新管中，可取出少许测蛋白浓度；
[0105] 6)在上述上清液中加入30 μ I Protein A beads(使用前用IP Buffer平衡3次)， 在4°C垂直旋转Ih以去除非特异结合；
[0106] 7) 4°C 2, 000 Xg离心3min，小心吸取上清至新管中，加入纯化好的TaAGCMa-D抗体 (1:50)，4°C垂直旋转 2.5h ;
[0107] 8)加入 200 μ I Protein A beads (使用前用 IP Buffer 平衡 3 次)，4°C垂直旋转 Ih ;
[0108] 9)4°C 1500Xg 离心 3min，小心去上清；
[0109] 10) Beads用预冷的IP buffer洗三次，4°C 15min，共三次，最后一次将beads转移 至Ij I. 5ml的EP管中；
[0110] 11) 4°C 1，500rpm 离心 3min，去上清；
[0111] 12) Beads 取出 15μ 1 进行银染或 5μ 1 进行Western Blot 检测，其它 beads_80°C 保存以待用或进行竞争性洗脱。竞争性洗脱步骤：将TaAGCMa-D蛋白抗原多肽溶解在 cleavage buffer (50mM Tris-Cl pH7. 5U50mM NaClUOmM MgCl2^O. I%NP-40,5mM DTT) 中，浓度为lmg/ml，每次取30μ I加入30μ I beads中，4°C手指轻弹15min，1，500rpm离心 3min，将上清(约25 μ 1)移至新离心管中，重复三次，将三次上清混合(约75 μ 1)，取10 μ I 进行银染或2 μ 1进行Western Blot检测，剩余部分-80°C保存以待用。
[0112] 4、蛋白质的银染
[0113] 1)将IP beads或竞争下来的蛋白加入适量5XSDS蛋白上样缓冲液（312mM Tris-Cl ρΗ6· 8、4%SDS、25% 甘油（glycerol)、。· 004% 漠酌·蓝（bromphenol blue)), 100°C 6min 变性，短暂离心（1，300rpm 离心 5min)后于 8%SDS-PAGE 胶上电泳，120V，IOOmin ;
[0114] 2)将胶放入塑料容器内，加入50ml甲醛固定液（40%甲醇、60%水，0. 5%甲醛)，摇 20min ；
[0115] 3)弃固定液，水洗2次，每次5s ;
[0116] 4)将胶浸入 0· 2g/L Na2S2O3 溶液中，摇 Imin ;
[0117] 5)弃Na2S2O3溶液，水洗胶2次，每次5s ;
[0118] 6)倒去水，将胶浸入30ml0. 1%硝酸银(现用现配，避光保存）溶液中，摇lOmin，并 配显影液（3%Na2C03、0. 5% 甲醛、0· 004g/LNa2S203)，4°C保存；
[0119] 7)弃硝酸银溶液，水洗胶2次，每次5s ;加显影液；
[0120] 8) 10%乙酸终止反应，观察结果。
[0121] 5>Western blot
[0122] 1)蛋白电泳；
[0123] 2) PVDF膜用甲醇处理15sec，之后在I X转移缓冲液（IL :Tris5. 8g、甘氨酸2. 9g、 SDS0. 37g、甲醇200ml)中浸泡lmin，SDS-PAGE胶和吸水纸也在I X转移缓冲液浸泡Imin ;
[0124] 3)半干转移法转膜：在半干转移器上顺次放一张 Whatman滤纸、PVDF膜、胶及一张 Whatman 滤纸，15V 转 30min ;
[0125] 4)转膜结束后将膜取出并做标记，用I X TBST配制5%的脱脂奶粉溶液，将膜放入 其中，水平摇床上封闭Ih ;
[0126] 5)5%的脱脂奶粉溶液配制TaAGCMa-D抗体（1:1000)，将膜放入一抗中，室温结合 2h或4°C结合过夜；
[0127] 6) IX TBST 溶液洗 3 次，每次 IOmin ;
[0128] 7)5%的脱脂奶粉溶液配制山羊抗兔二抗（1:8000)，室温结合l_2h ;
[0129] 8) IX TBST 溶液洗 3 次，每次 IOmin ;
[0130] 9)加显影液（GE公司产品）显影3min，在暗室压X光片，并曝光洗片。
[0131] TaAGCMa-D抗体免疫沉淀银染检测图如图1所示，western blot检测图如图2所 /Jn 〇
[0132] 实施例3TaAG04a_D抗体免疫沉淀特异条带的质谱分析结果
[0133] 对TaAGCMa-D抗体免疫沉淀下来的特异条带进行质谱分析，结果如图3所示，与 TaAGCMa-D蛋白相匹配的肽段检测到了 14个，而且匹配上的肽段均是TaAGCMa-D特异的区 域，说明质谱检测到的肽段全部来自于TaAGCMa-D蛋白，确认其具有非常好的特异性。
[0134] 实施例4TaAG04a_D抗体免疫沉淀的特异小分子分布
[0135] 参考实施例2中的方法获得竞争洗脱液，参照TaKaRa公司的Trizol说明书步骤 提取TaAGCMa-D蛋白的纯化中Beads的RNA，利用PEG沉淀方法获取小麦中TaAGCMa-D抗体 结合的sRNA，具体的操作如下：
[0136] 1)用 DEPC 水将 RNA 定容到 308 μ 1，加入 70 μ 130% 的 PEG8000 ;
[0137] 2)再加入42 μ 15M NaCl，使其终浓度达到0. 5M ;
[0138] 3)混匀，在冰上放置 20min，4°C 13, OOOrpm 离心 20min ;
[0139] 4)取上清至一个无 RNase的I. 5ml离心管中，加入2. 5倍体积无水乙醇；
[0140] 5)-20°〇冰箱中放置3〇1]1；[11;13,000°0印1]1离心151]1；[11，弃上清 ；
[0141] 6)用70%的乙醇漂洗沉淀2遍，4°C 14, OOOrpm离心5min ;
[0142] 7)倒掉乙醇,将剩余乙醇吸干,室温干燥20min后,溶于30 μ 1无 RNase H2O中（可 以在60°C助溶，不要超过5min)。
[0143] 小分子RNA在华大基因科技服务有限公司测序，发现TaAGCMa-D抗体主要结合 24nt的小分子（图4)，其中Oh是指白粉菌接菌处理0h，12h是指白粉菌接菌后12h。由于 24nt的小分子在抗病中起重要作用，因此，表明TaAGCMa-D在抗病中也将起重要作用。
[0144] 实施例5TaAG04a_D植物表达载体
[0145] 将实施例1获得的测序正确的pEASY-TlSimple-TaAG04a_D，用KpnI和SpeI酶切 实施例1获得的测序正确的pEASY-TlSimple-TaAG04a-D，得到TaAGCMa-D片段，用KpnI和 SpeI 酶切表达载体 pCUbi 1390 (参见 Peng，A putative leucine-rich repeat receptor kinase， OsBRRl， is involved in rice blast resistance，2009,230:377_385)(图 5)， 得到载体片段，按照NEB公司的T4DNA连接酶的使用方法将酶切得到的两个片段连接， 将连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得重组表达载体 pCUbil390-TaAG04a-D。采用农杆菌介导法将得到的重组表达载体pCUbil390-TaAG04a-D 转化到水稻空育131中，得到水稻转化植株，筛选标记为潮霉素。
[0146] 实施例6TaAG04a_D增加水稻对白叶枯的抗性成株期
[0147] 将实施例5获得的水稻转化植株与对照(野生型水稻空育131)在大田中同 时一起培育，直至成株期。接种白叶枯病原菌，2周后，观察各水稻转化植株的叶片表 型。如图6所示，野生型水稻空育131为对照（CK)，1，2,3为3个水稻过表达株系，即为 pCUbil390-TaAG04a-D载体转化植株，图6显示pCUbil390-TaAG04a-D载体转化水稻，导致 成株期水稻对白叶枯的抗性增加。说明小麦TaAGCMa-D基因参与水稻抗病反应。
[0148] 实施例7统计结果显示：TaAG04a_D增加水稻成株期对白叶枯的抗性
[0149] 将实施例6获得水稻转化植株接种白叶枯病原菌后的叶片枯斑长度与叶片总长 度的比值进行统计，如图7所示，野生型水稻空育131为对照（CK)，1，2, 3为3个水稻过表 达株系（每个株系9个叶片），统计得到：白叶枯侵染比例分别为：CK，58% ;1，21% ;2,18% ;3， 9%。图7数据显示，转TaAGCMa-D基因水稻植株比对照植株的病斑比例明显减小，对白叶枯 抗性明显增加。图7结果显示小麦TaAGCMa-D基因的确增加水稻对白叶枯的抗性。
[0150] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【权利要求】
1. 小麦TaAG04a-D蛋白，其特征在于，所述蛋白为： (1) SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (2) SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等 功能的由（1)衍生的蛋白质。
2. 编码权利要求1所述蛋白的基因 TaAG04a-D。
3. 根据权利要求2所述的基因 TaAG04a-D，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
4. 含有权利要求2或3所述基因 TaAG04a-D的重组表达载体。
5. 根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为 pCUbil390-TaAG04a-D，其构建过程如下： (1) 以小麦叶片为材料，提取RNA并反转录获得cDNA，以cDNA为模板，以TaAG04a-DF 和TaAG04a-DR为引物，进行PCR ; TaAG04a-DF ：ATCAGTTCAGCGGTTCGGCTCCTC； TaAG04a-DR ：GCGGCAACCAGCTTAGGAACACAAC ； (2) 将PCR产物克隆连接到pEASY-TlSimple载体上，获得 pEASY-TlSimple-TaAG04a-D ； (3) 用 Kpnl 和 Spel 酶切 pEASY-TlSimple-TaAG04a-D，得到 TaAG04a-D 片段，用 Kpnl 和Spel酶切表达载体pCUbil390,得到载体片段，将酶切得到的两个片段连接，获得重组表 达载体 pCUbil390-TaAG04a-D。
6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，步骤（1)中PCR反应程序：95°C 预变性10分钟；95°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸2分钟，重复35次；72°C延伸10 分钟； 步骤（1)中PCR反应体系： 2X Easy Taq PCR SuperMix 12.5 u 1 ； TaAG04a-DF 1 u 1 ； TaAG04a-DR 1 u1 ； cDNA 模板 2 u 1 ; 双蒸水 补足25 ill。
7. 含有权利要求4-6任一项所述重组表达载体的宿主细胞。
8. 权利要求1所述小麦TaAG04a-D蛋白在提高植物抗病性中的应用，其特征在于，所 述应用为将权利要求2或3所述TaAG04a-D基因或将权利要求4-6任一项含有TaAG04a-D 基因的重组表达载体导入植物中过表达小麦TaAG04a-D蛋白，使植物产生抗病性。
9. 小麦TaAG04a-D抗原多肽，其特征在于，所述抗原多肽为： (1) SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的多肽； (2) SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等 功能的由（1)衍生的多肽。
10. 小麦TaAG04a-D抗体，其特征在于，所述抗体为根据权利要求9所述小麦 TaAG04a-D抗原多肽设计的特异针对小麦TaAG04a-D蛋白的多克隆抗体。
【文档编号】C12N1/21GK104418943SQ201310399749
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】毛龙, 李爱丽, 耿帅锋, 武亮 申请人:中国农业科学院作物科学研究所