一种海洋食品中gii型诺如病毒nasba检测引物、探针和检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种海洋食品中GII型诺如病毒NASBA检测引物、探针和检测方法，正向引物序列为SEQ?ID?NO1，反向引物序列为SEQ?ID?NO2，GII型诺如病毒检测用分子信标探针引物序列为SEQ?ID?NO3，检测方法，包括下列步骤：(一)GII诺如病毒标准cRNA的构建，(二)实时NASBA反应，(三)定性定量分析。本发明设计的引物和探针对GII诺如病毒的检测有高度的特异性，本发明的检测方法操作步骤简单，检测时间短，可以进行定性定量分析，特异性和灵敏度高。
【专利说明】—种海洋食品中Gl I型诺如病毒NASBA检测引物、探针和检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于实时核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-basedamplification, NASBA)技术的快速检测海洋食品中GII型诺如病毒技术。
【背景技术】
[0002]诺如病毒(NOTovirus，NVs)是一种存在于海洋食品中，又可导致成人和儿童急性胃肠炎的病毒。诺如病毒基因组是单股正链RNA，全长7642nt，包括3个开放阅读框(openreading frames, ORFs) 0RFsl、0RFs2和0RFs3。ORFsl编码保守的具有RNA多聚酶活性的非结构蛋白；0RFs2编码分子量约为56Kda的衣壳蛋白；0RFs3编码一种分子量约为22.5Kda的强碱性微小结构蛋白，部分区域与衣壳蛋白发生交互作用，共同形成衣壳。人们感染诺如病毒主要是通过接触污染的是食物和水源等引发感染，尤其是海洋食品是诺如病毒的重要污染源。尽管诺如病毒引起的急性胃肠炎症状(呕吐、腹泻和腹部痉挛等)呈自限性，但若治疗不及时仍会导致死亡，因此，一种简便快速、特异性强的检测海洋食品中诺如病毒方法，有利于提高我国海洋食品质量安全水平，也有利于保障消费者的身体健康。
[0003]诺如病毒根据其RNA多聚酶区(RDRP)和衣壳蛋白编码区核苷酸和氨基酸序列特征，可被分为5个遗传组(GGI~V)，其中G1、GII和GIV型可以感染人类。依据病毒部分衣壳及RNA聚合酶(RDRP)区序列的不同，GI又可分为14个基因型，GII分为17个基因型，GIV有I个基因型。20世纪90年代中期，研究人员确定GII型可以在世界范围内流行，直到现在，GII型NVs—直是世界范围内NVs最主要的感染性基因型。我国感染的诺如病毒也以GII为主，GGI及GGIV型较为罕见。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是:提供一种基于NASBA检测技术对GII型诺如病毒基因组具有特异性检测作用的引物和分子信标探针，同时提供一种快速、方便、实用的利用上述引物和分子信标探针检测GII型诺如病毒的NASBA检测方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
[0006]一种GII型诺如病毒检测引物，其特征在于:
[0007]正向引物序列为SEQ ID NOl:5’ -TGGAATTCCATCGCCCACT-3’ ；
[0008]反向引物序列为SEQ ID N02:
[0009]5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACAATTTCATCATCACCATA-3’。
[0010]一种GII型诺如病毒检测用分子信标探针，其特征在于，引物序列为SEQ ID N03:[0011 ] 5 ’ -FAM-CACGCCCTGTCCCCTGACATTATTCAGGCGCGTG-DABCYL-3，；
[0012]所述分子信标探针在5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。
[0013]一种定量检测GII型诺如病毒的方法，包括下列步骤:[0014](一)GII诺如病毒标准cRNA的构建
[0015]利用所述的引物，通过常规RT-PCR对GII诺如病毒扩增并优化，特异性产物片段大小为119bp ;然后分别进行目的片段的克隆、质粒提取、酶切线性化、体外转录与cRNA准确性验证、CopyRNA浓度的测定与拷贝数计算；将GII诺如病毒RAN进行10倍梯度稀释后，分装作为标准品于_80°C保存；
[0016](二)实时 NASBA 反应
[0017](I)对步骤(一)中保存的标准品共做9个梯度浓度的标准品cRNA，分别为IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1,10°拷贝；并提取待测样品中RNA，其中RNA的浓度为50_100ng/μ L；
[0018]反应体系如下:
【权利要求】
1.一种海洋食品中GII型诺如病毒检测引物，其特征在于: 正向引物序列为 SEQ ID NOl:5’ -TGGAATTCCATCGCCCACT-3’ ； 反向引物序列为SEQ ID N02: . 5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACAATTTCATCATCACCATA-3’。
2.一种海洋食品中GII型诺如病毒检测用分子信标探针，其特征在于，引物序列为SEQID N03:5’ -FAM-CACGCCCTGTCCCCTGACATTATTCAGGCGCGTG-DABCYL-3’ ； 所述分子信标探针在5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团DABCYL。
3.一种定量检测海洋食品中GII型诺如病毒的方法，包括下列步骤: (一)GII诺如病毒标准cRNA的构建 利用权利要求1所述的引物，通过常规RT-PCR对GII诺如病毒扩增并优化，特异性产物片段大小为U9bp ;然后分别进行目的片段的克隆、质粒提取、酶切线性化、体外转录与cRNA准确性验证、CopyRNA浓度的测定与拷贝数计算；将GII诺如病毒RAN进行10倍梯度稀释后，分装作为标准品于_80°C保存； (二 )实时NASBA反应 (1)对步骤(一)中保存的标准品共做9个梯度浓度的标准品cRNA，分别为108，107，.106，10104,101101,10°拷贝；并提取待测样品中RNA，其中RNA的浓度为50_100ng/μ L ； 反应体系如下:
【文档编号】C12Q1/70GK103525947SQ201310404375
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】周德庆, 赵峰, 马丽萍, 苏来金, 刘慧 , 姚琳, 孟松松 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所