基于组织因子的肿瘤核酸疫苗、制备方法及其应用的制作方法

基于组织因子的肿瘤核酸疫苗、制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于组织因子的肿瘤核酸疫苗，以质粒为载体，质粒中插入编码HBc的DNA序列，并在该序列中插入编码人源TF靶标表位多肽的DNA序列，人源TF靶标表位多肽序列见SEQIDNO：1，该多肽为人源TF的74-94位氨基酸；所述质粒载体的非编码区中含有ISS序列。还公开了肿瘤核酸疫苗的制备方法和应用。本发明通过基因工程手段，将一段选自TF的包含表位靶点序列作为抗原表位递呈到改建过的乙肝核心抗原上，构建抗原表位核酸疫苗，通过肌肉注射的方法给予机体，促使宿主细胞表达出含TF靶标表位的多肽，刺激机体产生主动免疫，从而获得对肿瘤的预防和治疗作用。
【专利说明】基于组织因子的肿瘤核酸疫苗、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种核酸疫苗、制备方法及其应用，尤其是一种肿瘤核酸疫苗、制备方法及其应用。【背景技术】
[0002]组织因子(tissue factor, TF)的凝血功能众所周知，它与活化凝血因子W (activated factor W, F Wa)结合后，形成TFPF YD a复合物,启动外源性凝血途径；亦可激活凝血因子XI，启动内源性凝血系统。它是机体内活性最强的促凝物质之一，在生理性止、凝血过程及多种血栓栓塞性疾病中发挥重要作用。然而，TF作为凝血系统中惟一在细胞表面表达的跨膜糖蛋白，是否具有受体特性并具备非凝血功能，逐渐成为众多学者关注的焦点。近期研究提示，TF具有信号传导受体的功能，可通过介导多种信号传导，影响肿瘤侵袭与转移、胚胎发育、血管新生、炎症、动脉粥样斑块形成等多种病理、生理过程。
[0003]以组织因子作为靶点来治疗肿瘤是现在肿瘤研究中的一个热点。最直接的优点就是靶向性好。正常的生理条件下，TF—般不外露，只有在肿瘤血管内皮和肿瘤细胞中才特异性表达升高。这就为肿瘤的靶向免疫治疗提供了可能。但是如果用TF全蛋白免疫，就很可能带来全身性的凝血功能障碍。
[0004]国外学者以组织因子为靶点，进行免疫治疗，最有成就的进展是HU和Garen将免疫球蛋白Gl (IgGl)的Fab段换作凝血因子VII (FVII)，即TF的天然配基，同时突变FVII的341密码子:从赖氨酸AAG突变为丙氨酸GCC，使二者结合以后的促凝活性部分丧失。结果发现具有良好的抗肿瘤作用。但是，他们以TF全蛋白作为靶点，用抗体或FVII进行治疗，存在着蛋白质结构复杂、工艺难度大、易引发机体过敏反应等缺点。
[0005]核酸疫苗是指将含有编码抗原蛋白目的基因的质粒载体直接注入体内，通过宿主细胞的转译系统表达目的抗原，并诱导机体产生免疫应答的一类新型疫苗。由于其在体内选择性表达目的产物，并将其以自然加工形式递呈给免疫识别系统，故兼具重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的双重性，与传统的疫苗相比具有免疫原性好、效果持久等特点。另外核酸疫苗可在工程菌中快速复制，制备提纯方法简便，大大降低了成本，已显示出巨大开发潜力和应用前景。
[0006]核酸疫苗DNA骨架中除包含有编码抗原基因的区域，在其质粒载体非编码区中还含有由未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)基元组成的免疫刺激序列(immunostimulatory sequences, ISS)。该ISS序列可作用于多种免疫活性细胞,增强非特异性免疫反应，激发淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞扩增、成熟和分泌多种细胞因子、趋化因子以及免疫球蛋白。由于具有免疫刺激作用，ISS序列作为在位疫苗佐剂可极大增强核酸疫苗被细胞摄取后针对目的抗原产生的体液免疫和细胞免疫，在核酸疫苗的开发中具有极大的应用前景。总之，核酸疫苗除可用于预防和治疗传染性疾病以外，为治疗自身免疫性疾病及肿瘤提供了新思路。
【发明内容】

[0007]本发明的目的是提供一种以组织因子为靶抗原表位的肿瘤核酸疫苗。
[0008]为达到上述目的，本发明采用的技术方案为:一种基于组织因子的肿瘤核酸疫苗，以质粒为载体，质粒中插入编码乙肝核心抗原(HBc)的DNA序列，并在该序列中插入编码人源TF靶标表位多肽的DNA序列，人源TF靶标表位多肽序列见SEQ ID NO:1，该多肽为人源TF的74-94位氨基酸；所述质粒载体的非编码区中含有ISS序列。
[0009]进一步的，所述编码人源TF靶标表位多肽DNA序列插入HBc的第80_81位氨基酸所对应的核苷酸序列中。
[0010]本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤核酸疫苗的制备方法，其步骤包括:分别合成编码人源TF靶标表位多肽序列、HBc序列和ISS序列的DNA，将这些DNA分步插入真核表达载体，构建重组质粒；转化大肠杆菌工程菌；经碱裂解法对发酵后工程菌中的质粒DNA进行粗提；粗提液经纯化，并用乙醇沉淀收集。
[0011]本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤核酸疫苗在制备预防和治疗黑色素瘤药物中的应用。
[0012]本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤核酸疫苗在制备预防和治疗乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或肺癌药物中的应用。
[0013]本发明通过基因工程手段，将一段选自TF的包含表位靶点序列作为抗原表位递呈到改建过的乙肝核心抗原上，构建抗原表位核酸疫苗，将重组质粒通过肌肉注射的方法直接免疫动物，通过宿主细胞的转译系统在机体内表达出表面呈现有TFTF靶标表位的重组HBc病毒样颗粒，激发机·体产生针对TF的特异性抗体。抗TF抗体能与体内肿瘤细胞及肿瘤内部血管内皮细胞表面的TF结合，一方面通过抗体介导的细胞杀伤毒性(ADCC)途径对肿瘤起到杀伤作用，另一方面抑制TF介导的血管新生。本肿瘤核酸疫苗从两个方面发挥作用，共同起到抗肿瘤的作用。所选取的TF表位靶点序列含有TF的主要B细胞表位。
【专利附图】

【附图说明】
[0014]图1:肿瘤核酸疫苗重组质粒pCR3.1-X8-HBC-TF的构建过程图。
[0015]图2:肿瘤核酸疫苗pCR3.l-X8-HBc-TF中的编码区HBc-TF的PCR鉴定结果图。其中1、2泳道为PCR扩增TF目的片段产物，3泳道为DNA marker, 4、5泳道为以T7启动子作为上游引物，M2作为下游引物，以重组pCR3.l-X8-HBc-TF质粒为模板的PCR产物。
[0016]图3 =Western blot检测图，肿瘤核酸疫苗pCR3.1-X8-HBC-TF转染细胞后特异性表达出HBc-TF融合蛋白。
[0017]图4 =ELISA测定结果图，显示肿瘤核酸疫苗pCR3.l-X8-HBc_TF能诱发小鼠产生抗TF抗体。
[0018]图5肿瘤核酸疫苗pCR3.1-X8-HBC-TF对小鼠黑色素瘤瘤重的抑制效果图。
[0019]图6病理组织切片图，检查肿瘤核酸疫苗pCR3.1-X8-HBC-TF对小鼠黑色素瘤的抑制效果。
【具体实施方式】
[0020]实施例一:真核表达载体pCR-X8_HBc Δ -TF的构建1.1真核表达载体PCR-X8-HBC Δ -TF的构建
1.1.1 TF目的基因的克隆 TF目的片断的基因克隆
设计上下游引物互为模板，经PCR的方法得到目的片断 TF
上游引物 TF-up: 5，- T GGT ACC GGT GAC TGG AAA TCC AM TGC TTC TAC ACT ACTGAC A-3’ ( SEQ ID NO:2)
下游引物 TF-down: 5，- AAA AAGC TTA ACC GGT TTC GTC AGT CAA GTC GTA TTC AGTGTC AGT AGT GTA GAA GCA T_3’ ( SEQ ID NO:3)
上下游引物均含有限制性核酸内切酶AgeI位点(阴影部分表示)
PCR反应体系:
IOXPFU PCR buffer10 μl
TF cDNA2 μl
10XPFU PCR buffer10 μ l
上游引物8 μ l
下游引物8 μl
dNTP8 μ l
PFU DNA Polymerase1 μ l
ddH2063 μ l 总计100 μl
设定PCR反应条件:
Group 1: 94 0C 2 min Group 2: 94 0C 30 sec 60 0C 30 sec 72 0C 2 min Group 2进行30个循环后进入Group3 Group3: 72 0C 10 min
PCR结束后，取5 41用1.7%琼脂糖凝胶电泳，100V，30 min后在紫外灯下观察电泳结果:在80 bp左右处有一条明显的DNA条带。PCR产物用上海华舜生物工程有限公司的PCR产物回收试剂盒进行DNA回收，就可获取TF目的基因序列。
[0021 ]质粒 pCR-X8_HBc Δ -TF 的构建
采用碱裂解法对PCR-XS-HBc Δ质粒分别进行抽提，抽提得到的质粒用AgeI进行酶切。
[0022]酶切体系:
Buffer O5 M-1
pCR-X8-HBc30 μ?
AgeI2 μ?
ddH2013 μ?
总计50 μ?
37 °C 反应 4 h0[0023]酶切产物经PCR产物纯化试剂盒回收，并经1.7% agarose gel电泳检测，确证pCR-X8-HBc产物已高效回收。
[0024]将上述酶切回收后得到的TF DNA片段和pCR_X8-HBc质粒片段分别进行连接。
[0025]连接反应体系:
T4 ligase BufferI M-1
pCR-X8-HBc4 μ?
TF4 μ?
T4 ligaseI M-1
总计10 μ?
4°C连接过夜，所得连接产物为pCR-X8-HBc Δ -TF质粒。
[0026]制备疋coli DH-5a感受态细胞，用上述连接液进行转化，将转化后涂布的平板上出现的抗Amp的阳性克隆命名为pCR-X8-HBc-TF，采用碱法抽提质粒后，采用PCR筛选挑选出阳性克隆。以T7启动子作为上游引物，M2作为下游引物，以抽提的重组子质粒为模板，进行PCR筛选，若目的基因正确插入应扩增得到300bp左右的PCR产物。经agarosegel电泳检测，在320bp左右出现一亮带，结果如图2所示。表明TF-9基因片段已成功正向地插入到真核表达质粒载体PCR-HBcA的AgeI酶切位点中。测序结果表明在构建的质粒pCR-HBc-TF中含有与设计序列完全符合的TF基因序列。
[0027]阳性克隆送上海博亚生物技术有限公司进一步测序验证。
[0028]实施例二:TF抗体的ELISA检测和Western blot检测
2.1材料
2.1.1实验动物
C57/BL6纯系小鼠，雌性，6 - 8周龄，免疫前平均体重为16.8g，购自扬州大学实验动物中心。
[0029]实验药物
重组核酸疫苗HBc Λ-TF。
[0030]材料及试剂
纯化的重组蛋白VEGF-TFh，VEGF-TFM，VEGF-PVH，VEGF-PVM。具体试验操作同前。
[0031]材料及试剂
纯化的重组蛋白VEGF-TF，VEGF-PV。具体试验操作同前。
[0032]方法
2.2.1免疫方案
选用C57BL/6J雌性小鼠，随机分组，每组10只，分别为生理盐水对照组，质粒载体对照组，pCR-X8_HBc Δ -TF组。核酸疫苗或对照质粒以灭菌生理盐水配成0.5 μδ/μ1，每次在每只小鼠两后肢股四头肌处分多点各注射100 μ? DNA溶液，即接种量为每只小鼠每次100 μδDNA。生理盐水对照组在每只小鼠两后肢股四头肌处分多点各注射100 μ?生理盐水。
[0033]免疫程序为O周、2周和4周各免疫一次，每次免疫时接种方法及剂量相同。自第2周至第8周的10周内每隔2周取血一次，共取血4次，采用眼眶内眦取血，每次血量为0.5-0.8 ml，离心取血清，_20°C冷冻保存备用。
[0034]抗TF 抗体的 Western blot 检测将预染蛋白质分子量Marker、纯化的VEGF-TF (不含DTT)，纯化的VEGF-TF (含DTT)用15% SDS-PAGE分离后，在含甲醇的转移缓冲液中以30V电压过夜转移至硝酸纤维素膜上。转移后将膜放置于室温下用含5%BSA的TTBS溶液摇动封闭2 h后，加入以含5%BSA的TTBS溶液稀释20倍的各组小鼠血清进行杂交，37°C摇动杂交I h。以TTBS摇动洗涤膜4次，每次15 min。洗涤后，加入1:200稀释的、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG 二抗，37°C作用I h。再以TTBS洗涤4次后，加入显色液(10 ml底物液中加入10 μ? 30% H2O2),直至出现明显条带后，用蒸馏水冲洗膜以终止反应。膜晾干后扫描保存。[0035]Western blot结果如图3所示，pCR-X8-HBc_TF免疫后的鼠源TF抗体可以分别和膜上 VEGF-TF (h)蛋白质带(泳道 1，2) ,VEGF - TF Cm)(泳道 4，5), VEGF-PVM (泳道 6，7)杂交，但是与VEGF - PVH没有杂交带(泳道3)，这说明了人源的TF20肽诱导的抗体能识别鼠源TF，这直接说明能在小鼠中进行抗肿瘤实验。
[0036]抗体的ELISA检测
96孔酶标板，每孔中加入100 μ? VEGF-TF溶液(溶于包被稀释液，I Pg/^1)，4°C包被过夜。弃去包被液，加入5% BSA(pH 7.4 PBS配制)封闭液，4°C满孔封闭过夜。弃去封闭液，每孔加入5%BSA封闭液稀释的、稀释倍数为1:100的小鼠血清100 μ1，37?孵育I h。弃去血清，每孔用PBST满孔洗涤，每次3 min,共洗涤6次。洗涤后，每孔加入用5% BSA封闭液稀释、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG 二抗(武汉博士德公司产品)100 μ?，稀释倍数为1:20000，37°C孵育I h。弃去二抗液，每孔用PBST满孔洗涤，每次3 min，共洗涤6次。洗涤后，每孔加入100 μ?底物液(由底物液A和B等体积配置)。37V反应30 min,加入2 mo I/L H2SOj*止反应，用酶标仪测定每孔的A45tol。
[0037]ELISA检测结果判断:标本A45tlnm≥0.1，而且标本A45tol至少为阴性对照A45tol两倍数值的为阳性，否则为阴性。阴性对照A45tlnm低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际A45tol计算。
[0038]检测结果如图4所示，小鼠给予pCR-X8-HBc_TF后，与生理盐水组和质粒载体对照组相比，疫苗在第一次取血(第二次免疫前)所得血清中抗TF的抗体水平很低，几乎检测不到。从第4周开始(第二次免疫后)就可以在该组的小鼠血清中检测到抗TF的抗体(ttest，P〈0.05)，该特异性抗体含量逐渐增加，第8周(第三次免疫后两周)抗体滴度达到峰值，抗体可以维持到第10周以上。
[0039]实施例三:重组TF亚单位抗原表位核酸疫苗抗肿瘤作用研究
3.1肿瘤细胞培养及移植性肿瘤模型制备
3.1.1材料
B16-F10购自中科院细胞所，RPMI1640和DMEM培养基购自JIBCOL公司，C57/BL6小鼠购自扬州大学比较医学中心。
[0040]细胞培养与移植
B16-F10是C57/BL6背景的高转移性黑色素瘤株，也是贴壁生长的细胞，培养液为含10%小牛血清的DMEM培养基，将其接种于培养瓶中。5%C02条件下培养，细胞长成连续单层时，小心倾去培养基，用D-HANKS溶液轻轻荡洗后，倾去D-HANKS溶液，加入0.125%胰酶消化。倾去胰酶，立刻加入10%小牛血清的1640培养基终止消化，用生理盐水轻轻洗净残存培养基，用吸管仔细吹打，完全分散细胞后进行细胞计数。按5xl07个/只接种于小鼠背部皮下。整个实验过程从开始消化到接种入C57/BL6小鼠体内，得到荷瘤鼠。为保证细胞活力，从消化细胞到接种入体内，不要超过15 min。10天后，荷瘤鼠的瘤重达到Ig左右，处死动物，无菌条件下取瘤块，除去坏死组织，将数个瘤块混合，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水调整成1:3-1:4的瘤细胞悬液。容器置冰块上，用空针筒抽吸，混匀后，接种于C57/BL6小鼠右侧腋下，每只动物接种0.2 ml整个试验在20min内完成。
[0041]肿瘤接种后10天后处死动物，分离肿瘤组织块称重，统计相关数据。
[0042]重组TF疫苗抗B16-F10黑色素瘤作用研究
雄性C57/BL6小鼠70只，体重14-16g，随机分为3组:1.NS (im, 100 μ l/只)2.pCR-X8-HBc (im, 100 μ g/ 只)，3.pCR-X8-HBc-TF 组(im, 100 μ g/ 只)。
[0043]各组动物按预定免疫方案免疫八周，接种B16-F10肿瘤，14天后处死，称取瘤重，放入10%甲醛固定7天后，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜观察肿瘤浸润侵袭以及血管生成等情况。
[0044]处死动物，分离肿瘤时同样发现:与对照组相比，pCR-X8-HBc-TFm组的肿瘤边缘清楚，包膜完整，而对照组未见到完整包膜。肿瘤重量统计表明，pCR-X8-HBc-TFm免疫后，可以降低B16F10肿瘤的瘤重，抑瘤率为29.4%。如图5所示。
[0045]B16-F10病理切片结果:在黑色素B16F10细胞移植瘤模型中，NS和pCR-X8_HBc组:皮下组织内肿瘤细胞呈巢团状，瘤体内有少许出血坏死，瘤体内血管生长旺盛，肿瘤细胞生长活跃，并明显向肌肉内及周边脂肪组织内浸润，肿瘤与肌肉分界不清。pCR-X8-HBc-TF组:皮下组织内瘤体中央及周边肿瘤细胞出现明显出血坏死，个别瘤体内肿瘤细胞大量坏死，仅残留血管。肿瘤与肌肉分界清楚，未见肿瘤细胞明显浸润肌肉组织。如图6所示。
[0046]多肽疫苗与核酸疫苗的差异比较:
一、抗体生成的差异:
疫苗的免疫程序为O周、2周和4周各免疫一次。核酸疫苗或对照质粒以灭菌生理盐水配成0.5 μ8/μ1，每次在每只小鼠两后肢股四头肌处分多点各注射100 μ? DNA溶液，即接种量为每只小鼠每次100 μg DNA。多肽疫苗溶与灭菌生理盐水配成Ιμ8/μ1，与等体积弗氏佐剂混匀后，每只小鼠腹股沟皮下注射100 μ?，即每只动物50 μg蛋白。初次给药选取弗氏完全佐剂，后续免疫选取弗氏不完全佐剂。
[0047]检测结果显示，小鼠第一次给予核酸疫苗后，所得血清中抗TF的抗体水平很低，几乎检测不到。从第3周以后可以在该组的小鼠血清中检测到抗TF的抗体(t test，P〈0.01)，该特异性抗体含量逐渐增加，第8周(第三次免疫后两周)抗体滴度达到峰值，抗体可以维持到第10周以上。而多肽疫苗免疫后，从第二周就可以在血中检测到抗体，六周左右达峰，且抗体水平较核酸疫苗免疫组要高(t test，P〈0.05)。
[0048]核酸和蛋白两种疫苗产生抗体时间上有区别，核酸疫苗的抗体峰值要晚于多肽疫苗，我们认为可能有如下原因:1.核酸疫苗需要转染入真核细胞，在体内表达出HBcAg-TF重组蛋白才能致敏动物，时间上肯定存在滞后，多肽疫苗则不存在这个问题；并且皮下注射后就能在局部短时间聚集大量抗原，更容易产生强烈的免疫反应，所以产生抗体早于核酸疫苗；2.以往的研究表明CpG序列可以直接抑制Thl细胞特异性转录因子T-bet的表达，在促进免疫类型向细胞免疫转变的过程中抑制B细胞中IgGl和IgE的产生，核酸疫苗pCR-X8-HBc-TF序列中存在多个CpG序列，有可能正是因为上述两种原因，才促成核酸疫苗免疫后,抗体达到峰值后血清中的IgG总体水平低于多肽疫苗。
[0049]二、治疗效果的差异:
以瘤重作为评价指标，核酸疫苗对瘤重的抑制率在30%左右，而多肽疫苗的抑制率在50%以上。
[0050]三、工艺和成本的差异
核酸疫苗只需提取质粒进行注射，且质粒生成量大；多肽疫苗必须表达出可溶性蛋白，避免大量包涵体形成，提取纯化时去内毒素更困难，产量低，所以工艺复杂，成本较高。
[0051]四、可能的副作用
理论上而言，多肽疫苗更容易引起机体过敏反应，严重时可能影响呼吸和循环甚至致死。而核酸疫苗的分子结构决定了它更安全。
【权利要求】
1.一种基于组织因子的肿瘤核酸疫苗，以质粒为载体，质粒中插入编码HBc的DNA序列，并在该序列中插入编码人源TF靶标表位多肽的DNA序列，人源TF靶标表位多肽序列见SEQ ID NO:1，该多肽为人源TF的74-94位氨基酸；所述质粒载体的非编码区中含有ISS序列。
2.根据权利要求1所述的肿瘤核酸疫苗，其特征在于:所述编码人源TF靶标表位多肽DNA序列插入HBc的第80-81位氨基酸所对应的核苷酸序列中。
3.权利要求1或2所述的基于组织因子的肿瘤核酸疫苗的制备方法，其步骤包括:分别合成编码人源TF靶标表位多肽序列、HBc序列和ISS序列的DNA，将这些DNA分步插入真核表达载体，构建重组质粒；转化大肠杆菌工程菌；经碱裂解法对发酵后工程菌中的质粒DNA进行粗提；粗提液经纯化，并用乙醇沉淀收集。
4.权利要求1或2所述的基于组织因子的肿瘤核酸疫苗在制备预防和治疗黑色素瘤药物中的应用。
5.权利要求1或2所述的基于组织因子的肿瘤核酸疫苗在制备预防和治疗乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或肺癌药物中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK103566378SQ201310405991
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年9月9日 优先权日:2013年9月9日
【发明者】刘文涛, 吴雪丰, 徐礼友, 杨政 申请人:南京海智生物工程有限公司